Anemie, datorată deficienței de activitate al glucozei-6-fosfat dehidrogenază

Activități de deficit de glucoză-6-fosfatdegidrogenazы (G-6-FD) - Este cea mai frecventa anomalie genetica a celulelor rosii din sange, rezultând în criză hemolitic, asociate cu a lua o serie de medicamente mijloace. În afara crizele din majoritatea pacienti care au suferit o stare de compensare totală, deși individul are un anemie hemolitica permanent loc.

Prima descriere activitate deficit de G-6-PD a fost făcută în 1956 g. de persoane, luând profilactic primaquine medicament impotriva malariei. Indiferent de aceste studii 1957 g. Acesta a fost descoperit deficit de G-6-PD in celulele rosii din sange ale pacientului, care a observat periodic criză hemolitică, fără a lua orice medicamente.

Descris în prezent mai mult 250 diferite forme mutante ale G-6-PD. Acestea diferă unele de altele în mobilitatea electroforetică a enzimei, afinitatea acestuia pentru substraturi - glucoză 6-fosfat și nicotinamid (NADf) O consecință a afinitatea redusă este activitatea enzimei insuficientă într-un, atunci când concentrația substraturilor este strict limitată de rata de formare a acestora în reacția anterioară. Lipsa de activitate nu sunt, în majoritatea cazurilor, înseamnă pierderea a enzimei ca atare, chiar dacă pot exista și cazuri. Cel mai adesea, lipsa sau reducerea activității enzimatice - rezultatul prezenței pacientului său într-o formă patologică de inactive.

Gene structurale și de control a genei, Sinteza obuslovlivaûŝie de G-6-FD, situat pe cromozomul X, Cu toate acestea moștenire deficit de această activitate enzime în eritrocite întotdeauna angajat cu X-cromozom.

Există două forme principale ale mutant, în care substituții de aminoacizi nu se referă la centrele de activi, și, prin urmare ambele mutatii răspândite sunt normale. Acestea diferă în mobilitatea electroforetică, Cu toate acestea, afinitatea pentru substratul ei sunt la fel. În nomenclatura modernă, unul dintre aceste forme, comune în Europa, BB numit formă, iar celălalt, găsite în Africa - Formularul A. Actualmente descris și alte forme mutante ale, care de asemenea nu au diferit unul de altul prin parametrii cinematici, dar au o mobilitate electroforetică diferite.

Podele enzimă ambreiaj oferă o predominanță semnificativă a bărbaților în rândul persoanelor cu boala simptomatica. Se observă în masculi homozigoți, aceasta patologie moștenit de la mama ei, cu X-cromozom, femeile homozigote (moștenit boala de la ambii părinți) și o parte din femeile heterozigote, mostenirea bolii de la un parinte cu fenotipului mutant exprimată.

Frecvent activitate deficit de G-6-PD apare în Europa, situat pe coasta mediteraneană, Grecia, Italia, precum și în unele țări din America Latină, Africa, etc..

Poate, că acumularea extrem de mare al unei gene anormale într-un număr de așezări contribuie la obiceiul de a căsătoriilor consanguin, ceea ce duce la acumularea unei populații de femei homozigote, oferindu manifestări clinice severe ale bolii de multe ori, decât transportatorii heterozigote, și crește probabilitatea de nastere masculi homozigoți, și, de asemenea, utilizate pe scară largă în trecut, în aceste locuri malarie falciparum.

Conform ipotezei curent, persoană, Deficitul imeûŝie G-6-FD, mai ușor de a tolera malariei tropicale și rareori mor din cauza bolii. În favoarea acestei ipoteze este faptul de răspândire inegală a parazitului în rândul femeilor celule rosii din sange heterozigote. S-a găsit, în celulele normale care conțin o cantitate mult mai mare de parazit, decât cu deficit. Există două explicații pentru acest fapt presupusa. Prima dintre acestea: Deficitul de eritrocite din G-6-PD nu este capabil să reziste la efectele parazitului și imediat împarte în macrofagele fagocitare, unde a ucis Plasmodium. O altă perspectivă sugerează neobhodmost pentru dezvoltarea parazitului glutation redus, cantitatea de care este redus în eritrocite cu deficit de G-6-PD.

