Проучавање система коагулације крви

Методе за проучавање система коагулације крви укључују следеће групе:

1. индикативно (Генерал), дајући представу о стању целе коагулационе каскаде у целини и њених појединачних фаза (Регистрација може се изводити визуелно или уз помоћ посебних уређаја - коагулографа, тромбоеластограф и др.);
2. диференцирајући недостатак појединих фактора – корективни тестови коагулације, тестови мешања проучаване крвне плазме са крвном плазмом пацијената са познатим недостатком одређених фактора;
3. квантитативно одређивање појединих компоненти система њиховом функционалном активношћу (тестови коагулације, студије хромогених и других супстрата) и (или) имунолошким маркерима;
4. откривање интраваскуларне активације процеса коагулације крви и фибринолизе функционалним знацима или молекуларним маркерима такве активације — откривање активираних фактора коагулације у циркулацији, производи дегранулације тромбоцита, цепање компоненти система коагулације крви или њихових метаболита, појава нових антигенских маркера активираних фактора и њихових комплекса, убрзан метаболизам обележених компоненти система коагулације крви (скраћивање њиховог полуживота у циркулацији).

Тако, при процени стања система коагулације крви користе се као стварни технике коагулације (лабораторијски и инструментални), чинећи основу дијагностичког процеса, и имунолошки, радионуклида и друге врсте истраживања. Истовремено, у многим случајевима, компоненте система се могу одредити као функционална активност, а имунолошки – према садржају одговарајућег антигена у крви. Паралелна употреба ових техника нам омогућава да разликујемо облике патологије., повезан са недостатком синтезе одговарајућег фактора коагулације (у овом случају подједнако смањена као и њена функционална активност, и количина антигена), и форме, на којој се синтетише молекул фактора, али је ненормалан и функционално неисправан.

За означавање првих облика, знак "-" се додаје броју одговарајућег фактора. (на пример, ВИИИ-, : ИКС- i t. д.), а у другом - знак "+" (на пример, ВИИИ+, ИКС+).

индикативно (Генерал) тестови коагулације

Одређивање времена згрушавања крви

Одређивање времена згрушавања крви (преферирао технику Ли-Вајт) - дуго коришћено брзо дејство (директно поред кревета пацијента) тест оријентације, за откривање значајних поремећаја крварења, повезан са недостатком фактора хемокоагулације (осим фактора ВИИ) или дејством антикоагуланса и фибринолитика. Користи се као оријентациони тест и за праћење терапије хепарином, елиминисање дејства хепарина са протамин сулфатом. Тест је релативно неосетљив, његови индикатори су нарушени само уз наглашено смањење садржаја фактора коагулације у плазми (испод 4-5 %), стога неприкладан за откривање благих облика хемофилије А и Б, као и поремећаји згрушавања крви код ангиохемофилије, недостатак фактора КСИ, прекаликреин и кининоген високе молекулске тежине. Из ових разлога, тест се не може користити за преоперативни преглед пацијената.: са нормалним резултатима тестова (5-10 мин) може доћи до обилног постоперативног крварења.

Време рекалцификације плазме

Време рекалцификације плазме - нестандардизовани тест ниске осетљивости, мање поуздан за откривање хипокоагулације, него време згрушавања пуне крви. Не може се препоручити за дијагнозу поремећаја хемостазе.

Активирано парцијално тромбопластинско време у плазми

Активирано парцијално тромбопластинско време у плазми (АПТВ, каолин-кефалински тест) - високо осетљива метода, откривање поремећаја згрушавања крви при покретању процеса унутрашњим механизмом. Селективно подложан недостатку фактора коагулације плазме (пошто недостатак тромбоцита и фактора 3 тромбоцити се компензују спољно примењеним цефалином или еритрофосфатидом).

Користи се за контролу терапије хепарином, преоперативни преглед пацијената и др.. д. Нормативни индикатори зависе од коришћених узорака цефалина, у већини случајева су 37-50 с (оптимално - 37-45 с).

