Cytochemickými štúdium ejakulátu

Cytochemickými reakcie, vykonávané s ejakulátu, poskytuje vhľad do chemického zloženia a funkčnú aktivitu svojich buniek.

Stanovenie kyslá fosfatáza ejakulátu

Acid fosfatázy ejakulátu mnohokrát väčšia, než je jeho aktivita v krvi. Kyslej fosfatázy je súčasťou prostatického sekrétu, jeho výroba je stimulovaná mužského gonadotropínu. Použitie Cytochemické reakcie je detekovaný vo spermy a ďalších bunkách ejakulátu. Aktivita je určená jeho Metóda Goldberg - Barka.

Činidlá.

1. Formol alkohol (jedna časť ready 40 % formalínu rozpustený v deviatich diely 96% etylalkohol).

2. Pararozanilin: 1 g základnej fuchsínu pre Phuc- Kyselina sinosernistoy rozpustené počas zahrievania v 25 ml 2 N kyseliny chlorovodíkovej; chladený, filtrované a skladované v chladničke. Reagent odolný.

3. Vodný roztok dusičnanu sodného 4 %. 4. Roztok metyl-zelená pre acetátového pufra 2 % (pH - 5). Výsledný roztok sa premyje chloroformom, potom mieša približne rovnakým množstvom chloroformu a 2 % metyl-zelený roztok. Spadol v priebehu dňa, a potom sa lakované v purpurovej farby, chloroform sa odstráni s deliacou nálevkou.

5. Inkubatsionnaya prostredie, skladajúci sa z dvoch zložiek.

• Komponenta: 20 mg naftol-A5-fosfát bol rozpustený v 0,5 (0,3) ml dimetylformamidu, pridať 40 ml 0,1 N roztoku octanu sodného a filtruje sa cez filtračný papier; príprava štúdie deň.
• B-zložka: 8 kvapky 4 % dusičnanu sodného, ​​roztok sa zmieša s 8 kvapky pararozanilina; sú ex tempore. Pre získanie obe zložky inkubačného prostredia je spojený (pH 5,2-5,4). Ak je to potrebné, opraviť akékoľvek pH 50 % octová kyselina, roztok hydroxidu alkálií.

Metóda. Čerstvý ejakulát sa odstredí, kedy veľký počet spermií výčapných centrifugácia. Od sedimentu pripraviť leštené sklo tenké ťahy, že, ako aj krvné nátery, vysuší sa na vzduchu. Vysušené pevné škvrny ponorením je v kadičke s formalínom alkoholu 30 z (nie viac) a premyje sa destilovanou vodou. Potom sa šmuhy sa ponorí do kadičky s inkubačnom médiom a umiestni do inkubátora pri teplote 37 ° C 2 žiadna. Potom boli opláchnuté destilovanou vodou, ponorili po dobu 10 min v pohári s roztokom metyl-zelené (kontrastne pre jadrá), rýchlo zmyť vodou, vysušené s filtračným papierom a skúmané ponorným systému mikroskopu,.

Kyslej fosfatázy aktivita môže byť vyjadrená priemerným Cytochemické faktora (SCK) podľa Metóda polukolychestvennomu Astaldi-Verga. Podľa vzorca

SCK =(3* 2 * b * 1)/100

kde čísla v čitateli indikuje intenzitu farieb (maximum - 3, mierne - 2, stopy - 1), a písmená - podľa percentuálneho podielu buniek počítaný určitú intenzitu farieb; figúra 100 v menovateli - celkový počet buniek počíta.

Napríklad, napočítal 100 bunka, z ktorých majú maximálnu intenzitu farieb 20 bunka, mierne - 20 a nasledujúce - 60 bunka. Tu:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6

Fosfatáza kyselina spermie nachádza v jednotke granúl červeno-oranžovej v hornej časti hlavy.

Obsadené chromatín časť hlavy je zelená a neobsahuje kyslej fosfatázy.

Rozptýlenejšia bledá farba na kyslej fosfatázy je detekovaný okolo spodnej časti hlavy, a niekedy sa rozširuje k hrdlu spermie. Stredná Cytochemické koeficient kyslej fosfatázy v normálnom spermií ejakulátu je 2,0-2,4.

