Niedokrwistość, ze względu na niedobór aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu

Aktywność deficytu glukozo-6-fosfatdegidrogenaza (G-6-PD) jest najczęstszą dziedziczną nieprawidłowości krwinek czerwonych, powodując krizam hemolityczna, związane z nabyciem szereg leczniczych środki. Вне кризов у большинства больных наблюдается состояние полной компенсации, хотя у отдельных лиц имеет место постоянная гемолитическая анемия.

Первое описание дефицита активности Г-6-ФД было сделано в 1956 g. u osób, принимавших с профилактической целью противомалярийный препарат примахин. Независимо от этих исследований в 1957 g. Был обнаружен дефицит Г-6-ФД в эритроцитах больного, у которого периодически наблюдались гемолитические кризы без приема каких-либо лекарственных средств.

В настоящее время описано более 250 различных мутантных форм Г-6-ФД. Они отличаются друг от друга по электрофоретической подвижности фермента, его сродству к субстратам — глюкозо-6-фосфату и никотинамидадениндинуклеотидфосфату (НАДф) Следствием пониженного сродства является недостаточная активность фермента в условиях, когда концентрация субстратов строго лимитируется скоростью их образования в предшествующих реакциях. Отсутствие активности не означает в большинстве случаев выпадения фермента как такового хотя могут наблюдаться и такие случаи. Чаще всего отсутствие или снижение активности фермента — результат наличия его у больного в патологической малоактивной форме.

Структурный ген и ген-регулятор, обусловливающие синтез Г-6-ФД, располагаются на X-хромосоме, поэтому наследование дефицита активности этого фермента в эритроцитах всегда сцеплено с X-хромосомой.

Существуют две основные мутантные формы, в которых замещения аминокислот не касаются активных центров, и поэтому обе эти широко распространенные мутации являются нормальными. Они отличаются друг от друга электрофоретической подвижностью, однако сродство к субстрату у них одинаково. По современной номенклатуре, одна из этих форм, распространенная в Европе, называется формой BB, i inni, наблюдающаяся в Африке — формой A. В настоящее время описаны и другие мутантные формы, которые также не отличаются друг от друга по кинематическим показателям, но имеют различную электрофоретическую подвижность.

Сцепленность фермента с полом дает значительное преобладание мужчин среди лиц с клиническими проявлениями патологии. Она наблюдается у гомозиготных мужчин, унаследовавших данную патологию от матери с ее X-хромосомой, у гомозиготных женщин (унаследовавших болезнь от обоих родителей) и у части гетерозиготных женщин, наследовавших заболевание от одного из родителей с выраженным мутантным фенотипом.

Наиболее часто дефицит активности Г-6-ФД встречается в странах Европы, находящихся на побережье Средиземного моря, Grecja, Włochy, а также в некоторых странах Латинской Америки, Африки и др.

Może, что чрезвычайно высокому накоплению аномального гена в ряде населенных пунктов способствует сохранившийся обычай родственных браков, что приводит к накоплению в популяции гомозиготных женщин, дающих тяжелые клинические проявления болезни чаще, чем гетерозиготные носители, и увеличивающих вероятность рождения гомозиготных мужчин, а также широкое распространение в прошлом в этих местах тропической малярии.

Согласно существующей гипотезе, osoba, имеющие дефицит Г-6-ФД, легче переносят тропическую малярию и реже погибают от этого заболевания. В пользу данной гипотезы говорит факт неодинакового распространения паразита среди эритроцитов гетерозиготной женщины. Stwierdzono, что в нормальных клетках содержится намного большее количество паразита, чем в дефицитных. Имеется два предположительных объяснения этого факта. Первое из них: эритроцит с дефицитом Г-6-ФД не в состоянии противостоять воздействию паразита и сразу распадается в системе фагоцитирующих макрофагов, где и погибает плазмодий. Другая точка зрения предполагает необходмость для развития паразита восстановленного глутатиона, количество которого снижается в эритроцитах с дефицитом Г-6-ФД.

