Cytochemical kajian ejaculate

Tindak balas sitokimia, dijalankan dengan ejakulasi, membolehkan kita menilai komposisi kimia dan aktiviti fungsi selnya.

Penentuan aktiviti asid fosfatase dalam ejakulasi

Aktiviti asid fosfatase dalam ejakulasi adalah berkali ganda lebih tinggi daripada aktivitinya dalam darah. Asid fosfatase adalah sebahagian daripada rembesan prostat, pengeluarannya dirangsang oleh hormon gonadotropik lelaki. Menggunakan tindak balas sitokimia, ia dikesan dalam spermatozoa dan sel-sel lain ejakulasi. Aktivitinya ditentukan dengan kaedah Goldberg-Bark.

Reagen.

1. Alkohol formalin (siap satu bahagian 40 % formalin dilarutkan dalam sembilan bahagian 96% alkohol ethyl).

2. Pararosaniline: 1 g asas fuchsin untuk fuch- asid sulfur dilarutkan apabila dipanaskan 25 ml 2 n asid hidroklorik; menyejukkan badan, tapis dan simpan dalam peti ais. Reagent adalah stabil.

3. Larutan natrium nitrat berair 4 %. 4. Larutan metil hijau dalam penimbal asetat 2 % (pH — 5). Larutan yang terhasil dibasuh dengan kloroform, mengapa campurkan jumlah kloroform yang lebih kurang sama dan 2 % larutan metil hijau. Goncang berulang kali sepanjang hari, dan kemudian kloroform berwarna ungu dikeluarkan menggunakan corong pemisah..

5. Persekitaran inkubasi, terdiri daripada dua komponen.

• A-komponen: 20 mg naftol-A5-fosfat dilarutkan dalam 0,5 (0,3) ml dimetilformamida, Tambah 40 ml 0,1 n larutan natrium asetat dan tapis melalui penapis kertas; disediakan pada hari peperiksaan.
• komponen B: 8 titisan 4 % larutan natrium nitrat bercampur dengan 8 titisan pararosaniline; disediakan ex tempore. Untuk mendapatkan medium pengeraman, kedua-dua komponen digabungkan (pH 5,2—5,4). Jika perlu, pH diselaraskan sama ada 50 % asid asetik, atau larutan alkali kaustik.

Kaedah. Pancutan segar disentrifugasi, dengan sejumlah besar spermatozoa, sentrifugasi tidak diperlukan. Calitan nipis disediakan daripada sedimen menggunakan kaca tanah., yang, seperti calitan darah, udara kering. Seterusnya, smear kering dibetulkan dengan merendamnya dalam gelas dengan alkohol formaldehid. 30 dengan (max) dan dibasuh dengan air suling. Kemudian smear direndam dalam cawan dengan medium pengeraman dan diletakkan di dalam termostat pada suhu 37 ° C 2 tidak. Selepas ini, mereka dibilas dalam air suling., direndam pada 10 min dalam gelas dengan larutan metil hijau (untuk kemasan biji), cepat basuh dengan air, dikeringkan dengan kertas turas dan diperiksa menggunakan sistem mikroskop rendaman.

Aktiviti asid fosfatase boleh dinyatakan menggunakan pekali sitokimia purata (SCK) pada kaedah Astaldi-Verga separa kuantitatif. Mengikut formula

SCK=(3*a+2*b+1*c)/100

di mana nombor dalam pengangka menunjukkan keamatan warna (maksimum — 3, sederhana - 2, jejak - 1), dan huruf menunjukkan peratusan sel yang dikira dengan keamatan warna tertentu; Rajah 100 penyebut ialah jumlah bilangan sel yang dikira.

Sebagai contoh, dikira 100 sel, yang mana dengan keamatan warna maksimum 20 sel, dengan sederhana - 20 dan dengan jejak - 60 sel. Dari sini:

SCK=(3*20+2*20+1*60)/100=1,6

Dalam spermatozoa, asid fosfatase terletak dalam bentuk butiran besar tunggal warna merah-oren di bahagian atas kepala..

Bahagian kepala yang diduduki oleh kromatin berwarna hijau dan tidak mengandungi asid fosfatase..

Pewarnaan fosfatase asid resap pucat dikesan di sekitar bahagian bawah kepala, dan kadang-kadang sampai ke leher sperma. Purata pekali sitokimia asid fosfatase sperma dalam ejakulasi normal ialah 2.0-2.4.

Pengumpulan butiran terdapat dalam sitoplasma sel spermatogenesis, berwarna terang secara spesifik (merah-oren) Warna. Dalam sel penyokong tubul seminiferus berbelit-belit, selalunya sangat positif untuk asid fosfatase, kepala tidak dicat menunjukkan melalui (kromatin) sperma. Histiosit dan makrofaj mengandungi sedikit butiran, diwarnakan positif untuk asid fosfatase. Dalam limfosit tunggal, dan kadangkala butiran individu ditemui dalam granulosit neutrofilik, mempunyai aktiviti asid fosfatase.