Etiologia și patogeneza

Prima etapă a expunerii la medicament - de transformare a lor în organism, trecerii la forma activă, care poate determina modificări în structura membranei de eritrocit. Forma activă a medicamentului reacționează cu oxihemoglobină. Aceasta produce o anumită cantitate de peroxid de hidrogen.

Sistemul peroxidază glutation redus folosind neutralizează unele peroxid parte, o reacție de reducere este glutationul oxidat.

У здоровых людей острый гемолитический криз развивается при введении значительного количества лекарственного средства (токсическая доза). Криз может возникнуть тогда, когда системы восстановления глутатиона не в состоянии справиться с избытком образовавшихся комплексов и окисленного глутатиона. При дефиците активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и нарушенном восстановлении НАДФ, несмотря на нормальную активность редуктазы глутатиона, нарушено его восстановление, так как отсутствует нормальный источник водорода. Восстановленный глутатион не может противостоять окислительному действию обычных лечебных доз лекарственных средств. Это приводит к окислению гемоглобина, потере гема из молекулы гемоглобина, выпадению в осадок цепей глобина. Селезенка освобождает эритроциты от телец Гейнца. При этом теряется часть поверхности эритроцитов, что приводит к их гибели.

В патогенезе гемолитической анемии, связанной с употреблением в пищу конских бобов, еще много неясного. Примахиновая анемия (фавизм) развивается лишь у некоторых лиц с дефицитом активности Г-6-ФД. Probabil, для проявления этой анемии требуется сочетание двух ферментативных дефектов. Poate, что речь идет о недостаточном обезвреживании у некоторых лиц токсического вещества, содержащегося в конских бобах, или об образовании какого-то метаболита, вызывающего нарушения в сульфгидрильных группах эритроцитов. У здоровых лиц прием небольшого количества конских бобов не вызывает выраженной гемолитической анемии, так как при наличии восстановленного глутатиона эритроциты в состоянии противодействовать токсическому эффекту метаболита. Наследование этого дефицита, aparent, аутосомное доминантное. При сочетании необычного превращения в организме токсического вещества, содержащегося в конских бобах, с дефицитом активности Г-6-ФД проявляются клинические признаки примахиновой анемии.

Manifestarile clinice

Эксперты ВОЗ подразделяют варианты Г-6-ФД в соответствии с клиническими проявлениями у гомозиготных больных и уровнем активности в эритроцитах на четыре класса.

Первый класс — варианты, которые сопровождаются хронической гемолитической анемией.

Второй класс — варианты с уровнем активности Г-6-ФД в эритроцитах 0— 10 % din norma, носительство которых обусловливает отсутствие гемолитической анемии вне криза, и кризы, связанные с приемом лекарственных средств или употреблением конских бобов.

Третий класс — варианты с уровнем активности в эритроцитах 10—60 % din norma, при которых могут наблюдаться легкие клинические проявления, связанные с приемом лекарственных средств.

Четвертый класс — варианты с нормальным или близким к норме уровнем активности, не сопровождающиеся клинической патологией.

При рождении ребенка наблюдается гемолитическая анемия, относящаяся как к первому, так и ко второму классу дефицита Г-6-ФД.

Уровень активности Г-6-ФД в эритроцитах не всегда коррелирует с тяжестью клинических проявлений. При многих вариантах первого класса определяется 20—30 % уровень активности фермента. Pe de altă parte, при нулевом уровне активности у некоторых больных не наблюдается никакой клинической симптоматики. Это связано, În primul rând, со свойствами лутантных ферментов, În al doilea rând, cel mai probabil, со скоростью обезвреживания лекарственных средств цитохромным аппаратом печени больного.

Наиболее часто дефицит активности Г-6-ФД не дает клинических проявлений без специальной провокации гемолитического криза. В большинстве случаев гемолитический криз начинается после приема сульфаниламидных препаратов (норсульфазола, стрептоцида, сульфадиметоксина, сульфацил-натрия, этазола, бисептола), противомалярийных средств (примахина, xinina, акрихина), нитрофурановых препаратов (furazolidona, furadonina, фурагина, 5-НОК, невиграмона), препаратов изоникотиновой кислоты (тубазида, фтивазида), ПАСК-натрия, а также нитроглицерина.