Etiologia i patogeneza

Первый этап воздействия лекарственного средства — его превращение в организме, переход в активную форму, которая может вызвать изменения в структуре мембраны эритроцита. Активная форма лекарственных средств вступает во взаимодействие с оксигемоглобином. При этом образуется некоторое количество перекиси водорода.

Восстановленный глутатион с помощью системы пероксидазы обезвреживает какую-то часть перекиси, в процессе реакции восстановленный глутатион окисляется.

У здоровых людей острый гемолитический криз развивается при введении значительного количества лекарственного средства (токсическая доза). Криз может возникнуть тогда, когда системы восстановления глутатиона не в состоянии справиться с избытком образовавшихся комплексов и окисленного глутатиона. При дефиците активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и нарушенном восстановлении НАДФ, несмотря на нормальную активность редуктазы глутатиона, нарушено его восстановление, так как отсутствует нормальный источник водорода. Восстановленный глутатион не может противостоять окислительному действию обычных лечебных доз лекарственных средств. Это приводит к окислению гемоглобина, потере гема из молекулы гемоглобина, выпадению в осадок цепей глобина. Селезенка освобождает эритроциты от телец Гейнца. При этом теряется часть поверхности эритроцитов, что приводит к их гибели.

В патогенезе гемолитической анемии, связанной с употреблением в пищу конских бобов, еще много неясного. Примахиновая анемия (фавизм) развивается лишь у некоторых лиц с дефицитом активности Г-6-ФД. Prawdopodobnie, для проявления этой анемии требуется сочетание двух ферментативных дефектов. Może, что речь идет о недостаточном обезвреживании у некоторых лиц токсического вещества, содержащегося в конских бобах, или об образовании какого-то метаболита, вызывающего нарушения в сульфгидрильных группах эритроцитов. У здоровых лиц прием небольшого количества конских бобов не вызывает выраженной гемолитической анемии, так как при наличии восстановленного глутатиона эритроциты в состоянии противодействовать токсическому эффекту метаболита. Наследование этого дефицита, widocznie, аутосомное доминантное. При сочетании необычного превращения в организме токсического вещества, содержащегося в конских бобах, с дефицитом активности Г-6-ФД проявляются клинические признаки примахиновой анемии.

Objawy kliniczne

Эксперты ВОЗ подразделяют варианты Г-6-ФД в соответствии с клиническими проявлениями у гомозиготных больных и уровнем активности в эритроцитах на четыре класса.

Первый класс — варианты, которые сопровождаются хронической гемолитической анемией.

Второй класс — варианты с уровнем активности Г-6-ФД в эритроцитах 0— 10 % od normy, носительство которых обусловливает отсутствие гемолитической анемии вне криза, и кризы, связанные с приемом лекарственных средств или употреблением конских бобов.

Третий класс — варианты с уровнем активности в эритроцитах 10—60 % od normy, при которых могут наблюдаться легкие клинические проявления, связанные с приемом лекарственных средств.

Четвертый класс — варианты с нормальным или близким к норме уровнем активности, не сопровождающиеся клинической патологией.

При рождении ребенка наблюдается гемолитическая анемия, относящаяся как к первому, так и ко второму классу дефицита Г-6-ФД.

Уровень активности Г-6-ФД в эритроцитах не всегда коррелирует с тяжестью клинических проявлений. При многих вариантах первого класса определяется 20—30 % уровень активности фермента. Z drugiej strony, при нулевом уровне активности у некоторых больных не наблюдается никакой клинической симптоматики. Это связано, Najpierw, со свойствами лутантных ферментов, Po drugie, najprawdopodobniej, со скоростью обезвреживания лекарственных средств цитохромным аппаратом печени больного.

Наиболее часто дефицит активности Г-6-ФД не дает клинических проявлений без специальной провокации гемолитического криза. В большинстве случаев гемолитический криз начинается после приема сульфаниламидных препаратов (норсульфазола, стрептоцида, сульфадиметоксина, сульфацил-натрия, этазола, бисептола), противомалярийных средств (примахина, xinina, акрихина), нитрофурановых препаратов (furazolidona, furadonina, фурагина, 5-НОК, невиграмона), препаратов изоникотиновой кислоты (тубазида, фтивазида), ПАСК-натрия, а также нитроглицерина.