Плазма каолинско време

Време каолина у плазми - тест, слично претходном, али без додавања цефалина у плазму (еритрофосфатид), услед чега је осетљива не само на недостатак фактора коагулације плазме, али и на недостатак тромбоцита и фактора 3 Тромбоцита. Приближна процена активности овог фактора може се извршити упоређивањем времена каолина у плазми испитаника са високим и ниским бројем тромбоцита. (норма - 57-70 с).

Не препоручује се употреба фосфолипидних компоненти, дајући у АПТТ време згрушавања једнако 55 са или више, пошто то нагло смањује тачност и поновљивост тестова, укључујући и квантитативно одређивање фактора ВИИИ и ИКС.

Време силицијумске плазме

Плазма силиконско време је време рекалцификације плазме, добијене у условима силиконизације игала, епрувете, пипета, Т. то је. уз минималну активацију контакта. Тест је осетљив на хиперкоагулабилност - интраваскуларну активацију почетне фазе контакта. (фактори КСИИ и КСИ), међутим, овај поремећај се јасније идентификује мерењем времена згрушавања силикона пуне крви. (на основу Лее-Вхите методе или тромбоеластографске регистрације процеса у силиконизованој кивети).

Нормативни показатељи зависе од коришћеног силикона и одређују се проучавањем крви здравих људи за сваки његов узорак посебно.. Када бирате силикон, најбољи је, што у највећој мери продужава време згрушавања (плазма).

протромбин (тромбопластин) време плазме

протромбин (тромбопластин) време плазме (Брзо време, Protrombinsko indeksa) карактерише брзину коагулације рекалцификоване крвне плазме када је процес покренут спољним механизмом, Т. то је. уз додатак тромбопластина људског мозга (или зеца).

Активност тромбопластина стандардизован на мешовитим узорцима нормалних (контролу) плазма. Најчешће се користе тромбопластини са активношћу од 12–18 с. (у класичној методи Куицк - 12-13 с). Слабији тромбопластин, већа је грешка методе.

Са нормалним протромбинским временом у плазми, тест открива изоловани или кумулативни недостатак фактора протромбинског комплекса - ВИИ., икс, В и ИИ, од чега три фактора (ВИ, Кс и ИИ) Зависни од К-витамина и њихова активност се смањује под утицајем антикоагуланса индиректног деловања. С тим у вези, протромбински тест је главни у праћењу дозирања кумарина. (неодицумарин, или пелентан, синкумар и др.) и други лекови ове групе (фенилин).

Протромбинско време остаје нормално са недостатком фактора унутрашњег механизма активације протромбиназе - фактора КСИИ, КСИ, : ИКС, ВИИИ (Т. то је. за све врсте хемофилије и Хагеманов дефект), као и са недостатком преккаликреина и кининогена високе молекулске масе (ВМ кининогена)

У литератури постоје различити означавање резултата протромбинског теста. Најцелисходније је назначити протромбинско време проучаване и контролисати крвну плазму у секундама (који даје информацију о активности коришћеног тромбопластина). Понекад се користи однос ове две величине., Т. то је. индексом (ПВ проучаване плазме, са ,)/(ПВ контролне плазме, са), (норма је 0,9-1,1).

Други облик евалуације овог индикатора, који се највише користи у лабораторијама, је израчунавање протромбинског индекса у процентима састављањем инверзне аритметичке пропорције (норма — 90-110%), међутим, ова рачуница је нетачна., пошто постоји неаритметички однос између концентрације фактора згрушавања и времена згрушавања, и логаритамску зависност. Штавише, протромбински тест је осетљив само на смањење фактора згрушавања испод 50 % њихова нормална величина. Због тога је препоручљиво користити одређивање протромбинског индекса као процента криве разблажења (1:2, 1:4, 1:8 i t. д.) мешани узорак нормалне плазме. Таква крива се гради једном за тромбопластине различите почетне активности. (од 12 у 18 са) а одређује протромбински индекс код испитиваних пацијената. Предност ове технике је такође, да резултати свих студија, укључујући и оне изведене у динамици у различитим данима, нису повезани са насумичним различитим узорцима нормалне крвне плазме, и на усредсређене једне те исте стандардне параметре, услед чега се значајно смањује грешка методе. Индекси, добијено из криве пропорција и разблажења нормалне плазме, потпуно неспојиво. Ово треба узети у обзир приликом праћења деловања индиректних антикоагуланса., за смањење обичног индекса на 50 % приближно одговара смањењу индекса дуж криве разблажења на 25-30% • У том смислу, анализе увек треба да укажу, како је израчунат протромбински индекс, који су њени нормативни показатељи за тромбопластин ове активности.