Из противомалярийных препаратов при дефиците активности Г-6-ФД может быть назначен делагил, из сульфаниламидных — фталазол. Ряд препаратов, вызывающих в больших дозах гемолитические кризы, в малых дозах может быть использован при дефиците активности Г-6-ФД. К ним относятся ацетилсалициловая кислота, amidopirin, фенацитин, levomicetin, Streptomicină, противодиабетические сульфаниламидные препараты.

Все лекарственные средства, способные вызывать гемолитические кризы, катализируют окислительную денатурацию гемоглобина молекулярным кислородом.

Клинические проявления заболевания могут возникать на вторые-третьи сутки от начала приема лекарственных средств. Вначале появляются легкая желтушность склер, urină închisă la culoare. При прекращении приема препарата в этот период тяжелый гемолитический криз не развивается. Если лечение продолжается, на 4—5-е сутки может возникнуть гемолитический криз с выделением мочи черного или иногда бурого цвета, что связано с внутрисосудистым распадом эритроцитов. Содержание гемоглобина может снизиться на 2—3 %.

При тяжелом течении заболевания повышается температура тела, появляются резкая головная боль, durere la nivelul extremităților, vărsături, иногда — понос. Возникает одышка, снижается артериальное давление. Часто увеличивается селезенка, иногда — печень.

В редких случаях развивается недостаточность почек, связанная с резким снижением почечной фильтраций и закупоркой почечных канальцев кровяными сгустками.

Rezultatelor de laborator

При исследовании крови выявляется анемия с повышением количества ретикулоцитов. Наблюдается увеличение числа лейкоцитов со сдвигом до миелоцитов. La unii pacienți,, în special la copii, количество лейкоцитов иногда может повыситься до значительных цифр (100 T în 1 l și mai mult). Число тромбоцитов не изменяется. При окраске эритроцитов кристаллическим фиолетовым в период тяжелых гемолитических кризов обнаруживается большое количество телец Гейнца.

Выявляется резкое раздражение красного ростка костного мозга. Повышается содержание свободного гемоглобина сыворотки, часто повышен уровень билирубина за счет непрямого. С помощью бензидиновой пробы выявляется присутствие в моче гемоглобина без эритроцитов, иногда обнаруживается гемосидерин.

При некоторых формах недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы наблюдается самоограничение гемолиза, t. este. гемолитический криз обрывается, în ciuda, что больной продолжает принимать лекарственное средство, которое вызвало гемолитический криз. Способность к самоограничению гемолиза обусловлена повышением почти до нормальных цифр уровня активности фермента в ретикулоцитах. При большинстве форм он значительно снижен.

У детей тяжелые гемолитические кризы наблюдаются чаще, decât la adulți. При выраженном дефиците активности Г-6-ФД они возникают иногда сразу после рождения. Это гемолитическая болезнь новорожденных, не связанная с иммунологическим конфликтом. Она может протекать так же тяжело, как и гемолитическая анемия, обусловленная резуснесовместимостью матери и плода. Возможно наличие ядерной желтухи с тяжелейшей неврологической симптоматикой.

Патогенез этих кризов изучен недостаточно. Пока не выяснено, наступают ли эти кризы спонтанно в связи с физиологической недостаточностью активности фермента пероксидазы глутатиона при рождении или причиной их является употребление определенных антисептических средств при обработке пуповины ребенка. Poate, что иногда кризы связаны с приемом матерью некоторых лекарственных средств.

In unele cazuri гемолитические кризы при дефиците активности Г-6-ФД возникают на фоне инфекционных заболеваний: Gripă, сальмонеллеза, вирусного гепатита. Кризы могут быть спровоцированы также ацидозом при сахарном диабете или недостаточности почек.

У небольшой части больных с дефицитом активности Г-6-ФД наблюдается постоянная гемолитическая анемия, asociate cu luarea de droguri. В этих случаях отмечаются небольшое увеличение селезенки, умеренная нормохромная анемия с повышением содержания ретикулоцитов, эритрокариоцитов в костном мозге и уровня билирубина. Обострение заболевания возможно либо после приема указанных выше лекарственных средств, либо на фоне инфекций.

