Studiul citochimice de ejaculare

Reacție citochimice, efectuate cu ejaculat, ofera perspective asupra compoziției chimice și activitatea funcțională a celulelor sale.

Determinarea activității fosfatazei acide de ejaculare

Activitatea Fosfatazei Acide în ejaculare este de multe ori mai mare decât activitatea în sânge. Fosfatază acidă este o parte a prostatei, produse it este stimulată de Hormonii masculini gonadotropnymi. Folosind cytochemical reacţii a detectat în spermă şi alte celule din ejaculat. Activitatea este definit o metodă Goldberg-Barca.

Reactivi.

1. Acid de adipina alcool (o parte a terminat 40 % acid de adipina dizolvat în nouă părţi 96% alcool etilic).

2. Pararozanilin: 1 g fucsină bază pentru Fuk- sinosernistoj acid se dizolvă atunci când încălzirea în 25 ml 2 n acid clorhidric; răcit, filtrat și depozitate în frigider. Reactiv este stabil.

3. Soluţie apoasă de nitrit de sodiu 4 %. 4. Soluţie de metil verde buffer-ul de acetatnom 2 % (PH- 5). Soluția rezultată spălate cloroform, De ce se amestecă cantități aproximativ egale de cloroform si 2 % soluţie de metil verde. Zgudui de multe ori în timpul zilei, şi apoi okrasivšijsâ în cloroform violet eliminate prin pâlnia.

5. Incubare miercuri, format din două componente.

• Şi o componentă: 20 mg-A5-naphthol fosfat dizolvat în 0,5 (0,3) ml dimetilformamidă, adăuga 40 ml 0,1 n soluție de acetat de sodiu și se filtrează prin hârtie de filtru; se prepară zilnic studii.
• Componenta B: 8 picături 4 % Soluție de nitrat de sodiu s-a amestecat cu 8 pararozanilina picaturi; preparate ex tempore. Pentru a obţine ambele componente miercuri incubare se conecteze (pH-ul 5.2-5.4). În cazul în care pH-ul este necesar fie corecta 50 % acetic acid, fie o soluţie de caustice alcaline.

Metodă. Proaspete ejaculat centrifugă, Atunci când un număr mare de sperma fara centrifugare. Nămolurilor fiert tăiat sticlă subţire frotiuri, că, ca pete de sânge, uscate în aer. În continuare uscate frotiuri înregistrare prin scufundare-le intr-o cana cu formalinovym alcool pe 30 de la (nu mai) şi spălate cu apă distilată. Apoi tampoanele inmuiata intr-o cana cu incubare miercuri şi pune în termostat la temperatura 37 ° C 2 h . Apoi clatiti-le cu apă distilată, se scufundă 10 minele din Cupa cu o soluţie de metil verde (pentru miezuri de dokrašivaniâ), se spală rapid apa, hârtie de filtru uscată şi de a explora folosind sistemul de microscop imersiune.

Activitatea fosfatazei acide pot fi exprimate folosind raportul de mediu citohimičeskogo (SCK) de polukoličestvennomu metoda Astal′di-Verga. Conform formulei

SCK =(3*si + 2 * b + 1 *)/100

în cazul în care numerele de la numărător indica intensitatea de colorat (maxim - 3, moderată- 2, urme- 1), şi scrisori-procentul de celule numărate o anumită intensitate de colorare; figura 100 numitorul este numărul total de celule numărate.

De Exemplu, considerate 100 celulă, dintre ele cu o intensitate maximă de colorat 20 celulă, cu moderat- 20 şi cu urme de- 60 celulă. De aici:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1.6

Spermatozoid în fosfatazei acide se află în formă de un singur granule mari de roşu-portocaliu în capete de Departamentul de top.

Luate de cromatinei capului este verde şi conţine nici fosfatazei acide.

Mai palid colorat difuze pe fosfatazei acide este detectat în jurul partea de jos a capului, si uneori se extinde de la gat de un spermatozoid. Coeficientul mediu de cytochemical fosfatazei acide în ejaculare sperma normala este 2.0-2.4.

