Испитивање хемостазе васкуларних тромбоцита
Кршења ове везе хемостазе могу се појавити са тенденцијом ка крварењима или тромбози, зависно од тога које су методе истраживања одабране. Штавише, све методе испитивања тромбоцита хемостазе се деле на главне и додатне, или тестови другог реда, које се примењују само ако, ако су употребом тестова открили неправилности. На главни (основни) тестови испод.
Тестови отпора (крхкост) капиларе - шоља, моћи, ангиоресистометрија
Од ових тестова, најдоступнији и истовремено прилично информативан узорак Кончаловски - Румпел - Лееде.
Процена се заснива на броју и величини крварења., формирана на горњој дланској површини подлактице (у круг пречника 5 видети) након 5 минута стискања манжетне рамена под притиском од 12-13,3 кПа (90—100 мм Хг. Чл.). Резултати се бележе до краја 5 мин након уклањања манжетне. Број петехија више 10 указује на повећану крхкост микровесела, која је често повезана са тромбоцитопенијом или ослабљеном ангиотрофичном функцијом тромбоцита. Појава крварења испод саме манжетне такође се узима у обзир..
Јар тест изводи се на истим пределима коже са постепеним порастом негативног притиска - од 20 кПа (150 мм Хг. Чл.) i ispod. Када се вреднују резултати, израчунавају се петехије, појавио се под банкама.
Узорци за трајање и јачину капиларног крварења
Са класиком Дуке тест доњи гребен ушне шкољке, након што се лагано загреје, пробија се до дубине од 3,5-4 мм. Време крварења таквим испитивањем обично не прелази 4 м, а капи крви на филтер папиру су релативно мале и почињу нагло да се смањују отприлике 1-1,5 минута након пробијања. Са озбиљном тромбоцитопенијом (мање 20 Т у 1 Ја) и тешке дисфункције тромбоцита, време крварења повећава се на 20-40 минута, крвне тачке постају значајно велике и не смањују се дуго или се смањују таласи, затим поново повећајте. Дукеов тест није довољно осетљив, у 2/3 пацијентима са тромбоцитопатијом она даје нормалне резултате.
Осетљивији узорци, у коме се време крварења испитује у позадини вештачки створене венске стазе, зашто се манжетна из апарата за мерење крвног притиска поставља на раме и притисак се одржава током читаве студије, једнак 5,3 кПа (40 мм Хг. Чл.). У позадини такве стасије у Узорак Борцхгревинка-Ваалера на длановитој површини горње трећине подлактице, попречним зарезима се наносе скарафикатором 1 мм и дужина 8-10 мм (норма времена крварења је до 10 м), и у узорку, Иви ет ал.. у истом пределу подлактице примењују се три попречне пункције ланцетом за вађење крви из прста 3 мм, (норма времена крварења је до 7 м).
На позадини исте венске стазе истраживање о а. Ц. Схитикова, у којој се убризгава дубина на терминалну фалангу прста 3 мм,, након чега се врх прста урони у чашу са 5 у обзир се узима и мл изотоничне растворе натријум-хлорида и време крварења у проширеном светлу (ако је раствор веома интензивно обојен крвљу, затим се за даље посматрање прст премешта на другу такву чашу). Количина изгубљене крви одређује се повећањем запремине течности у шољама (норма времена крварења је до 4 м, количина изгубљене крви - од 0,01 у 0,4 Јр).
У тесту за Г. Н. Сусхкевицх количина изгубљене крви одређује се бојом раствора амонијака (0,04 %) , папир обојен крвљу, колориметријом на медицинском колориметру.
Индикације тестова за трајање крварења, ненормално, указују на изразито кршење тромбоцитно-васкуларне хемостазе, међутим, са нормалним резултатима ових тестова, не искључује се присуство благих тромбоцитопатија.
Број тромбоцита
Број тромбоцита (у комори за бројање Горјајева са фазним контрастом или нијансирањем или коришћењем бројача честица) - најважнији начин дијагнозе тромбоцитопеније и тромбоцитопатије, настају сталним или периодичним смањењем броја ових ћелија (Бернардове аномалије - Соулиер, Маиа - Хегглина и др.).
