Výzkum fibrinolýza

Pro klinik je nesmírně důležitá jako identifikace zvýšení fibrinolytickou aktivitu krve, a jeho redukce, , které může být způsobeno buď velká spotřeba aktivátorů plazminogenu, a když aktivace a fixace v parta, a trombů, buď zvýšit antiplazminovoy antiaktivatornoy a aktivitu plazmy. To by mělo být vždy na paměti,, že intenzivní fibrinolýza ve svazcích a tromby, zjistitelné ke zlepšení obsahu FDP v plazmě, logicky v kombinaci s aktivátory snižování a rezervní plazminogenu v plazmě (cirkulující krve).

Stav přírodního sraženin lýzy

Přehled o stavu přírodního sraženiny lýzou může poskytnout způsob Kotovshchikova-Kuźnik úpravu v. P. Baluda nebo modifikace E. P. Ivanova.

Principem metody je, že s ohledem na hematokrit, a červená obsah buněk krve je určena počtem poslední, vypadl ze svazku v ložisku po určitou dobu inkubace. Tím, zvýšení objemu krve fibrinolytické aktivity této frakce (třetí) zvýšená erytrocytů. V případě hluboké-antikoagulace a hypofibrinogenemia, které produkují vadné a volnější svazky, Tyto metody mohou vést k zavádějícím výsledky.

Při postupu modifikace Bidwell D. IN. Andreenko fibrinolýza hodnocena ztrátou sraženin fibrinu.

Tyto studie fibrinolytická aktivita euglobulin frakce plazmy

Výzkumné fibrinolytická aktivita euglobulin frakce plasmy je nejdůležitější základní test, což potvrzuje Komise Evropské společnosti pro trombózu.

Chcete-li to provést, použít buď klasické metody stanovení euglobulin sraženin lýze, definice lytické aktivity frakce euglobulin na fibrinu deskách (v tomto druhém případě, účinek různých množství fibrinu testovacích hodnot vyrovnán). Lýza v těchto testech je kvůli, ve frakci euglobulin byl izolován a aktivátory plasminogenu, vzhledem k tomu, inhibitorů fibrinolýzy, většina vypouští. Proto, s použitím zkoušky naměřené euglobulin Plazmatické hladiny aktivátory plazminogenu a.

Při přípravě krve pod bazálního metabolismu, T. to je. ráno na lačný žaludek, Před zvednutím pacienta z postele, aktivátor tkáňového plasminogenu v krvi, je téměř žádné. Proto, v takových podmínkách je primárně určen pro vnitřní stav (správné krevní) Aktivace plazminogenu.

Tento proces může být značně urychlen předběžným kontaktní aktivace faktorů Xlla-kallikrein-kininogen VM kaolinu, což vede ke snížení euglobulin lyži s 2,5-3hodina až 2-10minuty. Aktivace kontakt Tento princip je založen metody pro stanovení XII-závislý fibrinolýza.

Schopnost vaskulárního endoteliálního secernován do krevního řečiště vnější aktivační fibrinolýzy (tkáňového typu aktivátor, Bridging Digital Divide) Odhaduje se, k urychlení euglobulin lyži po komprimaci plavidla manžetu z jednotky pro měření krevního tlaku (ochutnat Oyvina-Chekalinoy), nebo po dávkované fyzické zátěže na ergometru cyklu, nebo farmakologické stimulace (vasopresinu deriváty - desmopresin nebo adiuretinom).

V literatuře, mnoho modifikací těchto technik.

Tak, např, během tlaková zkouška na klasickou techniku tlak v manžetě je udržován na 10,7 kPa (80 mm Hg. Art.) nebo 1,3 kPa (10 mm Hg. Art.) vyšší diastolický 15-20 minut, a v novější modifikace testu v. P. Ball - 3 min při kompresi 1,3 kPa (10 mm Hg. Art.) vyšší systolický krevní tlak. V obou případech, podruhé pro studium krve odebraných od sevřeného nádoby k odstranění manžety.

U těchto vzorků může být studován účinek komprese nejen fibrinolýza, a další Antitrombinové vlastnosti cévních stěn (antikoagulační, antiaggregant a tak dále.).