Из противомалярийных препаратов при дефиците активности Г-6-ФД может быть назначен делагил, из сульфаниламидных — фталазол. Ряд препаратов, вызывающих в больших дозах гемолитические кризы, в малых дозах может быть использован при дефиците активности Г-6-ФД. К ним относятся ацетилсалициловая кислота, amidopirin, фенацитин, levomicetin, Streptomycyna, противодиабетические сульфаниламидные препараты.

Все лекарственные средства, способные вызывать гемолитические кризы, катализируют окислительную денатурацию гемоглобина молекулярным кислородом.

Клинические проявления заболевания могут возникать на вторые-третьи сутки от начала приема лекарственных средств. Вначале появляются легкая желтушность склер, ciemny mocz. При прекращении приема препарата в этот период тяжелый гемолитический криз не развивается. Если лечение продолжается, на 4—5-е сутки может возникнуть гемолитический криз с выделением мочи черного или иногда бурого цвета, что связано с внутрисосудистым распадом эритроцитов. Содержание гемоглобина может снизиться на 2—3 %.

При тяжелом течении заболевания повышается температура тела, появляются резкая головная боль, bóle kończyn, wymioty, иногда — понос. Возникает одышка, снижается артериальное давление. Часто увеличивается селезенка, иногда — печень.

В редких случаях развивается недостаточность почек, связанная с резким снижением почечной фильтраций и закупоркой почечных канальцев кровяными сгустками.

Wyniki badań laboratoryjnych

При исследовании крови выявляется анемия с повышением количества ретикулоцитов. Наблюдается увеличение числа лейкоцитов со сдвигом до миелоцитов. U niektórych pacjentów,, zwłaszcza u dzieci, количество лейкоцитов иногда может повыситься до значительных цифр (100 T w 1 l i bardziej). Число тромбоцитов не изменяется. При окраске эритроцитов кристаллическим фиолетовым в период тяжелых гемолитических кризов обнаруживается большое количество телец Гейнца.

Выявляется резкое раздражение красного ростка костного мозга. Повышается содержание свободного гемоглобина сыворотки, часто повышен уровень билирубина за счет непрямого. С помощью бензидиновой пробы выявляется присутствие в моче гемоглобина без эритроцитов, иногда обнаруживается гемосидерин.

При некоторых формах недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы наблюдается самоограничение гемолиза, t. to jest. гемолитический криз обрывается, mimo, что больной продолжает принимать лекарственное средство, которое вызвало гемолитический криз. Способность к самоограничению гемолиза обусловлена повышением почти до нормальных цифр уровня активности фермента в ретикулоцитах. При большинстве форм он значительно снижен.

У детей тяжелые гемолитические кризы наблюдаются чаще, niż u dorosłych. При выраженном дефиците активности Г-6-ФД они возникают иногда сразу после рождения. Это гемолитическая болезнь новорожденных, не связанная с иммунологическим конфликтом. Она может протекать так же тяжело, как и гемолитическая анемия, обусловленная резуснесовместимостью матери и плода. Возможно наличие ядерной желтухи с тяжелейшей неврологической симптоматикой.

Патогенез этих кризов изучен недостаточно. Пока не выяснено, наступают ли эти кризы спонтанно в связи с физиологической недостаточностью активности фермента пероксидазы глутатиона при рождении или причиной их является употребление определенных антисептических средств при обработке пуповины ребенка. Może, что иногда кризы связаны с приемом матерью некоторых лекарственных средств.

W niektórych przypadkach гемолитические кризы при дефиците активности Г-6-ФД возникают на фоне инфекционных заболеваний: Grypa, сальмонеллеза, вирусного гепатита. Кризы могут быть спровоцированы также ацидозом при сахарном диабете или недостаточности почек.