Diagnostics

Основой для диагностики этой недостаточности ферментом эритроцитов является определение активности Г-6-ФД у пробанда и его родственников. Из качественных методов, применяемых для этой цели, следует рекомендовать два наиболее простых метода.

Metodă Bernstein дает возможность не только диагностировать дефицит активности Г-6-ФД у всех гемизиготных мужчин, гомозиготных женщин, но и приблизительно оценивать степень дефицита этого фермента у гетерозиготных женщин. Этим методом удается выявить около 50 % гетерозиготных женщин. Преимуществом этого метода является пригодность его для использования при массовом обследовании населения в экспедиционных условиях.

Метод основан на обесцвечивании красителя 2,6-дихлорфенолиндофенол а при его восстановлении. В присутствии Г-6-ФД происходит окисление глюкозо-6 фосфата и восстановление НАДФ с образованием НАДФ-Н. Это вещество восстанавливает феназинметасульфат, которой в свою очередь восстанавливает 2,6-дихлорфенолиндофенол. Феназинметасульфат действует в этой реакции как очень активный переносчик электронов от НАДФ-Н к красителю. Без феназинметасульфата реакция идет несколько часов, а в присутствии феназинметасульфата обесцвечивание происходит за 15— 30 m.

Reactivi.

1. Раствор НАДФ: 23 мг НАДФ растворяют в 10 ml de apă.
2. Раствор глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф): 152 мг натриевой соли глюкозо-6-фосфата растворяют в 10 ml de apă. Бариевая соль глюкозо-6-фосфата должна быть предварительно переведена в натриевую соль. Для этого взвешивают 265 мг бариевой соли глюкозо-6-фосфата, dizolvat în 5 ml de apă, adăuga 0,5 ml 0,01 М раствора соляной кислоты и 1 мг сухого сульфата натрия. Осадок центрифугируют. Надосадочный слой нейтрализуют 0,01 М раствором едкого натра и доводят дистиллированной водой до 10 ml.
3. Раствор феназинметасульфата: 2 мг феназинметасульфата растворяют в 100 мл трис-буфера 0,74 M; pH 8,0.
4. Раствор красителя 2,6-дихлорфенолиндофенола (натриевой соли): 14,5 мг красителя растворяют в 100 мл буферного раствора трис-соляной кислоты (0,74 M; pH 8,0). Буферный раствор готовят из 1,48 М раствора трис-гидроксиметиламинометана (42,27 d din 250 ml de apă) și 1,43 Soluție M de acid clorhidric (2 ампулы фиксанала, conține 0,1 г-экв, доводят водой до 135 ml). K 230 мл раствора трис-гидроксиметиламинометала добавляют 110 ml acid clorhidric, доводят рН до 8,0 и добавляют воду до 460 ml.

Перед применением готовят смесь реактивов: 1 h . раствора НАДФ (1), 1 h . раствора Г-6-Ф (2), 2 h . раствора феназинметасульфата (3) și 16 h . раствора 2,6-дихлорфенолинодофенола (4).

Metodă.

В пробирку, conține 1 ml apă distilată, contribui 0,02 ml de sânge.

После наступления гемолиза добавляют 0,5 мл смеси реактивов. Результаты учитывают через 30 m. Реакцию расценивают как нормальную при полном обесцвечивании красителя. Unde, когда обесцвечивание красителя не происходит (остается интенсивно сине-зеленый I цвет), реакцию оценивают как резко-положительную. Если интенсивность окраски уменьшается, но сине-зеленый цвет остается, реакцию считают поло-жительной. Unde, когда происходит явное обесцвечивание, но при сравнении с контролем остается зеленоватый оттенок, реакцию расценивают как плюс-минусовую.

