Badanie ejakulatu cytochemiczne

Reakcja cytochemiczne, prowadzone z ejakulatu, zapewnia wgląd składu chemicznego i aktywności funkcjonalnej jej komórek.

Oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej ejakulatu

Aktywność fosfatazy kwasu wytrysk wiele razy większe niż jego działalności we krwi. Kwas fosfatazy jest częścią wydzieliny prostaty, jego produkcja jest stymulowana przez gonadotropiny mężczyzn. Stosując reakcje cytochemiczne jest wykrywany w nasieniu i inne komórki spermy. Aktywność jest określana przez jego Metoda Goldberg - Barka.

Odczynniki.

1. Formalina alkoholu (jedna część gotowa 40 % formaliny rozpuszcza się w dziewięciu częściach 96% alkohol etylowy).

2. Pararozanilin: 1 g fuksyna zasadowa dla Phuc- Kwas sinosernistoy rozpuszcza się podczas ogrzewania w 25 ml 2 N kwas solny; chłodzone, przesączono i przechowywano w lodówce. Odczynnik odporne.

3. Wodny roztwór azotanu sodu, 4 %. 4. Roztwór zieleni metylowej w buforze octanowym 2 % (pH - 5). Otrzymany roztwór przemyto chloroformem, następnie miesza się w przybliżeniu równe ilości chloroformu 2 % metyl zielony roztwór. Spadł w ciągu dnia, a następnie malowane na kolor fioletowy, chloroform usuwa się z rozdzielacza.

5. Środowisko Inkubatsionnaya, składający się z dwóch części.

• Komponent: 20 mg naftolo-A5-fosforanu rozpuszcza się w 0,5 (0,3) ml dimetyloformamidu, dodać 40 ml 0,1 N roztwór octanu sodu i przesączono przez bibułę filtracyjną; przygotowanie dniowe.
• Komponent B: 8 krople 4 % Roztwór azotanu sodu miesza się z 8 spada pararozanilina; ex tempore są. W celu uzyskania zarówno składniki pożywki inkubacyjnej jest połączona (pH 5,2-5,4). Jeśli to konieczne, skorygować wszelkie pH 50 % kwas octowy, Roztwór ługu alkalicznej.

Metoda. Świeże ejakulat odwirowuje, kiedy duża liczba plemników dozowania wirowanie. Z osadów przygotować polerowanej cienkich kresek, że, oraz rozmazy krwi, suszony powietrzem. Wysuszone wymazy stałych zanurzając je w zlewce z alkoholem w formalinie 30 z (nie więcej) i przemyto wodą destylowaną. Rozmazy są następnie zanurzane w zlewce z medium inkubacji i umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37 ° C 2 nie. Następnie były one płukane w wodzie destylowanej, zanurza się na 10 min w szklance z roztworem zieleni metylowej (kontrastowo do jąder), szybko zmyć wodą, osuszono na bibule filtracyjnej i badane przez układ mikroskopu zanurzenie.

Kwas aktywności fosfatazy może być wyrażona przez średni współczynnik cytochemicznych (SCK) przez Metoda polukolychestvennomu Astaldi-Verga. Według wzoru

SCK =(3* 2 * b * 1 )/100

gdzie cyfry w liczniku wskazuje intensywność kolorów (maksymalna - 3, umiarkowana - 2, ślady - 1), - litery i zawartość procentowa komórek policzonych określonej intensywności kolorów; figura 100 w mianowniku - całkowita liczba komórek policzonych.

Na Przykład, liczone 100 komórka, z tego z maksymalną intensywność kolorów 20 komórka, umiarkowana - 20 i po - 60 komórka. Tutaj:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6

Kwaśnej fosfatazy plemniki się w jednostce krokietów czerwony-pomarańczowy w górnej części głowy.

Busy chromatyny część głowy jest zielony i nie zawiera kwaśnej fosfatazy.

Bardziej rozproszony blady kolor w kwaśnej fosfatazy wykryciu wokół dolnej części głowicy, a czasami rozciąga się do szyjki plemników. Bliski współczynnik cytochemiczne fosfatazy kwaśnej w normalnym ejakulacie plemników jest 2.0-2.4.

W cytoplazmie komórek spermatogenezy wykazały gromadzenie granulek, jaskrawo pomalowane w specyficznych (czerwono-pomarańczowy) kolor. W komórkach podtrzymujących krętych kanalików nasiennych, często ostro pozytywnie zabarwione na fosfatazy kwaśnej, przezroczyste bezbarwne głowy (xromatin) sperma. Histiocyty i makrofagi zawierają kilka granulek, Dodatnio zabarwione na kwaśnej fosfatazy. W pojedynczych limfocytów, a czasami neutrofile są poszczególne granulki, wykazujący aktywność kwaśnej fosfatazy.

Oznaczanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej (SDG) w ejakulacie

Sukcinatdegidrogenaza - Enzym, udział w reakcjach redoks, zawartą w komórkach, w znacznej ilości ejakulatu. Jednakże, charakter zmian jego aktywności w różnych procesach chorobowych nie jest jeszcze dobrze poznane. Aktywności dehydrogenazy bursztynianowej w komórkach jest określana przez zmodyfikowaną metodą Nartsissova.

Odczynniki.

1. Aceton-Trilon (aceton - 60 ml, distillirovannaya wody - 40 ml, Trilon B - 250 mg).

2. Roztwór zieleni metylowej 2 % (sam barwnik, który jest stosowany do kwaśnej fosfatazy).

3. Środowisko Inkubatsionnaya, składający się z następujących elementów:

i) Bufor fosforanowy (pH 7,2-7,4) - 10 ml;

do) 5,4 % Roztwór bursztynianu sodu - 10 ml;

w) complexone III (13 mg rozcieńcza się 5 ml wody destylowanej);

g) woda destylowana - 5 ml;

d) nitrotetrazolium fioletowy (10 mg rozcieńcza się 10 ml wody).

Wszystkie składniki miesza się w jednym opakowaniu i przechowywano w lodówce. Przygotowany medium może być ponownie - dla 10 dni lub więcej.

Metoda. Smugi, wytworzono z ejakulatu, utrwalono w acetonie przez Trilon- 30 z, przemyto wodą destylowaną i wysuszono na powietrzu. Rozmazy są następnie zanurzane w pożywce do inkubacji i umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37 ° C 1 nie, po czym przemywa się wodą destylowaną i dokrashivayut zieleni metylowej do 10 m. Potem znowu szybko przemywa wodą, osuszono na bibule filtracyjnej i badane przez układ mikroskopu zanurzenie.

Normalny spermy mają wysoką aktywność dehydrogenazy bursztynianowej, reprezentowane przez duże niebiesko-fioletowy granulek, że, połączenie ze sobą, tworząc gęstą masę, napełniania szyi spermy, Niektóre sperm poszczególne granulki znajdują wokół głowy.

Oblicz spojone granulek nie jest możliwe, Dlatego też, w celu określenia aktywności dehydrogenazy bursztynianowej w kolorze częścią spermy mierzoną w mikrometrach. Wzdłuż malowane specjalnie dla dehydrogenazy bursztynianowej plemników są oceniane na podstawie stopnia aktywności enzymu w plemnikach. Z mikrometrów i długości oka obiektowy mikrometrów jest mierzona w określonym kolorze części 100 spermatozoidax. Dodawanie długość liczona w poplamionych sekcji plemników, a następnie dzieląc otrzymaną liczbę przez 100, otrzymania średniej długości, wyrażania aktywności suktsinatdegidrogenaznuyu dla pojedynczego plemnika. Zwykle jest to 4,3 ± 0,7 m. Działalność ta kalkulacja LDH jest najbardziej pouczające i jest w związku z tym zaleca się stosowanie do celów badawczych.

W szerokim zastosowaniu w praktyce metoda ta jest bardzo skomplikowana, Korzystne jest, aby wyrazić ilość dehydrogenazy bursztynianowej Metoda Verga Astaldi-. Bliski Współczynnik cytochemiczne spermy LDH w ejakulacie jest normalne 2,7 ± 0,3.

W komórkach spermatogenezy Aktywność LDH jest wykrywany w postaci skupiska dużych granulek niebiesko-fioletowych, Często łączą się w dużych kępach, znajdują się w różnych obszarach cytoplazmie. Middle Cytochemiczna czynnikiem komórek osiągnie spermatogenezy 2,0. Z dojrzewaniem komórek spermy i zwiększa aktywność LDH w dojrzałych plemników przekracza 2,0. W cytoplazmie niektórych limfocytów znaleźć kubeł SDG.

Oznaczanie aktywności peroksydazy w ejakulacie

Sperma, Komórki spermatogenezy i komórek podporowych zawiłe kanalików nasiennych peroksydazę brakuje.