У небольшой части больных с дефицитом активности Г-6-ФД наблюдается постоянная гемолитическая анемия, związanych z przyjmowaniem leków. В этих случаях отмечаются небольшое увеличение селезенки, умеренная нормохромная анемия с повышением содержания ретикулоцитов, эритрокариоцитов в костном мозге и уровня билирубина. Обострение заболевания возможно либо после приема указанных выше лекарственных средств, либо на фоне инфекций.

Diagnostyka

Основой для диагностики этой недостаточности ферментом эритроцитов является определение активности Г-6-ФД у пробанда и его родственников. Из качественных методов, применяемых для этой цели, следует рекомендовать два наиболее простых метода.

Metoda Bernstein дает возможность не только диагностировать дефицит активности Г-6-ФД у всех гемизиготных мужчин, гомозиготных женщин, но и приблизительно оценивать степень дефицита этого фермента у гетерозиготных женщин. Этим методом удается выявить около 50 % гетерозиготных женщин. Преимуществом этого метода является пригодность его для использования при массовом обследовании населения в экспедиционных условиях.

Метод основан на обесцвечивании красителя 2,6-дихлорфенолиндофенол а при его восстановлении. В присутствии Г-6-ФД происходит окисление глюкозо-6 фосфата и восстановление НАДФ с образованием НАДФ-Н. Это вещество восстанавливает феназинметасульфат, которой в свою очередь восстанавливает 2,6-дихлорфенолиндофенол. Феназинметасульфат действует в этой реакции как очень активный переносчик электронов от НАДФ-Н к красителю. Без феназинметасульфата реакция идет несколько часов, а в присутствии феназинметасульфата обесцвечивание происходит за 15— 30 m.

Odczynniki.

1. Раствор НАДФ: 23 мг НАДФ растворяют в 10 ml wody.
2. Раствор глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф): 152 мг натриевой соли глюкозо-6-фосфата растворяют в 10 ml wody. Бариевая соль глюкозо-6-фосфата должна быть предварительно переведена в натриевую соль. Для этого взвешивают 265 мг бариевой соли глюкозо-6-фосфата, rozpuszcza się w 5 ml wody, dodać 0,5 ml 0,01 М раствора соляной кислоты и 1 мг сухого сульфата натрия. Осадок центрифугируют. Надосадочный слой нейтрализуют 0,01 М раствором едкого натра и доводят дистиллированной водой до 10 ml.
3. Раствор феназинметасульфата: 2 мг феназинметасульфата растворяют в 100 мл трис-буфера 0,74 M; pH 8,0.
4. Раствор красителя 2,6-дихлорфенолиндофенола (натриевой соли): 14,5 мг красителя растворяют в 100 мл буферного раствора трис-соляной кислоты (0,74 M; pH 8,0). Буферный раствор готовят из 1,48 М раствора трис-гидроксиметиламинометана (42,27 d 250 ml wody) i 1,43 M roztwór kwasu chlorowodorowego (2 ампулы фиксанала, Zawiera 0,1 г-экв, доводят водой до 135 ml). K 230 мл раствора трис-гидроксиметиламинометала добавляют 110 ml kwasu solnego, доводят рН до 8,0 и добавляют воду до 460 ml.

Перед применением готовят смесь реактивов: 1 nie. раствора НАДФ (1), 1 nie. раствора Г-6-Ф (2), 2 nie. раствора феназинметасульфата (3) i 16 nie. раствора 2,6-дихлорфенолинодофенола (4).

Metoda.

В пробирку, Zawiera 1 ml wody destylowanej, przyczynić się 0,02 ml krwi.

После наступления гемолиза добавляют 0,5 мл смеси реактивов. Результаты учитывают через 30 m. Реакцию расценивают как нормальную при полном обесцвечивании красителя. Gdzie, когда обесцвечивание красителя не происходит (остается интенсивно сине-зеленый I цвет), реакцию оценивают как резко-положительную. Если интенсивность окраски уменьшается, но сине-зеленый цвет остается, реакцию считают поло-жительной. Gdzie, когда происходит явное обесцвечивание, но при сравнении с контролем остается зеленоватый оттенок, реакцию расценивают как плюс-минусовую.