Тромбинско време у плазми

Тромбинско време у плазми, Т. то је. време згрушавања цитратне плазме када јој се дода тромбин стандардне активности, је главни тест за процену завршне фазе згрушавања крви. Обрачун овог индикатора је важан за правилно тумачење свих осталих коагулационих тестова., јер би кршење завршне фазе коагулације крви неизбежно требало да доведе до продужења времена згрушавања код свих горе наведених метода.

У већини случајева, када се спроводи тест тромбина, користи се ова концентрација раствора тромбина, који се, када се помеша са једнаком запремином крвне плазме, згрушава за 12— 18 са, али се при препознавању дисфибриногенемије користе и њене слабије концентрације (што доводи до згрушавања за 30-35 с).

тромбинско време је важан дијагностички индикатор, његово кршење се примећује као код урођених, и са често насталим стеченим (секундарни) хипопротромбинемија, са већином дисфибриногенемија, а под утицајем хепарина, производи фибринолизе (ПДФ) и низ других антитромбина и инхибитора самосастављања фибринских мономера. Због тога је тромбинско време примарно иу већој мери нарушено код акутних и субакутних ДИЦ синдрома., што игра важну улогу у брзој дијагнози ове патологије.

Аутокоагулациони тест

Аутокоагулациони тест (ЧИН) - високо осетљиви двостепени, карактерише процес коагулације крви када га покреће унутрашњи механизам. Као АПТТ, тест није осетљив на недостатак фактора ВИИ, али у исто време, његове индикације не зависе од садржаја фибриногена (фактор И) у проучаваној крвној плазми, како се разликује од свих осталих индикативних узорака коагулације.

Још једна предност АЦТ-а је, да се испитује разређена крв, што значајно повећава осетљивост теста на недостатак фактора коагулације и, штавише, АЦТ не захтева употребу каолина и цефалина, пошто се стандардизација контакта и активације фосфолипида у њему постиже хемолизатом сопствених еритроцита пацијента..

Суштина АЦТ-а је, шта да 2 мл хипотоничног раствора (0,222 %) додаје се калцијум хлорид 0,1 мл крви.

У овој смеши хемолизат-калцијум долази до стварања протромбиназе и тромбина., чија је активност одређена секвенцијалним сабирањем 0,2 мл ове смеше 0,2 мл тест плазме (сваки 2 минута током првог 10 м, а затим сваки 10 мин током 1 не).

Плазма субјекта је извор фибриногена, на којима се испитује активност тромбина формираног у смеши. Како су показала бројне студије, може се заменити крвном плазмом здравих људи или раствором фибриногена. У овом случају, проток крви пацијента се смањује на 0,1-0,2 мл (може се узети са прста!), да трансформише тест аутокоагулације у тест микрокоагулације (ИЦТ) и чини га веома погодним за педијатријску употребу, укључујући и проучавање хемостазе код новорођенчади.

Коагулациона активност у АЦТ и МКТ у почетку расте и код здравих људи обично достиже максимум до 10. минута, инкубација мешавине крви и калцијума (КЦС), када дође до коагулације плазме супстрата за 10 ± 1 с. Тада коагулациона активност ККС почиње да се смањује., што указује на инактивацију тромбина формираног у њему. Са хемофилијом, дејство хепарина и других поремећаја коагулације, коагулациона активност ККС је нагло смањена, а максимум се помера са 10. минута на каснији датум. Са хиперкоагулацијом, примећује се раније и значајније повећање активности тромбина у РЦЦ..

При испитивању у једној епрувети (одређивање тек у 10. минуту ККС инкубације) може се користити за контролу терапије хепарином. Предност ове технике у односу на тест активираног парцијалног тромбопластинског времена је у томе што, да уједначава неједнак утицај различитих цефалина на време згрушавања хепарина.