În citoplasma celulelor germinale imature sunt detectate prin acumularea de granule, okrašivaûŝihsâ luminoase în specifice (roşu-portocaliu) culoare. În celulele justificative ale tubilor seminiferous complicate, multe ori dramatic colorate pozitiv pentru fosfatazei acide, prosvečivaûtsâ capete nevopsită (cromatinei) spermă. Histiocytes şi macrofage conţin câteva granule, pozitiv pătat de fosfatazei acide. În limfocite izolate, şi, uneori, granoulozitah neutrofile satisface individuale granule, activitatea Fosfatazei Acide nucleare.

Determinarea activității de succinat dehidrogenaza (SDG) in ejaculat

Sukcinatdegidrogenaza - Enzime, implicate în reacţii redox, conţinute în celulele de ejaculare într-un număr semnificativ de. Cu toate acestea, natura sa de schimbări de activitate în diverse procese patologice nu este încă bine înţeles. Activitatea a succinat dehidrogenazei în celule este determinat prin metoda Narcissova modificat.

Reactivi.

1. Acetonă-trilon (acetonă este 60 ml, apă distilată este 40 ml, Trilon b 250 mg).

2. Soluţie de metil verde 2 % (colorant acelaşi, care este folosit pentru fosfatazei acide).

3. Incubare miercuri, alcătuit din următoarele componente::

și) tampon fosfat (pH 7,2-7,4) - 10 ml;

la) 5,4 % soluţie de sodiu succinat- 10 ml;

în) trilona b (13 mg arunca 5 ml apă distilată);

g) apă distilată este 5 ml;

d) nitrotetrazoliâ mov (10 mg arunca 10 ml de apă).

Toate componentele sunt amestecate într-o sticlă şi magazin în frigider. Miercuri terminat poate fi utilizat de mai multe ori în cadrul 10 zi sau mai mult.

Metodă. Accidente vasculare cerebrale, realizate din ejaculat, fix în acetonă-trilone în timpul 30 de la, se spală cu apă distilată și uscat în aer liber. Apoi tampoanele muiată în incubare miercuri şi pune în termostat la temperatura 37 ° C 1 h , apoi se spală cu apă distilată şi dokrašivaût metil verde în timpul 10 m. Apoi din nou rapid spălată cu apă, hârtie de filtru uscată şi de a explora folosind sistemul de microscop imersiune.

Sperma normale au o mare activitate de succinat dehidrogenaza, transmise de granule mari de albastru-violet, că, îmbinarea între un, formeze o masă densă, sperma de gâtul de umplere, unele sperma individuale granule se găsesc în jurul capului.

Calcul fuziunea cu pelete reciproc nu este posibilă, Prin urmare, pentru a determina activitatea succinat dehidrogenazei pictat o parte din sperma măsoară în micrometri. Pe lungimea specifice pictate pe sukcinatdegidrogenazu parte a capului sperma este judecat pe gradul de activitate a enzimei în acest spermatozoide. Folosind un micrometru ocular, micrometru şi măsurat lungimea decorează în mod special în 100 sperma. Îndoite lungime colorate parcele numărate spermatozoid şi împărţirea Cifra rezultată de 100, Lungimea medie a lua, exprimarea sukcinatdegidrogenaznuû activitatea pentru o sperma. OK este 4.3 ± 0,7 μm. Această activitate SDG cel mai informativ de numărare şi de aceea este recomandat pentru utilizare în scopuri ştiinţifice.

Pentru aplicarea pe scară largă în practică, această metodă este oarecum complicata, Este de preferat să-şi exprime numărul de succinat dehidrogenazei în Astal′di metoda-Verga. Coeficientul mediu de cytochemical SDG spermatozoizilor într-un ejaculat normal este 2,7 ± 0,3.

În celule a spermatogenezei SUCCINAT DEHIDROGENAZEI activitate este detectat în formă de clustere de granule mari de albastru-violet, adesea fuzionează în bucati mai mari, situate în diferite părţi din citoplasmă. Coeficientul mediu de cytochemical în celule a spermatogenezei nu ajunge 2,0. Ca maturarea celulelor activitate creşte şi SDG ejaculare în mature sperma depăşeşte 2,0. În citoplasma unor limfocite descoperit granule mari SDG.

Determinare a peroxidazei în ejaculare

În spermă, celulele a spermatogenezei si celulele justificative tubilor seminiferous complicate peroxidaza lipseşte.