Такође сугерише и број тромбоцита, да ли је могуће спровести њихово даље функционално истраживање и на који начин се оно мора извести (са или без предконцентрације тромбоцита, фотометријска или микроскопска итд.. д.).
Испитивање величине тромбоцита у брису – тромботситометрииа
Испитивање величине тромбоцита у брису (тромботситометрииа) омогућава вам да прелиминарно процените различите популације ових ћелија у крви субјекта и добијете информације о одређеном броју њихових аномалија, а такође и о засићености тромбоцита гранулама.
Уз неке тромбоцитопатије (Вискотт-Алдрицх синдром) у крви доминирају врло мали тромбоцити (у 2 микрона у пречнику), са другима, дивовске форме (Бернардове аномалије - Соулиер, Маја - Хегглина) – da 8 м или више. Са већим бројем тромбоцитопатија, ове ћелије су сиромашне гранулама (видети. ispod), код осталих, централизација гранула је нарушена када се тромбоцити шире на стакло, што указује на кршење реакције ослобађања гранула и супстанци садржаних у њима, неопходно за хемостазу. Сва ова својства, као и способност тромбоцита да спљоште и формирају процесе, Процена структуре ових ћелија може се проучавати коришћењем конвенционалне и скенирајуће електронске микроскопије, као и коришћење оптике интерференције према Номарском.
Увлачење крвног угрушка природно прекршена тешком тромбоцитопенијом (мање од 30-40 г 1 Ја) и са неким облицима квалитативне инфериорности тромбоцита, најчешће - са Гланзманновом тромбоцитопенијом, уремичка тромбоцитопатија итд..
Истраживање функције адхезије-агрегације тромбоцита (ААФТ)
Истраживање функције адхезије-агрегације тромбоцита (ААФТ) - најважнија карика у лабораторијској дијагнози већине тромбоцитопатија. Тренутно је развијено неколико лако изведивих и опште доступних метода истраживања., укључујући визуелну, микроскопски и хардверски (агрегометри, микрофилтери итд.) регистрација ове функције указује на следеће методе.
Методе задржавања тромбоцита на стаклу (или филтере)
Тромбоцити у венској крви рачунају се пре и после ње одређеном брзином кроз стандардну колону са стакленим куглицама или кроз пигтаил од фибергласа; тромбоцити из крви се процењују на основу њихове адхезије.
Више доступних, иако нешто мање тачан, метода за одређивање броја тромбоцита у крви пре и после њеног контакта током одређеног времена са унутрашњом површином тиквице, ротирајући се одређеном брзином. Тачније методе за одређивање кашњења тромбоцита у миллипоровим филтерима (пречник пора - 15-20 микрона). У овим тестовима, може се проценити повећањем градијента притиска изнад и испод филтера. (блокада пора тромбоцита и њихових агрегата доводи до повећања овог показатеља).
Методе за проучавање функције агрегације тромбоцита
Тест агрегације хемолизата заснована на способности хемолизата испраних црвених крвних зрнаца, истраживан у узгоју 10-2 и 10-6, изазивају узнемиреност у плазми, који садржи велики број тромбоцита (однос запремине цитратне плазме и хемолизата је 1,0:0,2). У обзир се узима време агрегације (норма са великом концентрацијом хемолизата је 11-17 с, на ниском - 40–54 с) и његову озбиљност. Динамика процеса и његов интензитет такође се могу фотометријски проценити (медицински колориметар, зелени филтер, мешање) и на агрегографу било којег дизајна.
Приликом графичког снимања процеса употреба хемолизата са високим разблаживањем (10-6) омогућава вам да добијете двовални агрегатограм, у коме је други талас повезан са изласком из тромбоцита ендогених стимуланса агрегације - АДП, катехоламини, тромбоксан и други. Овај други талас карактерише реакцију ослобађања., не примећује се у недостатку густих гранула у тромбоцитима (болести базена) или у супротности са реакцијом ослобађања (синдром сличан аспирину итд.).
Тест агрегације хемолизата доступан за покретање у било којој лабораторији, не захтева никакве посебне реагенсе.