На основу АЦТ-а (ИЦТ) развио једноставну и тачну методу за диференцијалну дијагнозу хемофилије.

Уз помоћ табела конверзије датих у приручнику, АЦТ читања (ИЦТ) може се изразити у процентима и приказати као графикон – аутокоагулограм.

Да би се проценио низ општих параметара коагулације крви, инструменталне методе истраживања се такође широко користе., углавном уз употребу разних коагулографа и тромбоеластографа.

Тромбоеластографија даје идеју не само о временским параметрима коагулације крви или плазме, али и о структури и механичким својствима насталих угрушака. Последњих година стандардизација контактне и фосфолипидне активације процеса коагулације такође је уведена у методе хардверског снимања.. Коагулограми се креирају и за масовно извођење општих тестова коагулације - АПТТ, протромбин, тромбин и други са аутоматским бележењем резултата.

Методе диференцирања дефицита различитих фактора коагулације и њихово квантитативно одређивање

Подаци у табели испод показују, да индикативна студија коагулације крви помоћу три основна теста омогућава групну разлику између недостатка различитих фактора коагулације плазме. Од, успоравање згрушавања само у протромбинском тесту (И врста прекршаја) са нормалним индикацијама за све остале, карактеристичан је за наследни недостатак фактора ВИИ или смањење нивоа овог фактора у раним фазама развоја опструктивне жутице или у првих 1-2 дана лечења индиректним антикоагулансима., када супресија синтезе фактора ВИИ надмаши у његовом развоју смањење нивоа свих других фактора коагулације зависних од К-витамина.

Кршење само унутрашњег механизма коагулације, Т. то је. активирано парцијално тромбопластинско време и АЦТ (ИИ тип), види се код недостатка фактора КСИИ, КСИ, : ИКС, ВИИИ, Виллебранд (не у свим облицима), преккаликреин и БМ кининоген. Од њих, са наследним дефектима згрушавања, недостатком фактора КСИИ, прекаликреин и кининоген ХМ је изузетно ретка и није праћена крварењем, док недостатак фактора ВИИИ (хемофилија А), : ИКС (Хемофилија Б) а фон Вилебранд фактор је веома чест (је преко 96 % све наследне коагулопатије) и праћен је јаким крварењем.. Између њих, пре свега, спроводи се даља диференцијална дијагноза..

Недостатак фактора КСИ релативно ретко (око 0,5-1,0 % све хемофилије), наставља са врло благим крварењем (углавном после повреда и операција) и заузима средњу позицију између прве подгрупе асимптоматских поремећаја и хемофилије и фон Вилебрандове болести.

Други тип поремећаја карактерише продужење парцијалног тромбопластинског времена и АЦТ., и протромбинско време. Карактеристично је за недостатак фактора В., Кс или ИИ или за комплексни недостатак свих фактора зависних од К-витамина (ВИ, икс, : ИКС, ИИИ), оно што се примећује код опструктивне жутице и других врста К-витамина, као и при узимању антикоагуланса индиректног дејства.

И коначно, као што се види из исте табеле, могуће кршење очитавања сва три теста (ИВ тип), што се уочава код наследне и стечене хипо- и дисфибриногенемија (не све), када узимате антикоагулансе директног дејства (heparin, хепариноиди, гирудина и др.), лечење активаторима фибринолизе и лековима за дефибринацију (Dobio je streptokinazu, урокиназа итд.), појава у крви патолошких антитромбина и супстанци, ометање везе (скупштина) мономери фибрина - парапротеини, криоглобулини, имуни комплекси, као и сложени поремећаји крварења, узроковано ДИЦ-ом. Истовремено, тромбинско време је често поремећено у већој мери и нешто раније., него други тестови.

Када се узме у обзир прописана болест и могућност њене наследне генезе или секундарне повезаности са другим врстама патологије и лековитим или другим ефектима, присуство или одсуство крварења и његов тип, могуће је правилно утврдити генезу ових дубоких поремећаја коагулације крви.

Сви диференцирајући тестови се заснивају на принципу корекције, Т. то је. на дефиницији, у којој мери се елиминише откривени поремећај крварења или, обрнуто, не елиминише се узорцима плазме или вештачки добијеним крвним производима са познатим недостатком једног или другог фактора згрушавања.