V cytoplazme buniek spermatogenézy odhalil hromadeniu granúl, pestro maľovaný v konkrétnych (červeno-oranžový) farba. V podporných bunkách spletité semenných kanálikoch, často ostro pozitívne zafarbené na kyslej fosfatázy, priesvitný non-farebný head (xromatin) spermie. Histiocytov a makrofágy obsahujú niekoľko granúl, pozitívne zafarbené na kyslej fosfatázy. V izolovaných lymfocytov, a niekedy aj neutrofily sú jednotlivé pelety, majúci aktivitu kyslej fosfatázy.

Stanovenie sukcinát dehydrogenázy (SDG) v ejakuláte

Sukcinatdegidrogenaza - Enzým, zúčastňuje redoxných reakcií, obsiahnuté v bunkách, v značnom počte ejakulátu. Avšak povaha zmeny svojej činnosti v rôznych patologických procesov je stále ešte nie je dobre pochopená. Sukcinát dehydrogenázy v bunkách sa stanoví modifikovanou metódou Nartsissova.

Činidlá.

1. Acetón-Trilon (acetón - 60 ml, distillirovannaya voda - 40 ml, Trilon B - 250 mg).

2. Roztok metyl zelené 2 % (rovnaké farbivo, ktorý sa používa pre kyslé fosfatázy).

3. Inkubatsionnaya prostredie, sa skladá z nasledujúcich komponentov:

a) fosfátový pufer (pH 7,2-7,4) - 10 ml;

na) 5,4 % roztoku sukcinátu sodného - 10 ml;

v) Komplexon III (13 zriedený v mg 5 ml destilovanej vody);

g) destilovaná voda - 5 ml;

d) nitrotetrazolium fialová (10 zriedený v mg 10 ml vody).

Všetky zložky sa zmiešajú v jednom balení a uložené v chladničke. Vyrobí sa médium môžu byť znovu použité - pre 10 dní alebo viac.

Metóda. Šmuhy, pripravený z ejakulátu, fixované v acetóne za Trilon- 30 z, premyje destilovanou vodou a vysušia sa na vzduchu. Potom sa šmuhy sa ponorí do inkubačného média a umiestnené do inkubátora pri teplote 37 ° C 1 žiadna, načo sa premyje destilovanou vodou a dokrashivayut metylom zeleňou pre 10 m. Potom znova rýchlo premyje vodou, vysušené s filtračným papierom a skúmané ponorným systému mikroskopu,.

Normálna spermia majú vysokú aktivitu sukcinát dehydrogenázy, zastúpenou veľkými modrými-fialové granúl, že, zlučovanie spolu, vytvorí hustá hmota, plniace hrdlo spermie, niektoré spermie jednotlivé pelety sa nachádzajú okolo hlavy.

Vypočítať spojili granule nie je možná, preto, aby stanovenie aktivity sukcinátdehydrogenáza sfarbené časti spermií merané v mikrometroch. Po celej dĺžke maľované špeciálne pre sukcinátdehydrogenáza spermií sú posudzované na stupni aktivity enzýmu v spermií. S očné mikrometrov a dĺžku objektovo mikrometrov sa meria v konkrétnom farebnej časti 100 spermatozoidax. Pridanie dĺžku počíta v farbených častiach spermií, a vydelením výsledného postavu prostredníctvom 100, obdrží priemernú dĺžku, vyjadrujúci suktsinatdegidrogenaznuyu aktivity pre jednu spermie. Za normálnych okolností, to je 4,3 ± 0,7 m. Tento výpočet LDH aktivita je najviac informatívny a preto sa odporúča použiť na výskumné účely.

Pre široké uplatnenie v praxi, táto metóda je pomerne zložitá, Je výhodné, aby vyjadrenie množstva sukcinát dehydrogenázy Astaldi-metóda Verga. Stredná Cytochemické koeficient LDH spermií v ejakuláte je normálne 2,7 ± 0,3.

V bunkách spermatogenézy Aktivita LDH je detekovaný vo forme zhlukov veľkých modrofialové granúl, často zlúčiť do veľkých zhlukov, sa nachádza v rôznych oblastiach cytoplazmy. Middle Cytochemické faktorom v bunkách spermatogenézy toku 2,0. Pri zrení buniek ejakulátu a zvyšuje aktivitu LDH v zrelého spermií presahuje 2,0. V cytoplazme niektorých lymfocytov nájdených granúl SDG.

Stanovenie aktivity peroxidázy v ejakuláte

Spermie, Spermatogenézy bunky a podporné bunky spletité semenných kanálikoch peroxidázou chýba.