Визуелна микромерна мера за агрегацију тромбоцита
Његова суштина је, да се венска крв добијена силицификацијом стабилише двоструком запремином 3,8 % натријум цитрат (однос 2,4:0,6 Јр), центрифугирано 6 мин у 100 рпм, након чега се добијена плазма богата тромбоцитима наноси преко 0,02 мл на слајдове и меша се са истом запремином средстава за агрегацију - АДП, тромбин, колаген, норепинефрин или ристомицин. Коначна концентрација агенса за агрегацију у испитиваној крвној плазми треба да буде:
- АДФ 0,5*10-4 ммол / л;
- норепинефрин - 0,015%;
- тромбин - 0,125 јединица / мл (Концентрација колагена је одабрана емпиријски).
Могући тест као нижи, и веће концентрације агенса за агрегацију. Избор њихове концентрације може варирати у зависности од неуједначене активности лекова различите производње и различитих активности узорака, у вези с тим, неопходно је прелиминарно прилагођавање концентрације сваког средства у нормалној плазми.
Мешавина крвне плазме богате тромбоцитима агрегационог агенса се меша клизањем стакленог клизача, на тамној позадини уз помоћ лупе, време појаве агрегата у облику „снежне олује“. Приликом процене резултата узима се у обзир број тромбоцита у плазми. Од, Време агрегирања АДП-а, повећава се од 27–37 с за 400 Т у 1 л тромбоцити до 62-75 с 50 Т у 1 Ја, и тромбинске агрегације, од 40–52 до 79– 106 са.
Графичка регистрација процеса здруживања
Графичко снимање процеса агрегације под утицајем истих средстава за агрегацију је врло информативна метода за функционално истраживање тромбоцита.. Изводи се на агрегографима или.
Помоћу графичке регистрације утврђује се не само време почетка здруживања, али и њен интензитет (одступањем криве и површине агрегата), присуство првог и другог таласа агрегације - када се користе ниске концентрације адреналина и АДП (други талас карактерише реакцију ослобађања), као и патолошка рашчлањивања.
Визуелно или графичко истраживање агрегације тромбоцита под утицајем ристомицина
Прилично Важно је визуелно или графичко проучавање агрегације тромбоцита под утицајем ристомицина. Ова врста агрегације је прекинута (крајња концентрација ристомицина 0,8-1,0 мг / мл) са једном од најчешћих хеморагичних дијатеза - ангиохемофилијом (вон Виллебрандова болест), као и код Бернард-Соулиер-ових абнормалности тромбоцита и са неким стеченим облицима инхибиције синтезе вон Виллебранд-овог фактора (уремија, инхибиција имуног система и т. д.).
Квантитативно одређивање вон Виллебрандовог фактора у плазми
Квантитативно одређивање вон Виллебрандовог фактора у крвној плазми врши се ристомицин-аглутинацијом суспензије нормално формализованих тромбоцита у различитим разблажењима испитиване плазме без тромбоцита.
Метода је важна како за дијагнозу ангиохемофилије, тако и за секундарну инхибицију синтезе овог фактора., и да се процени тежина оштећења ендотела (Vaskulitis, атеросклероза итд.) и склоност тромбози, у којем се садржај фактора вон Виллебранда у крви често значајно повећава.
Вон Виллебранд фактор ниво указује на способност ендотела да га синтетише (смањена хигијефифилијом) и степен оштећења ендотела код васкулитиса, атеросклероза и друге болести, настају оштећењем унутрашње облоге посуда.
Да би се добили фиксни нормални тромбоцити, секвенцијално се додаје крвна плазма богата тромбоцитима 0,2 % ЕДТА решење (0,5 мл 5 мл плазме) и 2 мин. решење за фиксирање (20 Јр 40 % формалин у 1000 мл фосфатног пуфера са 0,2 Г. ЕДТА, пХ вредност 6,4).