У ту сврху специјализоване лабораторије за себе стварају колекције крвне плазме са недостатком фактора., примајући их од пацијената са познатим дубоким (мање 1 %) недостатак сваког од фактора и чувати их у малој амбалажи (о 0,5 Јр) на температури - 30 ° Ц. Ако је потребно, ови узорци се одмрзавају и користе у дијагностичким тестовима..

Плазма, случајно одмрзнут или остављен неискоришћен, не подлеже поновном замрзавању. У корективним тестовима не треба користити плазму са имуним инхибиторима једног или другог фактора.. Дијагностички комплети бројних компанија садрже замрзнуте узорке крвне плазме са недостатком фактора коагулације који се могу детектовати. (супстратне плазме). Међутим, многи поремећаји згрушавања су изузетно ретки у клиничкој пракси., с тим у вези, користе се вештачки припремљене компоненте нормалне крви са недостатком одређених фактора коагулације, као и хетерогена плазма (кокошке, пачићи итд.).

У табели су приказани подаци о садржају фактора коагулације крви у компонентама крви, користе се за корективне тестове коагулације у зависности од времена њиховог складиштења. Користећи ову табелу, лако дешифровати индикације било ког од три главна коагулациона теста. Корективне методе ове врсте користе тестове, стандардизован за контактну и фосфолипидну активацију, Т. то је. каолин-кефалин или уз употребу хемолизата (ин АЦТ).

Тестови мешања плазме пацијената, имајући познати недостатак једног или другог фактора

Одредите активирано парцијално тромбопластинско време у проучаваној крвној плазми, нормална плазма (КОНТРОЛА) и у плазми за коју се зна да има недостатак фактора ВИИИ (од пацијента са хемофилијом А), : ИКС (од пацијента са хемофилијом Б), КСИ и КСИИ. Затим се припрема смеша од узорака цитратне плазме испитаника. (7/10 обим) и то узастопно са сваком од дефицитарних плазма (3/10 обим), почевши од недостатка фактора ВИИИ и ИКС (најчешћи облици патологије!).

У смешу се додају каолин и кефалин, и 2 мин подвргнут њеној рекалцификације (на температури 37 ° Ц). У он се мешао, где се активирано парцијално тромбопластинско време не нормализује, имају исти дефект згрушавања.

Од, ако се активирано парцијално тромбопластинско време код испитиваног пацијента не нормализује додавањем крвне плазме пацијента са познатим недостатком фактора ВИИИ., али се коригује крвном плазмом пацијента са недостатком фактора ИКС, он има хемофилија А.

слично, али се на основу протромбинског теста диференцира недостатак фактора протромбинског комплекса. (икс, У, ВИИ и ИИ).

Тест стварања тромбопластина

Да би се разликовали поремећаји унутрашњег механизма коагулације крви, класична тест стварања тромбопластина са заменом тромбоцита, чија припрема захтева значајно улагање времена и крви, цефалин Недостаци теста генерисања тромбопластина су његова гломазност, потреба за припремом великог броја реагенаса, значајно време за завршетак.

Тест корекције, на основу аутокоагулационог теста.

Још један корективни тест у потпуности испуњава задатке експресне дијагностике, на основу корекције са истим компонентама нормалне крви на основу аутокоагулационог теста.

Овај тест је веома поуздан, брзина и лакоћа имплементације и захтева мало (максимум 0,5 Јр) количина крви која се испитује, што му омогућава да се користи у педијатријској пракси.

У њему, као у тесту генерисања тромбопластина, за корекцију користити адсорбовану плазму и стари крвни серум, који се пре испитивања поново центрифугира. Распоредити у три епрувете 2 Јр 0,222 % раствор калцијум хлорида и два од њих додају 0,1 мл адсорбоване нормалне крвне плазме (1-ја сам епрувета) и 0,1 мл старог нормалног крвног серума (2-ја сам епрувета). У три друге епрувете додати 0,2 мл нормалне цитратне плазме. Затим у све епрувете са раствором калцијум хлорида додати 0,1 мл цитриране крви теста.