Резкоположительные и положительные реакции наблюдаются у гемизиготных мужчин и гомозиготных женщин. Иногда гетерозиготные женщины дают положительную реакцию, но чаще плюс-минусовую. În afară de, plus-minus răspuns uneori observate la persoane perfect sănătoase cu unele scădere în activitatea enzimei pe fondul unor boli sau a lua medicamente. Plus-negative reacţie ar trebui să fie luate în considerare şi verificaţi dacă metoda cantitativă a enzimei de activitate doar atunci când femeile au suspectat de anemie hemolitică, cauzate de o deficienta de activitatea glucozo-6-fosfat dehidrogenaza. Nu ar trebui să țină cont plus-congelare reacţie în masă sondaj.

Reacție pozitivă eronate poate fi exprimat la pacienţii cu anemie din cauza faptului, ce 0,02 ml de sânge, ca tubul, conţine o cantitate mică de celule roşii din sânge şi, Prin urmare, o cantitate mică de enzime. În acest caz, epruvetă cu apă distilată ar trebui să adăugaţi două sau trei pipete (de 0,02 ml) sânge, pentru a colora aceste tuburi de test înainte de adăugarea de colorant nu diferă de control.

Metoda de pete fluorescente Beutler şi Mitchell bazat pe fluorescența specifice reduse FDAN în lungime de unda de lumină ultravioletă (440- 470 nm), evaluate vizual în termene fixe.

Reactivi.

1. Tampon TRIS-HCl 0,5 M; pH 8,0: 60,55 Teresa dizolvat în 800 ml apă distilată, adăuga 20 ml concentrat HCl, aduce pH-ul 8,0 cu ajutorul 2 M soluţie de HCl şi se adaugă apă până la 1 ml; solutie magazin pentru a 36 zile la temperatura de 4° c.
2. Раствор глюкозо-6-фосфата 20 M: 6 Sarea de glucozo-6-fosfat dizolvat în mg 1 ml apă distilată; Stocaţi până la 2 zile la temperatura de 4° c.
3. Раствор НАДФ 10 M: 8 мг НАДФ растворяют в 1 ml apă distilată; Stocaţi până la 10 zile la temperatura de 4 ° C.
4. Soluție apoasă de saponina 1 % Stocaţi până la 20 zile la temperatura de 4 ° C.
5. Soluţie de oxidat de glutation (10 ml): 2,4 glutation mg dizolvat în 1 ml apă distilată; Stocaţi până la 10 zile la temperatura de 4° c.

Metodă.

Înainte de definiţi amestec de incubare Cook, amestecarea 1 h . soluţie de glucoză-6-fosfat, 1 h . soluţie PESTE Ph, 2 h . soluţie de saponina, 5 h . tampon şi 1 h . soluţie de glutation. Sânge (0,01 ml) puse în eprubete sau celule placi de gemaggljutinacionnoj şi se adaugă 0,2 ml de amestec de incubare. Prin 15 min micropipetă selectaţi o picătură de amestecuri de incubare (0,02 ml) din fiecare probă şi le-a pus pe hârtie sub formă de hromatograficheskuju pata diametru 10-12 mm. Petele sunt uscate la aer la temperatura camerei şi vizualizare sub lumina ultravioleta pentru evaluarea fluorescenta. Eșantioanele de control sunt cunoscute a fi sanguine normale. Reactivi de control al calității conține nici sânge.

Evaluarea rezultatelor.

Lipsa de fluorescenta indică faptul că nu există nici o activitate, prezenţa de fluorescenta (strălucire intensă albastru) -Disponibilitate de activitate, ca strălucire slabă-intermediar reacţie. În condiţiile experimentului metoda da rezultate fals negative. Sursă de diagnostic fals pozitiv poate fi supravegheat și-au exprimat anemie, dar într-o măsură mult mai mică, decât metoda Bernstein. Chiar şi când se observă anemie exprimate, reacţia intermediare, mai degrabă decât lipsa de fluorescenta.

Utilizarea metodei cantitative de determinare activitate de g-6-PD dă posibilitatea de a identifica încetinire nu numai în gemizigotnyh şi homozigotă pacienţii, dar femeile geterozigot. Pentru Că, că numărul de reticulocite şi rata de culoare afectează nivelul de activitate enzimatică, Se recomandă să se modifice rezultatele ținându-se cont de aceşti indicatori.