Смеша се одржава на температури од + 4 ° Ц не мање 1 не, након чега се центрифугира, супернатант уклоњен, и талог тромбоцита се испере два пута раствором суспензије (једна свеска 3,8 % раствор натријум-цитрата и пет количина изотоничне растворе натријум-хлорида; пХ је подешен на 7,4). Припремљена суспензија нормалних формализованих тромбоцита је пакована у 1 мл и чува се на температури од -20 ° Ц. Калибрациона крива разблаживања конструисана је употребом нормалне плазме без тромбоцита, са узорцима од којих се мешају формализовани тромбоцити. Надаље, у смеши је одређена аглутинација ристомицина.. Калибрациона крива одређује количину вон Виллебрандовог фактора у испитиваној крвној плазми. Фиксни тромбоцити се боље чувају када се у раствор за очување дода мала количина натријум-азида.
Тестови, одражава спонтану агрегацију тромбоцита
Приликом прегледа пацијената са тромбоемболијом или са повећаном склоношћу тромбози и исхемији, главне методе укључују тестове, одражава спонтану агрегацију тромбоцита, Т. то је. настају у полној крви или у крвној плазми без додавања средстава за агрегацију.
Да би се овај феномен идентификовао микроскопом размазане крви, скреће се пажња на однос броја одвојено лежећих тромбоцита и њихових агрегата, који се састоји од 3-5 тромбоцита или више. Ова појава се боље открива када се види седимент., добијена интензивним цеитрифом- плазма богата тромбоцитима (20—30 мин у 6000 рпм), стабилизован раствором цитрата или ЕДТА цитрата. Међутим, следеће методе за одређивање спонтане агрегације дају стабилније резултате..
Ву - Хоак метод
Метода Ву - Хоак заснива се, да се крв из вене сакупља у две епрувете, од којих једна садржи раствор ЕДТА, и у другом, мешавина истог ЕДТА раствора са 4 % раствор формалина. После мешања садржај епрувета се оставља да стоји. 30 minuta na sobnoj temperaturi.
Током седиментације агрегати се слежу, а појединачни тромбоцити остају у супернатанту. Након таложења рачуна се број тромбоцита у супернатанту у свакој епрувети.. Нормално, разлика у броју тромбоцита у садржају обе епрувете не прелази 10-15 %, с повећаном спонтаном агрегацијом, она се повећава.
Метода Х. И. Тарасова
Према методи Х. И. Тарасова (1984) губитак тромбоцита из укупне цитратне крви у агрегатима узима се у обзир након 3 минута мућкања на АВУ-1 шејкеру брзином 90-100 пута 1 м.
У епрувети са 0,5 ml krvi, уздрман, представио 1 Јр 1 % раствор формалина у изотоничном раствору натријум хлорида. Друга контролна цев није протресена., и у крв истог који се испитује 3 уводи се и минимални раствор формалина.
Крв се слеже у обе епрувете 30 м, након чега се израчунава број тромбоцита у супернатанту. Нормално, разлика у броју тромбоцита не прелази 20 %, са повећаном тенденцијом ка агрегацији, она се повећава.
У случајевима кршења приликом примене основних тестова, која карактерише хемостазу тромбоцита, спровести по потреби за спровођење додатних истраживања. Од њих су најважније.
Додатна испитивања за утврђивање хемостазе тромбоцита
Испитивање броја мегакариоцита у мијелограму и коштаној сржи трепаната са проучавањем морфологије ових ћелија
Значајан пораст броја мегакариоцита у одсецима коштане сржи, обично у комбинацији са мање или више израженим порастом броја тромбоцита у крви, посматрано са еритремијом, хеморагичне и есенцијалне тромбоцитозе и друге мијелопролиферативне болести. Блага мегакариоцитоза, комбиновано са тромбоцитопенијом, карактеристично за тромбоцитопеничну пурпуру (Верлхофова болест).
У аплазији коштане сржи и хипоплазији било које генезе, смањује се као садржај мегакариоцита у одсецима коштане сржи, и број тромбоцита у периферној крви.
Делимична амегакариоцитоза уочена са дефицитом тромбоцитопоетина (ретки облик урођене тромбоцитопеније), појава антимегакариоцитних антитела у крви, суштинска парцијална аплазија мегакариоцита (може претходити развоју леукемије).
Морфолошке и цитохемијске промене мегакариоцита примећене су у многим тромбоцитопатијама..