In ejaculat neutrofile granoulozitah peroxidazei exprimată în puternic și poate varia în funcţie de natura procesului patologic, precum şi în sângele periferic. Nivelul de activitate a peroxidazei în granoulozitah neutrofile este important pentru evaluarea stării funcţionale şi activitatea inflamatorie în organele genitale masculine. Accident vascular cerebral de Graham Knollû-ejaculare şi contabilitate activitatea unei enzime de Astal′di de colorat este similar cu tuşe de sânge a avut loc Casa Vergu.

Peroxidazei în celulele de ejaculare este determinată de Metoda lui Graham-Knollâ.

Reactivi.

1. Acid de adipina alcool (același, în ceea ce priveşte fosfatazei acide).

2. Peroksidaznyj reactiv: ʙenzidin (la vârful de bisturiu) dizolvat în 6 ml 96 % alcool etilic, adăuga 4 ml de apă distilată 0,02 ml 3 % apă oxigenată. Reactiv este apt să mănânce în termen de 5-6 zile.

3. Colorant Romanowski la 1-2 picaturi de reproducere pe 1 ml apă distilată.

Metodă. Proaspete ejacula record de accident vascular cerebral în timpul 30 cu alcool de formalinovym, spălate cu jet de apă şi uscat sus. Apoi se toarna peroksidaznym reactiv contururi 5-7 min, spălați bine sub jet de apă şi uscat sus. După lor 15-dokrašivaût 20 min colorant Romanowski, se spală cu apă curentă, uscate şi mikroskopiruût folosind sistemul de microscop imersiune.

Cu reacţie pozitivă pentru a peroxidazei în neutrofile granoulozitah detectat mare auriu-cafeniu granule într-un număr semnificativ de. Atunci când un mare număr de celule pe care doriţi să număraţi coeficientul mediu de cytochemical (SCK). În citoplasma histiocytes conţin peroxidaza izolat în grupuri de aceeaşi pelete.

Determinarea de glicogen în ejaculare

Modificările de conţinut de glicogen în celule diferite afectează funcţia lor sau atesta dezvoltarea procesului patologic. Se efectuează determinarea de glicogen în cuşti Metoda de Manus marius.

Reactivi.

1. Soluţie apoasă de iod acizi 1 % (pregătirea pentru utilizare).

2. Apa sulfuroasa: 5 ml 10 % ca metabisulfita de potasiu sau sodiu, 5 ml 1 n acid clorhidric, apă până la 100 ml (pregătirea pentru utilizare).

3. Reactiv Schiff: 1 g bază fucsină acidului fuksinosernistoj, pre pisate într-un mojar portelan, se dizolvă cu agitare constantă în timpul 5 min în 200 ml de apă distilată fiartă, trece printr-un filtru de hârtie şi se adaugă de răcire a 50 ° C 20 ml 1 n acid clorhidric, şi atunci când de răcire în jos pentru a 25 ° C este 1 g metabisulfita de potasiu sau sodiu. Preparate de reactiv stand in frigider pentru 24 h după care el clarifică şi familiile Stano adecvate pentru consumul uman

4.Soluție apoasă de metil verde 2 %, spălate cloroform

5.Chimic pure alcool metilic.

Metodă.

Frotiul uscate subţiri ejaculat fix metilovam chimic pure alcool în timpul 3 m, clătire cu apă distilată şi dipped într-o ceaşcă cu 1 % soluţie apoasă de iod acizi pe 5 m. Apoi frotiul se spală cu apă distilată, uscate, clătiţi în apa sulfuroasa si uscate din nou.

În continuare în jos accidente vasculare cerebrale în pahar cu reactiv Schiff 15 m, Clătiţi-le în trei porţiuni de apa sulfuroasa (de 3 min fiecare), Spălaţi 10 min în nuclee de apă şi dokrašivaût 3 metil m verde. Apoi opolascerve de apă accidente vasculare cerebrale, hârtie de filtru uscată şi mikroskopiruût folosind sistemul de microscop imersiune.

În mature sperma lipseşte glicogen. În citoplasma tineri sperma, mai ales cu "guler", Detectat urme de glicogen (±), uneori, sub formă de granule individuale în partea de sus a capului sau în guler".