Тачно кроз 4 минута инкубације ове смеше, њена активност згрушавања се тестира на нормалној плазми.

Оштро смањење коагулационе активности само у првој епрувети (са нормалним БаСО₄-плазма) указује на то да пацијенту недостаје фактор ИКС (Хемофилија Б), само у другој епрувети (са старим серумом) о недостатку фактора ВИИИ (хемофилија А); ако дође до корекције у обе цеви (подједнако јака), онда, очигледно, постоји недостатак фактора КСИ или КСИИ (видети. Tabela. 14).

Овај тест је веома осетљив, пошто се студија спроводи на разведеном 20 крвна времена током факторске компензације 3 хемолизат тромбоцита. Једини коришћени реагенс је хипотонични раствор калцијум хлорида., оно што узорак чини јавним.

Једнако једноставан је и метод тестова корекције, изведена на основу протромбинског теста за диференцирање недостатка фактора ИИ, В и ВИИ+, икс (сто).

Да се ​​направи разлика између недостатка фактора ВИИ и Кс, врши се додатни тест коагулације са додатком раствора змијског отрова у испитивану крвну плазму - лек лебетокс (бира се таква концентрација отрова, који у присуству цефалина и калцијум хлорида изазива коагулацију за 20-25 с; сви састојци се узимају у количинама 0,1 мл и мешати) (табела испод).

У исту сврху се користи и Раселов отров змије., живи у Индији (припрема стипвен).

Диференцијална дијагноза се по потреби довршава квантитативним одређивањем дефицитарних фактора или њихових специфичних имунолошких инхибитора., зашто се користе посебне високоосетљиве стандардизоване методе. Ове методе користе конструкцију криве разблажења мешовитих узорака нормалне крвне плазме уз корекцију дефицита свих фактора., осим проучаваних. Ове криве одређују активност проучаваног фактора у плазми пацијената.

Posebno важно је квантификовати концентрацију фактора ВИИИ и ИКС, као и присуство њихових инхибитора код пацијената са хемофилијом А и Б (посебно пре и током хируршких интервенција и током интензивне супституционе терапије), као и одложено обилно послепорођајно крварење, када је потребно разликовати ДИК од ређе патологије – појаве имуно инхибитора фактора ВИИИ. (још много ређе – фактор В).

За озбиљан недостатак фактора КСИИИ (веома редак наследни поремећај) сви тестови коагулације су нормални, али угрушци се растварају у 5М или 7М урее.

Помаже да се разликује недостатак различитих фактора коагулације такође узимајући у обзир степен и, посебно, услови нормализације очитавања теста након интравенске примене крвних производа пацијентима, Т. то је. корекцијско рачуноводство u vivo према методи Л. 3. Све.

Ова техника је посебно ефикасна са великом разликом у животном веку диференцибилних фактора у циркулацији.. Од, полуживот фактора протромбинског комплекса варира од неколико сати (фактор ВИИ) до неколико дана (фактор II). Средњу позицију између њих заузимају фактори Х (2- 2,5 дана) и В (12-18).

Стога, након масовне млазне трансфузије плазме, протромбински индекс се повећава са недостатком фактора ВИИ за веома кратко време., са недостатком фактора В - нешто дуже (око 4-6 пута), а са недостатком фактора Х и, посебно, ИИ на дужи период (преко 1-2 дана). Индикативно у овом погледу је ефекат на протромбински индекс лека ППСБ (концентрат фактора ВИИ, : ИКС, Кс и ИИ). Такође краткорочно нормализује протромбинско време код недостатка фактора ВИИ и дуже (у много времена!) са недостатком фактора Х и ИИ. Пошто овом препарату недостаје фактор В, овај дефицит они не исправљају.

Слична разлика се открива у трансфузији и супституционој терапији фактора унутрашњег механизма коагулације. (: КСИИ, КСИ, ИКС и ВИИИ), шта се бележи активираним парцијалним тромбопластинским тестом.