Zátěžové testy standardizovaným způsobem, do normálního euglobulin Lýza zrychlil 2 nebo vícekrát (ne dělat výzkum v bazálního metabolismu vede k velmi velké náhodných chyb, Proto pacient před studie začala v dopoledních hodinách by se neměla dostat z postele, napíchnutí žíly by měly být prováděny v domě).

Oslabení reakce na stlačení zatížení nebo ukazují na nedostatek reaktivity fibrinolytického systému a zvýšené riziko trombogenní, ověřeno, že počet studií.

Obsah plasminogenu v plazmě

Obsah plasminogenu v plazmě To může být semi-kvantitativně hodnotí přidáním konkrétní dávku euglobulin frakce streptokinázy. V souladu s postupem Slobozhankinoy - Fedorova, zvoleno tak, aktivita streptokinázu, který poskytuje lyže euglobulin pro 9-11minuta, Nicméně, je možné použít velké koncentrace (standardní hodnoty jsou zobrazeny v každé laboratoři zvlášť). Při nedostatku plazminogenu lyzačního času v tomto testu je rozšířena na více, menší je tato proenzym.

Studie sraženina Lýze plazma

Paralelní studie sraženin lýzového plazmy se stejným způsobem, při stimulaci streptokinázy umožňuje rozdíly vyplývající údaje pro odhad aktivity antiplazminu v testovacím plazmě, protože frakce euglobulin -antiplasmin prakticky žádný, a koaguluje v plné plazmy, že má.

Částka je vypočtena ve výši antiplazminu

(Plc SAND)/SAND;

kde PLC - plazma sraženina lýzy čas v přítomnosti streptokinázy,

EPS - euglobulin sraženina lýzy čas v přítomnosti stejné dávce streptokinázy.

Další, S použitím tohoto faktoru, antiplazmin aktivita se stanoví jako procentuální podíl předběžném zředění křivky sestavují (získá ve směsných vzorků normální krevní plazmy).

Přesněji řečeno, přesto snadno implementovat výzkumné metody fibrinolýza rozdělením azofibrina, představuje složené fibrin, kovalentně svyazannogo s hromogennыm substratom (azopeptidom)

Principem metody je, že tři trubky pipetovací 10 mg azofibrina, smísí s pufrem (pH 7,4), pak dva z nich napipetujte 0,15 ml krevní plazmy a dále studovány v jedné z těchto trubek - 10000 U / ml streptokinázy.

Po inkubaci 1 h, byl roztok zfiltrován a fotometrické spektrofotometru při vlnové délce 440 nm nebo lékařské kolorimetr na modré světlo filtru.

Plazmin účinnost se stanoví plazmy ve vzorku bez streptokináza Změna optické hustoty filtrátu ve srovnání s obsahem třetích trubek, a plazmatické hladiny plasminogenu - ve vzorku s streptokináza. Inkubace plasminu a studium plazmy na stejném substrátu určí antiplazminovaya aktivita. Benchmarky, získané ve studiích normální plazmě, přijaty 100 %.

Tak, s pomocí relativně malý soubor jednoduchých laboratorních-funkční metody mohou získat představu o stavu různých mechanismů fibrinolýzy, Obsah v plazmě a uvolněny z cévní stěny plazminogenu, jeho aktivátory a inhibitory.

Podobně jako při studiu srážení krve, Tyto údaje mohou být významně doplnit imunologické stanovení složek fibrinolýzy systému a produktů degradace fibrinogenu a fibrinu.

Metody pro detekci "svědků" a molekulárních markerů intravaskulární koagulace a fibrinolýzy

V procesu intravaskulární koagulace a fibrinolýza spojena intenzivní dochází, jedna strana, spotřeba a více nebo méně výrazné snížení v krvi některé složky hemostatického systému, na druhé straně - vzhledu dílů, fragmenty a metabolity, , které v normální plazmě, neobsahuje ani malé množství.

Identifikace těchto "svědky", a markery aktivace intravaskulární koagulace a fibrinolýzy je s velkou diagnostickou hodnotu v diseminované intravaskulární koagulace, tromboembolické nemoci různého původu a mikrotrombovaskulitah (infekční, Imunní, nádor atd.. d.).