Електронско-микроскопска студија ултраструктуре тромбоцита
Електронско микроскопско истраживање ултраструктуре тромбоцита је важно за дијагнозу већег броја тромбоцитопатија., у којима нема или оштро смањен број непротеинских гранула високе оптичке густине (који садржи АДП, serotonina, катехоламини, калцијум и други), било протеинске α-грануле, што је карактеристично за бројне тромбоцитопатије, болести групирани у базену, или болести одсуства гранула.
Такође се могу открити оштећења у уређају за уговарање. (систем микротубула) и тромбоцитни лизосоми.
Скенирање електронским микроскопом или испитивање тромбоцита помоћу интерференционе оптике према Номарскију такође може показати оштећења фиксације тромбоцита на страној површини, ширећи их на њему, пуцати формација, централизација и излучивање гранула, што је типично за многе врсте тромбоцитопатија.
Одређивање антитромбоцитних антитела имунофлуоресценцијом- истраживање тромбоцитне суспензије имуноглобулина, повезане са овим ћелијама – метод диксона
Ова софистицирана метода омогућава вам разликовање имунске и неимуне тромбоцитопеније..
Међутим, код најтежих облика болести са озбиљном тромбоцитопенијом је неприхватљиво, с обзиром да је потребна за утврђивање довољно велике количине имуноглобулина (више од 40-50 г 1 Ја) broj trombociti.
Одређивање дугог века обележених аутологних тромбоцита
Утврђивање животног века обележених аутологних тромбоцита омогућава вам да разликујете тромбоцитопенију тромбоцита и нормални животни век тромбоцита у циркулацији (око 9 Ноћи) и облици болести са скраћеним животним веком ових ћелија.
Први се најчешће повезују са смањењем производње тромбоцита у коштаној сржи., други - са њиховом убрзаном смрћу, било са деловањем антитела против тромбоцита (са аутоимуном тромбоцитопенијом, век тромбоцита се смањује на неколико сати), или са интензивним падом ових ћелија у агрегате и крвне угрушке дисеминираном интраваскуларном коагулацијом или масивном тромбозом (потрошња тромбоцитопеније).
Квантитативно одређивање нивоа у плазми пре и после агрегације тромбоцита
Квантитативно одређивање садржаја у крвној плазми пре и после агрегације више фактора тромбоцита - мембранског фосфолипидног фактора 3, садржај α-гранула (антихепарински фактор 4, β-тромбоглобулина, митогени фактор тромбоцита) и непротеинске грануле велике електронско-оптичке густине (Серотонин, катехоламини, АДФ), као и киселе хидролазе.
Ова истраживања дају представу о садржају одговарајућих структура и њихових компоненти у тромбоцитима., о њиховом ослобађању у плазму у процесу агрегације, као и интерно- активација васкуларних тромбоцита, праћен изласком из тромбоцита у крвну плазму с повећањем концентрације у последњој компоненти густих и α-гранула (антихепарински фактор 4, β-тромбоглобулина и др.).
Методе за квантитативно истраживање фактора тромбоцита важне су за идентификацију већег броја тромбоцитопатија. (кршења сигурности гранула и њихових компоненти, пареза реакције ослобађања ових компоненти, повећавајући њихов садржај у крвној плазми због интензивног изнутра- васкуларна адхезија и агрегација тромбоцита итд.). За одређени број тромбоцитопатија карактерише смањење броја фактора тромбоцита 3 или кршење његове доступности за учешће у процесу згрушавања крви.
Испитивање биохемијских карактеристика тромбоцита и њихових појединачних структура
Испитивање биохемијских карактеристика тромбоцита и њихових појединачних структура - строма, грануле, митохондрије и т. д. омогућују вам да документујете везу између различитих врста патологије тромбоцита и дисфункције са одређеним типовима дефицита ензима (недостатак циклооксигеназе, тромбоксанесинтетезе, итд.), са кршењем састава мембранских липопротеина, потребан за интеракцију са агенсима за агрегирање, i t. д.
Такве студије су доступне само добро опремљеним истраживачким лабораторијама и зато се не користе у широкој пракси..