Од посебног интереса је динамика корекције нивоа фактора ВИИИ и индикација АПТТ у трансфузијској терапији хемофилије А и вон Виллебрандове болести. Код прве од ових болести, детектује се непосредно максимално побољшање згрушавања након трансфузије. (Jet, brzo!) примена антихемофилне плазме или криопреципитата, а затим прилично брзо (од 10 до 18 часова) његов стални пад, док код вон Виллебрандове болести постоји извесно повећање активности згрушавања у року од неколико сати након трансфузије, а затим његов пад – много спорије, него са. С тим у вези, у лечењу вон Виллебрандове болести, ређе се користе заменске трансфузије., него хемофилија А.

Проучавање функционалне активности фактора коагулације и компоненти каликреин-кинин и фибринолитичких система коришћењем хромогених супстрата

Методе се заснивају на проучавању активности протеолитичких ензима и њихових инхибитора., укључени у згрушавање крви, фибринолиза и формирање кинина, према интензитету и брзини цепања пептида специфично осетљивих на ове ензиме, при чијој деградацији се ослобађа средство за бојење (β-нитроанилин).

Степен боје реаговане смеше одређена спектрофотометријски, а према његовом интензитету суди се активност одговарајућих ензима (фактори згрушавања, kallickreina, плазмина и др.), а на инхибицију процеса - на активност инхибитора ензима.

Од, на пример, дејство хепарина и антитромбина ИИИ може се проценити слабљењем цепања хромогених супстрата фактором Кса или тромбином., и активност α₂-антиплазмин – слабљењем деловања плазмина на одговарајући хромогени супстрат. Хромогени супстрат или имају број (на пример, с-2222), или се називају хромозини са скраћеним префиксом, означавајући тај ензим, на које је овај супстрат осетљив (на пример, Цхромозим ПЛ је супстрат плазмина, Цхромозим ТХ - супстрат тромбина, Цхромозим ПК је супстрат за прекаликреин/каликреин и т. д.).

Хромогени супстрати проширују могућности проучавања система хемостазе, али још увек није доступан многим лабораторијама. Нека истраживања, направљен уз њихову помоћ, немају предности у односу на конвенционалне тестове коагулације и дају резултате који се поклапају са њима; у другим случајевима њихова употреба поједностављује и убрзава истраживање, чини тачнијим; треће, ове технике су од независног значаја и не могу се заменити тестовима коагулације (на пример, дефиниција прекаликреина).

Имунолошко одређивање компоненти система хемостазе

Имунолошко одређивање компоненти система хемостазе врши се методама:

• Имунопреципитација;
• Имуноелектрофореза;
• Радиоимуноесеј и други са одговарајућим антисерумима

У овом случају се процењује садржај антигена једног или другог фактора коагулације у крвној плазми. (или фрагменти), не функционална активност., који се може нагло смањити уз нормалан садржај антигена у плазми. Ова ситуација је типична за све те случајеве, када се у телу синтетишу абнормалне супстанце (функционално неисправан) Фактори, задржавају своју антигеност, али лишен способности да учествује у хемостази.

Ово омогућава разликовање између потпуног престанка синтезе одговарајућих фактора и формирања њихових абнормалних облика..

Истовремено, одређени број компоненти система хемостазе може се одредити само имунолошки..

Ова група укључује тако важне студије, како дефинисати следеће компоненте:

• β-тромбоглобулина;
• α2-макроглобулин;
• протеина Ц и С;
• антигени фактора ВИИИ:Ц и ВИИИ:Р_цоф;
• производи фибринолизе (ПДФ);
• неоантигени тромбин-антитромбина ИИИ и комплекса плазмин-антиплазмин;
• низ других тестова.

Дакле, имунолошка студија значајно допуњује функционалну процену различитих делова система хемостазе..

Дијагностички тестови, на основу употребе препарата од змијских отрова као реагенса

Дуго успостављена, да отрови многих змија садрже високо активне протеолитичке ензиме, изазива згрушавање крви и утиче на различите делове каскаде коагулације. Као резултат тога, змијски отрови и коагулазе изоловани из њих се широко користе за препознавање поремећаја хемостазе., квантификација фактора згрушавања, детекција и квантификација растворљивих фибрин-мономерних комплекса (РФМЦ) и низ других студија.

Узорци са змијским отровима често знатно олакшавају и ефикасније дијагностикују поремећаје хемостазе..