Spotřeba Značky a aktivace krevních destiček hemostáze

Pro spotřebu a aktivačních markerů destiček hemostáza jsou trombocytopenie, zvyšování plazmatické komponenty granulí - antigeparinovogo faktor 4 Destiček, (3-thromboglobulin a kol., jakož i zachování funkčního oběhu méně aktivní a méně agregace krevních destiček.

Klíčové markery poškození a funkční postižení endotelu cév - zvýšení plazmatické hladiny von Willebrandova faktoru, relaxace odpověď euglobulin lyzačních plavidel během komprese manžetou, tělesné cvičení nebo podání vasopresinu analogů.

Hyperkoagulační

Hyperkoagulační, Pokud je k dispozici, může znamenat aktivaci srážení krve. Ona odhalila obecnými koagulační testy a zobrazovacích studií (Tromboelastografie), a klinika - na základě obtížné získat krev z žíly - trombózu obou plic nádobě, a jehla, a neúplné stabilizaci krve mícháním s citrátem (Vzdělávání v makru vitro- a microclots).

Tento částečně sražená krev je zcela nevhodný pro další studium hemostatické systému, tak se určitě odstředí krve by měly být kontrolovány, zda se sráží. V přítomnosti krevních sraženin není předmětem dalšího studia (ale může být použit pro přípravu séra a řadu biochemických analýz). Zkušenosti ukazují, to není dost dodržování tohoto doporučení je často zdrojem vážných chyb ve studiu hemostatické systému.

Hyperkoagulační v některých testech ještě žádný důkaz o nebezpečí trombogenní. Mimoto, Velký počet trombofilie, , které se vyznačují tím, počáteční hypo-, místo toho hyperkoagulabilita. Patří mezi ně trombofilie, vyvolávány nedostatkem faktoru XII, prekallikrein a kininogen VM, disfibrinogenemiyami, deficience proteinu C, atd. d. Srážení prakticky beze změny v náchylnosti k trombóze v důsledku zvýšené indexu hematokritu (často zatímco tam hypocoagulation), trombocytémie, inferiority fibrinolýzy, a tak. d.

Na základě důvodů uvedených, nelze srovnávat s hyperkoagulačního a trombogenního rizika, přičemž funkce je v současné době mezi stigmat trombofilie nejsou zahrnuty.

Aktivace "mostu" mezi faktory XII kallikrein a Faktoru VII

Aktivace "mostu" mezi faktory XII kallikrein a Faktoru VII, , která je rozpoznávána zkoumáním protrombinový čas s hovězím tromboplastinu a po ochlazení na studiu krevní plazma pro 18 až 24 hodin při teplotě 4 ° C (aktivace za studena Zkouška). V řadě trombofilie po ochlazení pozorované snížení protrombinového času 25-50 %. Ostatní thromboplastin, s výjimkou skotu, pro tuto studii jsou nevhodné.

Přítomnost v plazmě volné peptidové A

Přítomnost v plazmě volné peptidové A, detekovány imunologickými metodami, Je to přímý důkaz thrombinemia, v prvé řadě proto, že trombin odštěpuje z molekuly fibrinogenu peptidů. Technika omezené dostupnosti kvůli potížím při získávání imunitní sérum anti-A.

Kromě, zvýšení plazmatických peptidu obvykle přechodné, protože je rychle eliminován z oběhové soustavy jednojaderných fagocytů. V tomto ohledu, pouze tehdy, když je úroveň peptidu informativní zvýšení, který je spolehlivý známkou přítomnosti aktivního trombinu v krvi.

Stratifikace a vytvoření kaluže fibrinogenu v monomerní komplexech plazma rozpustného fibrinu (RFMK)

U zdravých lidí, vlastnosti fibrinogenu, Elektroforetická pohyblivost a citlivost na trombin, zcela koaguluje v testu trombinu přidáním 12-14 sekund trombinu.

Naproti tomu, když aktivace intravaskulární srážení (trombinemii) a fibrinolýza vyskytují bundle fibrinogenové bazén, Vzdělávání SfmC, Vazba fibrinogenu (Uzamčené fibrinogen), a, možná, časný produkt fibrinolýzy (fragmenty X a V), a časné a pozdní FDP svobodný stát. SfmC a související fibrinogenu nebo trombin ovlivněno koagulovány (zůstal v séru), nebo koagulovat pomalu a to pouze, když jsou vystaveny vysokým koncentracím trombinu (3-sekundy). Pro detekci plazmatické a sérové ​​SfmC a dalších inertních složek fibrinogenu bazén, následující testy paracoagulation.