Neutrofilné granulocyty ejakulátu peroxidázy aktivita je vyjadrená v podstatnej miere a môže sa líšiť v závislosti od povahy tohto patologického procesu, ako aj v periférnej krvi. Úroveň aktivity peroxidázy v neutrofiloch, je dôležité zhodnotiť ich funkčný stav a aktivitu zápalového procesu v mužských pohlavných orgánov. Stained šmuhy spermy Graham-Knoll a účtovníctvo aktivity enzýmu Astaldi-Verga sú obdobné krvný náter.

Aktivita peroxidázy v bunkách ejakulátu je určená Spôsob Graham-Knoll.

Činidlá.

1. Formol alkohol (rovnaký, a tým, že kyslé fosfatázy).

2. Peroksidaznыy činidlo: ʙenzidin (na špičke skalpelom) rozpustí v 6 ml 96 % etylalkohol, pridať 4 ml destilovanej vody 0,02 ml 3 % peroxid vodíka. Reagens použiteľný pre 5 až 6 dní.

3. Romanovský Dye v riedení 1-2 kvapiek na 1 ml destilovanej vody.

Metóda. Čerstvé spermie stery boli stanovené pre 30 formalínu s alkoholom, premyje sa tečúcou vodou a vysuší. Potom sa pridá Strokes peroxidázy činidlo pre 5-7 minút, dôkladne premyje v tečúcej vode a sušia. Od tej doby sa dokrashivayut 15 20 min farbivo Romanovský, umytá tečúcou vodou, vysuší a mikroskopiruyut pomocou ponorenie mikroskopu systému.

Keď pozitívne reakcie na peroxidázu v neutrofilných granulocytov odhaľuje veľké zlato-hnedé granule vo veľkých množstvách. Vďaka veľkému počtu bielych krviniek, potrebné pre výpočet Priemerná Cytochemické faktor (SCK). Cytoplazma histiocytov individuálneho peroxidázy je prítomná ako malé zhluky, ako sú granule.

Stanovenie glykogénu v ejakuláte

Zmeny v obsahu glykogénu v rôznych bunkách ovplyvniť ich funkciu alebo dôkazy rozvoja patologického procesu. Stanovenie glykogénu v bunkách sa vykonáva by McManus.

Činidlá.

1. Vodný roztok kyseliny jodistej 1 % (príprava na použitie).

2. Sernistaya voda: 5 ml 10 % metasiřičitan draslík alebo sodík, 5 ml 1 N kyseliny chlorovodíkovej, voda 100 ml (príprava na použitie).

3. Reagent Shiff: 1 g základnej fuchsínu pre kyselinu fuksinosernistoy, vopred rozdrvené v porcelánovej trecej, sa rozpustí za stáleho trepania po dobu 5 min 200 ml vriacej destilovanej vody, prešiel cez papierový filter a bol pridaný za chladenia do 50 ° C 20 ml 1 N kyseliny chlorovodíkovej, a keď sa ochladí na 25 ° C - 1 g draselný alebo disiričitan sodný. Pripravený činidlo sa uchovávať v chladničke pre 24 h po ktorom on osvietený a stávajú nevhodnými na ľudskú spotrebu vitsya

4.Vodný roztok metylom zeleňou 2 %, premyje chloroformom

5.Chemicky čistá metylalkohol.

Metóda.

Tenké sušené šmuhy ejakulát pevne chemicky čistá metyl alkohol 3 m, opláchnuté destilovanou vodou a ponorí do kadičky s 1 % vodného roztoku kyseliny jódu 5 m. Potom šmuhy sa premyjú destilovanou vodou, vysuší, siričitej opláchne vodou a suší sa znovu.

Ďalšie tampóny máčané v šálke s Schiffovým činidlom na 15 m, opláchnite je v troch častiach sírne vody (podľa 3 min každý), premyje 10 min vo vode a bunkových jadrách dokrashivayut 3 min metylová zeleň. Potom znova prepláchne vodou tampóny, Filtračný papier sa vysuší mikroskopiruyut pomocou ponorenia systému mikroskopu.

Vo zrelé spermie chýba glykogén. V cytoplazme mladého spermií, najmä s "golierom", odhalila stopy glykogénu (±), niekedy aj vo forme jednotlivých peliet v hornej časti hlavy, alebo v "golier".