Granulocytów obojętnochłonnych aktywność peroksydazy wytrysk jest wyrażona w znacznym stopniu i może zmieniać się w zależności od charakteru procesu patologicznego, jak również we krwi obwodowej. Poziom aktywności peroksydazy neutrofili jest ważne, aby ocenić ich stan funkcjonalny i aktywności procesu zapalnego u męskich narządów płciowych. Witraże wymazy nasienia Graham-Knoll i działalności księgowej enzymu przez Astaldi-Verga są analogiczne rozmaz krwi.

Aktywność peroksydazy w komórkach jest określana przez ejakulacie Metoda Graham-Knoll.

Odczynniki.

1. Formalina alkoholu (podobnie, i fosfatazy kwasu).

2. Odczynnik Peroksidaznыy: ʙenzidin (na czubku skalpela) rozpuszcza się w 6 ml 96 % alkohol etylowy, dodać 4 ml wody destylowanej 0,02 ml 3 % nadtlenek wodoru. Odczynnik nadające się do 5-6 dni.

3. Romanovsky Dye w rozcieńczeniu 1-2 krople 1 ml wody destylowanej.

Metoda. Świeże nasienie ustalone zostały na wymazy 30 formaliny alkoholem, przemywa się bieżącą wodą i suszono. Następnie wlać uderzeń odczynnika peroksydazy przez 5-7 minut, dokładnie umyć pod bieżącą wodą i suszono. Po to, że dokrashivayut 15 20 min barwnik Romanovsky, przemywa się bieżącą wodą, suszy się i mikroskopiruyut pomocą systemu mikroskopu zanurzenie.

Po pozytywnej odpowiedzi na peroksydazy w granulocytów obojętnochłonnych ujawnia główne złoto-brązowe granulki w dużych ilościach. Ze względu na dużą liczbę białych ciałek krwi niezbędnych do obliczenia Średni współczynnik Cytochemiczna (SCK). Cytoplazma histiocytów indywidualnego peroksydaza obecna jest w postaci małych klastrów, takich jak granulaty.

Określenie glikogenu w ejakulacie

Zmiany w zawartości glikogenu w różnych komórkach wpłynąć na ich funkcję lub dowód rozwoju procesu chorobowego. Określenie glikogenu w komórkach przeprowadzono przez McManus.

Odczynniki.

1. Wodny roztwór kwasu nadjodowego 1 % (przygotowanie do korzystania).

2. Sernistaya wody: 5 ml 10 % potasu lub sodu, pirosiarczyn, 5 ml 1 N kwas solny, wody 100 ml (przygotowanie do korzystania).

3. Odczynnik Shiffa: 1 g fuksyna zasadowa kwasu fuksinosernistoy, wstępnie rozdrobniony w moździerzu porcelanowym, rozpuszcza się w ciągłym wstrząsaniu dla 5 min 200 ml wrzącej wody destylowanej, przepuszczono przez bibułę filtracyjną i dodano z chłodzeniem do 50 ° C 20 ml 1 N kwas solny, i po ochłodzeniu do 25 ° C - 1 g potasu lub pirosiarczyn sodu. Przygotowany odczynnik przechowywany w lodówce 24 h po czym oświecony i nadaje się do spożycia vitsya

4.Wodny roztwór zieleni metylowej 2 %, przemyto chloroformem

5.Chemicznie czysty alkohol metylowy.

Metoda.

Cienkie suszone wymazy ejakulatu stałe chemicznie czysta alkohol metylowy do 3 m, płukano wodą destylowaną i zanurzono w zlewce 1 % Wodny kwas jodowy 5 m. Następnie wymazy przemyto wodą destylowaną, wysuszony, siarkowego ponownie płukano w wodzie i suszono.

Dalsze wymazy zanurzone w kubek z odczynnikiem Schiffa do 15 m, przemyć je w trzech częściach wody siarkowe (przez 3 min każda), myte 10 min w wodzie i jąder komórkowych dokrashivayut 3 min metyl zielony. Potem znowu spłukać wodą wacikami, filtrować papier i suszono mikroskopiruyut systemu zanurzenia za pomocą mikroskopu.

W dojrzałych plemników brakuje glikogenu. W cytoplazmie młodych spermy, zwłaszcza z "kołnierzem", ujawnione ślady glikogenu (±), czasami w postaci oddzielnych peletek, w górnej części głowicy lub w "kołnierz".