Beta-test naftolovyj

Beta-test naftolovyj (dřívější název - definice fibrinogenu B) nedostatečně specifický, takže nyní zřídka použitý.

Jeho podstata spočívá v tom,, že se krevní plazma roztoku se přidá β-naftolu v 50 % ethanol (5 klesne na 1 ml). Je-li po 10 min za třepání, se vysráží ve formě hrubých vloček, Vzorek se považuje za pozitivní.

Ethanol zkouška

Ethanol test - legkovypolnim, pro to, aby 0,4 ml plazmy vyšetřoval, stabilizovaný citrát sodný ve směsi s kyselinou aminokapronovou (blokovat fibrinolýzu), přidat 0,15 ml 50 % ethanol (zkontrolovat koncentraci lihoměry).

Vzdělávání prostřednictvím 10 min jemný indikuje přítomnost sraženiny v krevní plazmě SfmC. Specifický test, ale ukazuje pouze část SfmC (v podstatě - krupnomolekulyarnyh), To dává pozitivní výsledek v DIC, trombóza a další typy thrombinemia. Ve fázi III motor na pozadí těžké hypofibrinogenemia (méně než 0,5 - 0,7 g / l), jak pro heparinizaci, Test ethanol se často stává negativní.

Protaminsulfatny zkouška

Protaminsulfatny test je založen na ukládání na počátku produktů fibrinolýzy a protaminsulfátu SfmC, získané z mléka ryb. Tento test je velmi specifický, ale pro jeho chování vhodné jen určité typy protaminsulfátu.

Schopnost inaktivovat heparin a protaminsulfát příčina paracoagulation nesouvisející. Tím, vzorky protaminsulfát, používá k testování paracoagulation, Musíme být nejprve testovány na roztok nebo monomeru fibrinu, nebo normální plazmy, do které se přidá malé množství pre-trombinu a streptokináza (nebo jen streptokináza).

Když se tento test se stává pozitivní, protamin-sulfát je vhodný pro diagnostické účely. V mnoha proprietárních diagnostických souprav zahrnuje kontrolu (Reference) plazma, dává pozitivní test protaminsulfatnogo. Používá se pro testování činidlem.

Mělo by se vzít v úvahu, co používající ethanol a protaminsulfatnogo testy identifikovat různé komponenty fibrinogenové bazén, v souvislosti s níž jejich výsledky se ne vždy shodují s navzájem. Tak, u některých pacientů s DIC oba testy jsou pozitivní, jiní - pouze jeden z nich. Proto je pro spolehlivou diagnózu je nutné provést oba testy.

Ortofenantrolinovy ​​zkouška

Ortofenantrolinovy ​​zkouška (OFT) - Vysoce informativní, To umožňuje pro kvalitativní a kvantitativní stanovení SfmC v plazmě s malým množstvím destiček (dále odstředí 20 minut při 4000 / Min).

Pouze pro provedení testu vhodné hydrochlorid ortofenantrolin. Roztok ortofenantrolina 0,033 M (0,78 %) Se mísí při teplotě místnosti po stejnou (podle 0,1 ml) studovat plazmy na sklíčku a kývání určuje čas výskytu prvních vloček smíšené.

Záznam je prováděn na 2 m.

Výsledky (v sekundách) převede přes kalibrační křivky ve výši SfmC. Kalibrační křivka byla připravena přidáním různých koncentrací fibrinmonomera, získá způsobem Radzevich-Hodorova, kaluž krevní plazmy zdravých lidí (Dárce). Normálně vločky se objeví v 120 z; rychleji se objeví, více SfmC obsažené ve zkušebním plazmě.

Zkušební spolehlivý nemoc, než ethanol a protaminsulfatny.

Identifikace SfmC erytrocytů aglutinace, pokrыtыh fibrinu monomerami (FM-test)

I lidské erytrocyty(Ó) Skupiny na které se vztahují monomery fibrinu jsou používány v DIAGNOSTICUM.

Krevní plazma je smíchán s skla zkušebních erytrocytů. Vzhled aglutinace (odhadnuta + na +++) To ukazuje na přítomnost SfmC, interakci s monomery fibrinu na povrchu červených krvinek.