У табели су приказани подаци о механизму деловања отрова на систем коагулације крви и могућности дијагностичке употребе сваког од њих..

Ове могућности су додатно побољшане истовременом употребом неколико отрова и најједноставнијим општим тестовима коагулације.. Од, на пример, Истовремена употреба узорака коагулације са отровом змије и ефа олакшава разликовање недостатка фактора ВИИ, Х-V и II (у табели испод), и са додатном корекцијом филтрираном нормалном плазмом (извор фактора В и ИИ) -недостатак фактора Х и В.

Одређивање главних физиолошких антикоагуланса

Најважније је одређивање активности главног физиолошког антикоагуланса - антитромбина ИИИ., смањење које може бити генетски условљено (примарна тромбофилија) или секундарно због интензивне потрошње (ДИЦ, масивне тромбозе) или убрзани метаболизам (лечење хепарином, Л-аспарагиназа, синтетички контрацептиви) и блокада имунолошким комплексима, парапротеини, фибронектином, протеини акутне фазе.

У сваком случају, смањење активности антитромбина ИИИ испод 60-65 % подржава интраваскуларну коагулацију, смањује антикоагулантни ефекат хепарина. Међутим, врло често не постоји редовна кореспонденција између нивоа антитромбина ИИИ и смањења осетљивости на хепарин..

У овом случају, обично слабљење антикоагулантног ефекта хепарина значајно превладава над степеном смањења активности антитромбина ИИИ.. Доказао, да у различитим облицима недостатка антитромбина ИИИ, његов афинитет за хепарин може варирати у различитом степену. Штавише, различите фракције хепарина, чији је однос у лековима веома променљив, такође имају различит афинитет за антитромбин ИИИ. Стога је практично важно истражити како је стварна активност антитромбина ИИИ, и његову способност да се под утицајем хепарина претвори у брзо делујући антикоагулант.

Антикоагулантна активност антитромбина ИИИ

Антикоагулантна активност антитромбина ИИИ одређена способношћу проучаване крвне плазме (разведен — метод Копли—Винтерштейна или дефибринисана топлотна денатурација на температури 56 °С - Лолигерове методе, Абилдгаарда и други.) инактивирати тромбин који се примењује споља на одређени период. Преостала активност тромбина у таквој плазми може се одредити његовом активношћу згрушавања. (фибриногена, плазма адсорбована баријум сулфатом) или цепањем хромогеног супстрата, осетљив на тромбин или фактор Кса (пошто антитромбин ИИИ инактивира и овај фактор).

Активност кофактора хепарина

Хепарин-кофакторска активност антитромбина ИИИ садржана у крвној плазми дуг период је одређен коришћењем теста толеранције на хепарин у плазми, што се може сматрати индикативним, јер даје веома велики распон нормалних показатеља и није довољно репродуцибилан.

Знатно тачнији и поновљивији тестови, у којој се истражује утицај различитих концентрација хепарина на тромбинско време испитиване плазме, садржи малу количину тромбоцита. Поређење је направљено са продужењем тромбинског времена у контролној нормалној крвној плазми., којима се додају исти узорци хепарина.

Од, у тромбин-хепарин тесту, такве количине хепарина се додају испитиваној крвној плазми, који у контроли продужавају тромбинско време са 15 до 32—35 с (ниска концентрација) и до 95-110 с (висока концентрација хепарина). На основу ових података израчунавају се индекси антитромбинске активности плазме. (ААП) и резерва антикоагулантне плазме (АРП).

Такође се широко користе сличне методе са проценом степена инактивације тромбина као код коагулационих тестова., и на хромогеним подлогама.

Имунолошко одређивање антигена антитромбина ИИИ

Имунолошко одређивање антигена антитромбина ИИИ омогућава разликовање различитих врста тромбофилије:

• са недовољном синтезом антитромбина ИИИ (ниво антигенског маркера се снижава адекватно на смањење активности);
• са очуваном синтезом њених абнормалних и функционално дефектних облика (ниво антигенских маркера је много већи, него активност).

Протеини Ц и С, тромбомодулин и α₂-макроглобулин се одређује имуноензимским методама.