V bunkách spermatogenézy Glykogén je nájdený vo veľkých množstvách vo forme vytvorí čerešňovočervená granule, vyplní celý cytoplazmy. S dozrievanie buniek stratí glykogénu až do jeho zmiznutie v zrelé spermie. Spermatocitы glykogén obsahuje nielen v cytoplazme, ale aj v jadre. V podporných bunkách spletité semenných kanálikoch, glykogén sa vytvorí čerešňovočervená granule a difúznej. Zrelé neutrofilných granulocytov v ejakuláte, rovnako ako v nátere periférnej krvi, obsahujú značné množstvo glykogénu. Pri chronickej prostatitídy v neutrofilných granulocytov ejakulátu výraznému zvýšeniu množstva glykogénu a zvyšuje aktivitu peroxidázy. V ojedinelých lymfocytov sú niekedy nájdené v normálnych glykogénu granule.

Makrofágy obsahovať stopy glykogén pozadí spermy náteroch zafarbených v čerešňovo červené zafarbenie,, čo ukazuje na prítomnosť v plazme ejakulátu veľkého množstva glykosaminoglykánov (mukopolisaxaridov).

Definícia ribonukleovej kyseliny (RNA) v ejakuláte

Zvýšené hladiny RNA v bunkách To ukazuje vysokú aktivitu proti ich rastu, sekretornoй, syntetické a ďalšie aktivity. Zníženie množstva RNA v mladých bunkách často spojená so zníženou schopnosť týchto buniek pre regeneráciu. Obsah RNA v bunkách sa stanoví metóda kurníku.

Činidlá.

1. Reagent Chicken Coop: pripravené oddelene 2 % metyl zelených riešení a pyronin, metyl-zelený roztok sa starostlivo premyje chloroformom; farbivá pracovný roztok sa pripraví zmiešaním 2 % Riešenie pyronin (12,5 ml) a 2 % metyl-zelený roztok (7,5 ml) s prídavkom 30 ml destilovanej vody. Farbivo odolné, uchovávaný v chladničke.

2. Lock - chemicky čistý metylalkohol.

Metóda. Škvrny sú upevnené s metanolom za 3 m, farbivá pracovný roztok pyronin-metylová zeleň 15 m, rýchlo sa prepláchne vodou a sušia sa filtračným papierom. Mikroskopiruyut pomocou ponorenia mikroskopu systému. RNA pyronin maľoval v žiarivo červenej farbe, bunková jadra - metyl zelená zelená.

Zrelé spermie neobsahujú RNA. Bunky sú bohaté na RNA spermatogenézy, čo znižuje počet buniek pri ich splatnosti. V spermatohonyy Cytoplazma bohatú ružovú farbu, v spermatotsytov čo blednutiu, a v spermatidmi svetloružová. V mladom spermií "golier" pink maľoval prevažne "golier".

Spermie, sa nachádza v poslednej fáze jeho vývoja, v podporných bunkách spletitej semenných kanálikoch stratí zvyšky ružovej látky (RNA) a stať sa zrelé spermie.

V bunkách spermatogenézy obsahuje veľké množstvo glykogénu, RNA bola významne vyjadrená LDH aktivitu a CF. Ale, zvyčajne, tieto izolované bunky v ejakuláte, preto počítať CBFV nepraktické. V takých prípadoch, obmedzené na naratívny forme záveru.

Cytochemické charakterizácia leukocytov Je dôležitým ukazovateľom ich funkčné aktivity. Počítanie počtu leukocytov v ejakuláte látky sa vykoná v rovnakom, Rovnako ako v iných bunkách v ejakuláte a periférnej krvi.

V náteroch zafarbených obvyklými metódami ejakulátu (azurozinovymi zmesi, Hematoxylín eozín a ďalšie.), rovnako ako natívny prípravky nie sú vždy ľahké rozlíšiť leukocytov, bunky spermatogenézy, prostaty epitel, histiocyty, a ďalšie prvky.

Cytochemické techniky v spojení s morfologických často pomôže stanoviť druh buniek. Tak, vyjadrené aktivita peroxidázy, poskytované veľké zlaté, hnedé korálky, vyplní celý cytoplazmy buniek, charakteristika zrelých neutrofilov, v iných bunkách, ako je pozorovaná reakcia. Ťažká reakcia na glykogénu je typické pre neutrofily a buniek spermatogenézy, tie však nemajú aktivitu peroxidázy. RNA obsiahnuté v bunkách a spermatogenézy žiadne zrelé granulocyty. Bunky spermatogenézy majú výraznejšie reakcie na kyslej fosfatázy, a neutrofilné granulocyty, ona vyjadrila veľmi zle, a tak ďalej. d.