Test je vysoce senzitivní, odhaluje koncentraci vyšší než SfmC 10 mg / ml.

Úplná identifikace koagulaci fibrinogenu a SfmC kaluž použití jedovatého efi písku

Řešení jed písek efi nebo koagulační frakce (ehitoks, ekarin) plně Koagulovaný fibrinogen, Všechny produkty SfmC a brzy fibrinolýza, v souvislosti s tím, že může být použit k posouzení celkové množství fibrinogenu koagulačních složek v krevní plazmě bazénu a počet SfmC a fibrinogenu uzamčen, zbývající po počátečním pádu v séru, získaný po srážení trombinu.

Pomocí koncentrace jedu, která způsobí koagulaci normální plazmy pro 20-30.

V přítomnosti vzorku SfmC jed plazmového fibrinogenu odhalila více z, než při testu s trombinem, v séru, získané po 15 sekund srážení trombinu, s přídavkem jedu produkoval druhé sraženinu, která jde celou SfmC a související zamčené fibrinogenu, stejně jako dříve PDF.

Tyto jevy jsou typické pro thrombinemia a masivní intravaskulární koagulaci (DIC, tromboembolie, a kol.), zatímco v séru zdravých testovaných osob nevykazuje žádný jed SfmC a zamčené fibrinogenu. Po koagulace jed fibrinogenu a makromolekulární deriváty nenašli žádnou chromatografie, audio přes testovací lepící stafylokoky.

Kromě výše, k určení SfmC a brzy produktů štěpení fibrinogenu (nebo fibrin) plasmin mohou být použity následující testy.

Zkouška adheze stafylokoků

Zkouška adheze stafylokoků (TSS, Stafylokokové Test klamping) - Jednoduché a vysoce informativní Způsob detekce v séru SfmC a včasné produkt fibrinolýzy (fragmenty X, jakož i odpovídajícího uzamčené fibrinogenu).

Je to založeno na schopnosti určitých kmenů Staphylococcus (Neumann A₂S a další) vzhledem k přítomnosti na jejich povrchu, zejména faktor klamping podstoupit aglutinační ovlivněna zbývající sérum, SfmC po srážení a počátkem PDF (fragmenty X).

Krev pro výzkum je přijata na stabilizačním roztokem ve směsi s kyselinou aminokapronovou prevenci fibrinolýza in vitro.

Zkouška se provádí na skleněné podložce nebo na deskách 74 hnízda smícháním stejných objemů diagnostických nástrojů a studie krevního séra na ředění 1:2, 1:4, 1:8 a t. d.

Vzata v úvahu konečná ředění, který ještě stanoveny aglutinace. U zdravých jedinců je obsah SfmC a počátkem FDP v séru není vyšší než 0,002 g / l (2 ug / ml).

Imunologické stanovení časné a pozdní FDP v séru

Imunologické stanovení časné a pozdní FDP v séru je založena na schopnosti produkovat imunitní séra antifibrinogenovoy srážecí složky fibrinogenové bazén (Citlivost je určena ředění séra fibrinogenu).

Když imunoelektroforéza kvůli různým mobility SfmC, fragmenty X, A, D a E jsou snad svědčí o jejich stanovení. Kvantitativní hodnocení se provádí tím, že zkoumá různých ředění fibrinogenu, plazmy a séra. Konkrétnější testy s konkrétní antiséra anti-D, anti-D dimeru, atd..

PDF latex zkouška

Zkouška lepení latexových částic, naloženo s anti-D, anti-E, antidimer D atd. (PDF latex zkouška), je stanovení pomocí diagnostických souprav uvedené PDP lepení latexové částice o míchání různých ředění séra.

Určení plazmy aktivovaného faktoru XIII jako indikátor trombinu v krevním oběhu

Faktor XIII, aktivovatelný trombinu v přítomnosti iontů vápníku, Řetězec je rozdělen do, obladayushtuyu fibrinu stabiliziruyushtey aktivnostyyu, a inerciální řetěz S.

Samostatné stanovení jejich obsahu (na stupni stabilizaci fibrinu oligomerů a imunologické) diagnostikovat intravaskulární koagulace krve podle thrombinemia přítomnosti. Metoda komplexní, Používá se především pro vědecký výzkum. Jsou vyvíjeny více cenově dostupné metody pro stanovení faktoru XIIIa.