W komórkach spermatogenezy Glikogenu znajduje się w dużych ilościach w postaci ciągu wiśniowy granulek, wypełnia cały cytoplazmy. Z dojrzewania komórek traci aż do jego zniknięcia glikogenu w dojrzałych plemnikach. Spermatocitы glikogenu zawierają nie tylko w cytoplazmie, ale także w jądrze. W komórkach podtrzymujących zawiłe kanalików nasiennych, glikogen jest wiśniowy granulki i rozproszone. Dojrzałych granulocytów obojętnochłonnych w ejakulacie, a także w rozmazach krwi obwodowej, zawierają znaczną ilość glikogenu. Przewlekłego zapalenia gruczołu krokowego w granulocytach obojętnochłonnych wytrysku znacznie wzrasta ilość glikogenu i zwiększa aktywność peroksydazy. W pojedynczych limfocytów są czasami w normalnych granulkach glikogenu.

Makrofagi zawierać śladowe ilości glikogenu tło rozmazów nasienia barwione w kolorze czerwonym wiśni, co wskazuje na obecność w osoczu wytrysku dużych ilościach glikozaminoglikanów (mukopolisaxaridov).

Definicja kwasu rybonukleinowego (RNA) w ejakulacie

Podwyższony poziom RNA w komórkach To pokazuje wysoką aktywność w stosunku do ich rozwoju, sekretornoй, syntetyczne i inne działania. Zmniejszenie ilości RNA małymi komórkami często związane ze zmniejszoną zdolność tych komórek do regeneracji. Zawartość RNA w komórkach jest określana Sposób Chicken Coop.

Odczynniki.

1. Chicken Coop odczynnika: przygotowywane osobno 2 % metylowe zielone rozwiązania i pironina, metylu zielony roztwór przemyto dokładnie chloroformem; Roztwór roboczy barwnik wytwarza się przez zmieszanie 2 % Rozwiązanie pironina (12,5 ml) i 2 % metyl zielony roztwór (7,5 ml) z dodatkiem 30 ml wody destylowanej. Barwnik odporne, przechowywane w lodówce.

2. Zablokuj - chemicznie czystego alkoholu metylowego.

Metoda. Rozmazy są utrwalono metanolem przez 3 m, Roztwór roboczy pironina barwnik-metylo zielony 15 m, szybko płukane wodą, i wysuszono na bibule filtracyjnej. Mikroskopiruyut korzystania z systemu mikroskopu zanurzenia. RNA pironina pomalowane na jasny kolor czerwony, metylowy jądra komórkowe - zielony.

Dojrzałe plemniki nie zawierają RNA. Komórki są bogate w RNA spermatogenezy, co zmniejsza liczbę komórek, ponieważ dojrzałe. W spermatohonyy cytoplazmie bogaty kolor różowy, w spermatotsytov co blaknięcie, i w spermatydy jasnoróżowy. W młodej spermy "kołnierz" różowy malowane przeważająco "kołnierz".

Sperma, znajduje się w ostatniej fazie jego rozwoju, w komórkach podtrzymujących zawiłe kanalików nasiennych stracić resztki różowej substancji (RNA) i stać się dojrzałe plemniki.

W komórkach spermatogenezy zawiera dużą ilość glikogenu, RNA znacznie wyrażone aktywności LDH i CF. Ale, zwykle, Te pojedyncze komórki w ejakulacie, w związku z tym liczyć CBFV niepraktyczne. W takich przypadkach, ogranicza się do formy narracji zawarcia.

Charakterystyka cytochemiczne leukocytów Jest to ważny wskaźnik ich aktywności funkcjonalnej. Licząc liczbę leukocytów w substancji ejakulatu jest przewożona w samo, Podobnie jak w innych komórkach w ejakulacie i krwi obwodowej.

W barwionych rozmazach zwykłymi metodami ejakulatu (mieszaniny azurozinovymi, Hematoksyliną i eozyną i inni.), jak również preparaty nie zawsze są rodzime łatwo rozróżnić leukocytów, Komórki spermatogenezy, nabłonka gruczołu krokowego, histiocyty i inne elementy.

Cytochemiczne techniki w połączeniu z morfologicznych często pomóc ustalić rodzaj komórek. Więc, wyrażona aktywność peroksydazy, przewidziane duże koraliki złoto-brązowy, wypełnia całą cytoplazmy komórek, cechą dojrzałych neutrofilów, w innych komórkach, takich reakcji obserwuje. Severe reakcja glikogenu typowe neutrofili i komórek plemników, ale nie mają aktywności peroksydazy. RNA zawarty w komórkach i dojrzałych granulocytów nie spermatogenezy. Komórki spermatogenezy wykazują wyraźne reakcję kwaśnej fosfatazy, i granulocytów obojętnochłonnych, wyraziła bardzo słabo, i tak dalej. d.