În celule a spermatogenezei Glicogenul se găseşte în cantităţi mari în formă de granule de cires-rosu, popula toate citoplasmă. Ca maturizarea celulelor pierde lor glicogen până la dispariţia lui în mature sperma. Spermatotsity contin glicogen nu numai în citoplasmă, dar în nucleul. În celulele justificative ale tubilor seminiferous complicate glicogen este poziţionat ca un granule de roşii cherry şi difuze. Granulocite neutrofile mature în ejaculare, la fel ca frotiul de sânge periferic, conţin cantităţi semnificative de glicogen. În cazul în care ejacula prostatita cronică în neutrofile granoulozitah este foarte mult creşterea glicogenului şi peroxidazei activităţii. În limfocite izolate în mod normal, uneori granule de glicogen.

Macrofage conţine urme de glicogen Von frotiuri ejaculare se transformă cherry red, sugerează că o cantitate mare de glicozaminoglicani de plasmă ejaculare (mukopolisaxaridov).

Determinarea acidului ribonucleic (ARN) in ejaculat

Niveluri ridicate de ARN in celulele dovezi de activitate ridicat pe creştere, secretorii, sintetice şi alte activităţi. Reducere de ARN in celulele tinere adesea asociate cu a scăzut capacitatea acestor celule pentru a regenera. Conţinutul de ARN în celule este determinat de Kurnika metoda.

Reactivi.

1. Kurnika reactiv: se prepară separat 2 % soluţii de metil verde şi pironina, soluţie de metil verde bine spălate cu cloroform; colorant soluţie preparată prin amestecarea de lucru 2 % solutie pironina (12,5 ml) și 2 % soluţie de metil verde (7,5 ml) cu adaos de 30 ml apă distilată. Rezistent la pete, stocate în frigider.

2. Retinere este chimic pure alcool metilic.

Metodă. Fix contururi metilovam alcool în timpul 3 m, vopsea soluția de lucru de pironin-metil verde 15 m, rapid opolascerve apă şi hârtie de filtru uscată. Mikroskopiruût folosind sistemul de microscop imersiune. RNA se transformă pironină în luminoase de culoare roşie, nucleii-metil verde la verde.

Spermatozoizi maturi nu conțin RNA. Celulele de spermatogenezei sunt bogate în RNA, suma de care scade în celulele ca maturizarea lor. Din spermatogony citoplasma bogat culoare roz, din spermatocitov Este pop, și face spermatids palid-roz. Tinerii au sperma "guler" Roz pictat predominant "guler".

Spermă, sunt în etapele finale de dezvoltare, în sprijinul complicate tubilor seminiferous celulele pierd substanţa roz de reziduuri (ARN) şi să crească în mature sperma.

Celule germinale imature conţine cantităţi mari de glicogen, ARN şi mult activitatea exprimate şi KF SDG. Dar, obișnuit, Aceste celule singură în ejaculare, Deci, de numărare SCK design. În astfel de cazuri se limitează la formă narativă încheierii.

Cytochemical caracteristici ale leucocitelor un indicator important al activităţii lor funcţionale. Numărul de substanţe în leucocite ejacula doar ca, ca şi în alte celule şi sânge periferic în ejaculare.

În convenţionale frotiuri colorate ejaculare (amestecuri de azurozinovymi, hematoxilină-eozina, etc.), precum şi nativ medicamentele nu sunt întotdeauna uşor să se distingă între leucocite, Celulele de spermatogeneză, Epiteliul de prostată, histiocytes şi alte elemente.

Metode cytochemical coroborat cu morfologice ajuta de multe ori stabilit tipul de celule. Așa, exprimată ca peroxidazei, furnizate de granule mari auriu-maro, citoplasma celulei de umplere, caracteristică a granulocitelor neutrofilica matur, alte celule acest răspuns nu se produce. Reacţia exprimate pe glicogen este tipic neutrofilica granulocitelor și a celulelor de spermatogenezei, dar acesta din urmă nu au peroxidazei. RNA este conţinută în celule a spermatogenezei si absente în matur granoulozitah. Celulele de spermatogenezei au pronunţat Reacþia fosfatazei acide, şi în neutrofile granoulozitah a exprimat foarte prost, şi aşa mai departe. d.