Резкоположительные и положительные реакции наблюдаются у гемизиготных мужчин и гомозиготных женщин. Иногда гетерозиготные женщины дают положительную реакцию, но чаще плюс-минусовую. Oprócz, плюс-минусовая реакция иногда наблюдается у совершенно здоровых людей при некотором снижении активности фермента на фоне заболевания или приема лекарственных средств. Плюс-минусовые реакции следует принимать во внимание и проверять активность фермента количественным методом лишь при подозрении на наличие у женщины гемолитической анемии, обусловленной дефицитом активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Не следует принимать во внимание плюс-минусовые реакции при массовом обследовани.

Ошибочная положительная реакция может быть у лиц с выраженной анемией в связи с тем, co 0,02 ml krwi, внесенной в пробирку, содержат малое количество эритроцитов и, Więc, малое количество фермента. В этом случае в пробирку с дистиллированной водой следует добавить две или три пипетки (przez 0,02 ml) krew, чтобы по цвету эти пробирки до прибавления красителя не отличались от контрольных.

Метод флюоресцирующих пятен Beutler и Mitchell основан на специфической флюоресценции восстановленного НАДФ в длинноволновом ультрафиолетовом свете (440- 470 nm), оцениваемой визуально в фиксированные сроки.

Odczynniki.

1. Трис-HCl буфер 0,5 M; pH 8,0: 60,55 триса растворяют в 800 ml wody destylowanej, dodać 20 мл концентрированной HCl, доводят pH до 8,0 с помощью 2 М раствора HCl и доливают водой до 1 ml; раствор хранят до 36 суток при температуре 4°С.
2. Раствор глюкозо-6-фосфата 20 M: 6 мг динатриевой соли глюкозо-6-фосфата растворяют в 1 ml wody destylowanej; хранят до 2 суток при температуре 4°С.
3. Раствор НАДФ 10 M: 8 мг НАДФ растворяют в 1 ml wody destylowanej; хранят до 10 суток при температуре 4 ° C.
4. Водный раствор сапонина 1 % хранят до 20 суток при температуре 4 ° C.
5. Раствор окисленного глутатиона (10 ml): 2,4 мг глутатиона растворяют в 1 ml wody destylowanej; хранят до 10 суток при температуре 4°С.

Metoda.

Перед определением готовят инкубационную смесь, смешивая 1 nie. раствора глюкозо-6-фосфата, 1 nie. раствора НАД-Ф, 2 nie. раствора сапонина, 5 nie. буфера и 1 nie. раствора глутатиона. Krew (0,01 ml) вносят в пробирки или ячейки гемагглютинационной доски и добавляют 0,2 мл инкубационной смеси. Przez 15 мин микропипеткой отбирают одну каплю инкубационной смеси (0,02 ml) из каждой пробы и наносят их на хроматографическую бумагу в виде пятна диаметром 10—12 мм. Пятна высушивают на воздухе при комнатной температуре и просматривают в ультрафиолетовом свете для оценки флюоресценции. Контролем являются образцы с заведомо нормальной кровью. Контроль на качество реактивов не содержит крови.

Ocena wyników.

Отсутствие флюоресценции соответствует отсутствию активности, наличие флюоресценции (интенсивное голубое свечение) — наличию активности, а слабое свечение — промежуточной реакции. При соблюдении условий эксперимента метод не дает ложноотрицательных результатов. Источником ложноположительного диагноза может быть выраженная анемия у обследованного, но в гораздо меньшей степени, чем для метода Berstein. Даже при выраженной анемии наблюдается промежуточная реакция, а не отсутствие флюоресценции.

Использование количественного метода определения активности Г-6-ФД дает возможность выявлять снижение активности не только у гемизиготных и гомозиготных больных, но и у женщин-гетерозигот. Dlatego, что количество ретикулоцитов и цветовой показатель влияют на уровень активности фермента, рекомендуется вносить поправку результатов с учетом этих показателей.