Detekce aktivace protrombinu

Při aktivaci protrombinu faktorem Xa štěpí substrát fragment F1-2, odhodlaný imunologicky. Zvýšení obsahu těchto produktů ve plazmě značí aktivaci srážení krve.

Identifikace buněčných aktivačních markerů intravaskulární koagulaci

Fenomén poškození (Roztříštění) erytrocytů

Když DIC a jiné druhy blokád mikrocirkulace v malých cév červených krvinek jsou vystaveny zranění, v souvislosti s níž krevní nátěry zvyšuje počet fragmentovaných buněk (více než 7 10%).

Přesněji řečeno, tento jev je určena oddělením krevních buněk v hustotním gradientu Ficoll-verografin (hustota 1,077) jak je popsáno v, použitý v imunologii pro izolaci lymfocytů a monocytů. Normální leukocytů interfázní kroužek je bělavá opalizující barvu a její počítání komora obsahuje méně než Goryaeva 400 erytrocyty 1 l (častěji nanejvýš 200).

Když počet DIC pop-up (Poškozené) Červené krvinky se zvyšuje dramaticky (pro 1000-1040 000 v 1 l a více), v souvislosti s níž kroužek je malován v růžové nebo červené. Kvantitativně, jev se odhaduje počítáním obsahu červených krvinek v interfázi (komora Goryaeva).

Metoda umožňuje rozlišovat mezi DIC a blokádou mikrocirkulace trombózy velkých cév, ve kterém poškození červených krvinek mírně.

Fenomén výroby tromboplastinového monocyty

Některé typy DIC (zejména imunitní a infekčního původu) monocyty se aktivují a získávají schopnost produkovat tkáňový tromboplastin.

Pro detekci tohoto jevu krevní buňky, které se oddělí gradientem hustoty (Ficoll-verografinovaya Směs, hustota 1,077) aby se získala frakce, obsahující velké množství monocytů, Krátce kultivovaný, a pak se suspenze je určen srážecí aktivitu před a po narušení buněk. V závažné infekční-septického procesu, tato funkce může být potlačena monocyty.

Identifikace snížení plazmu (spotřeba) složky koagulace, fibrinolytická, a kalikrein-kininové systémy

Při akutní a subakutní DIC pozorováno zvýšené spotřebě, a metabolismus několika složek hemostatického systému, proto je úroveň plazmě je významně snížena. Zvlášť výrazné inhibice faktoru VIII, PROTI, antitrombin III, proteiny C a S, fibronektin, prekallikreina, vysokomolekulární kininogen, plasminogen.

Stanovení některých z těchto parametrů je důležitá ani tak pro diagnózu, jak posuzovat závažnost postupu a účinnosti substituční terapie.

Úroveň faktoru I (fibrinogen) často snížená, co, Nicméně, zpočátku maskován vysokým obsahem jeho plazmatu v infekčních a imunitních chorob, toxemia těhotenství, a jiné formy patologie.

Identifikovat neoantigenov

Během aktivace koagulačních faktorů a fibrinolýzy a následné tvorby jejich komplexů s fyziologickými antagonisty vznikají nové antigenní markery, není tam žádný oddělený do podstatných částí těchto párů. Tak, např, komplex trombin-antitrombin III forma antigenu, není charakteristika "jednotlivě nebo trombin, ani antitrombin III.

Podobně, se tvořil v neoantigen párování plazmin - antiplazmin, a tak dále. d. V přítomnosti antiséra k nim neoantigenam snadné určení přítomnosti aktivovaného krevního srážení klíčových enzymů (Trombin) a fibrinolýza (plasmin).

Moderní klinika má dostatečně velký soubor testů, identifikovat intravaskulární aktivaci srážení krve a fibrinolýzy.

Mnoho z těchto testů jsou veřejně dostupné, rychle a snadno implementovat. Jejich použití v kombinaci s některými dalšími studiemi poskytuje spolehlivé laboratorní diagnostiky DIC a další typy masivní intravaskulární koagulaci. Sledování markery intravaskulární koagulace je nastaven pro správné posouzení dynamiky patologického procesu, účinnost a přiměřenost terapie.