Penentuan aktiviti suksinat dehidrogenase (SDG) dalam ejakulasi

Suksinat dehidrogenase -enzim, terlibat dalam tindak balas redoks, terkandung dalam sel ejakulasi dalam kuantiti yang ketara. Walau bagaimanapun, sifat perubahan dalam aktivitinya dalam pelbagai proses patologi belum lagi dikaji dengan baik.. Aktiviti dehidrogenase succinate dalam sel ditentukan oleh kaedah Narcissov yang diubah suai.

Reagen.

1. Aseton-trilon (aseton - 60 ml, air suling - 40 ml, trilon B - 250 mg).

2. Larutan metil hijau 2 % (pewarna yang sama, yang digunakan untuk asid fosfatase).

3. Persekitaran inkubasi, terdiri daripada komponen berikut:

dan) penampan fosfat (pH 7,2—7,4) - 10 ml;

kepada) 5,4 % larutan natrium suksinat - 10 ml;

dalam) Trilona B (13 mg dicairkan 5 ml air suling);

g) air suling - 5 ml;

d) nitrotetrazolium violet (10 mg dicairkan 10 ml air).

Semua komponen dicampur dalam satu botol dan disimpan di dalam peti sejuk.. Medium siap boleh digunakan berulang kali - dalam 10 hari atau lebih.

Kaedah. calitan, disediakan daripada ejakulasi, tetap dalam aseton-trilon untuk 30 dengan, dibasuh dengan air suling dan dikeringkan di udara. Calitan kemudiannya direndam dalam medium pengeraman dan diletakkan di dalam termostat pada suhu 37 ° C 1 tidak, selepas itu mereka dibasuh dengan air suling dan diwarnakan dengan metil hijau untuk 10 m. Kemudian bilas dengan cepat dengan air sekali lagi., dikeringkan dengan kertas turas dan diperiksa menggunakan sistem mikroskop rendaman.

Sperma biasa mempunyai aktiviti dehidrogenase suksinat yang tinggi, diwakili oleh butiran biru-ungu besar, yang, bercantum antara satu sama lain, membentuk jisim yang padat, mengisi leher sperma, dalam sesetengah spermatozoa, butiran individu juga terdapat di sekeliling kepala.

Tidak mustahil untuk mengira butiran yang telah bergabung antara satu sama lain., oleh itu, untuk menentukan aktiviti suksinat dehidrogenase, bahagian berwarna sperma diukur dalam mikrometer. Panjang bahagian sperma yang diwarnakan khusus untuk suksinat dehidrogenase menentukan tahap aktiviti enzim dalam sperma ini.. Menggunakan mikrometer kanta mata dan mikrometer objek, panjang bahagian yang diwarnakan secara khusus diukur dalam 100 spermatozoa. Dengan menambah panjang kawasan berwarna dalam spermatozoa yang dikira dan membahagikan angka yang terhasil dengan 100, dapatkan purata panjang, menyatakan aktiviti suksinat dehidrogenase untuk satu sperma. Biasanya ia adalah 4.3±0.7 µm. Pengiraan aktiviti SDH ini adalah yang paling bermaklumat dan oleh itu disyorkan untuk digunakan untuk tujuan saintifik..

Kaedah ini agak rumit untuk digunakan secara meluas dalam amalan., adalah lebih baik untuk menyatakan jumlah suksinat dehidrogenase dengan kaedah Astalda-Verga. Purata pekali sitokimia SDH sperma dalam ejakulasi normal ialah 2,7 ±0,3.

Dalam sel spermatogenesis Aktiviti SDH dikesan sebagai gugusan butiran biru-ungu besar, sering bergabung menjadi ketulan besar, terletak di bahagian sitoplasma yang berlainan. Purata pekali sitokimia dalam sel spermatogenesis tidak mencapai 2,0. Apabila sel ejakulasi matang, aktiviti SDH meningkat dan dalam spermatozoa matang melebihi 2,0. Butiran SDH yang besar terdapat dalam sitoplasma limfosit individu.

Penentuan aktiviti peroksidase dalam ejakulasi

Dalam sperma, sel spermatogenik dan sel penyokong tubul seminiferus berbelit kekurangan peroksidase.

Dalam granulosit neutrofilik ejakulasi, aktiviti peroksidase dinyatakan pada tahap yang ketara dan boleh berbeza-beza bergantung pada sifat proses patologi., sama seperti dalam darah periferi. Tahap aktiviti peroksidase dalam granulosit neutrofil adalah penting untuk menilai keadaan fungsinya dan aktiviti proses keradangan dalam organ genital lelaki. Pewarnaan smear ejakulasi mengikut Graham-Knoll dan rakaman aktiviti enzim mengikut Astaldi-Verg dijalankan sama seperti smear darah.

Aktiviti peroksidase dalam sel ejakulasi ditentukan oleh Kaedah Graham-Knoll.

Reagen.

1. Alkohol formalin (sama, bagi asid fosfatase).

2. Reagen peroksidase: benzidine (di hujung pisau bedah) dibubarkan dalam 6 ml 96 % alkohol ethyl, Tambah 4 ml air suling dan 0,02 ml 3 % hidrogen peroksida. Reagen boleh digunakan dalam masa 5-6 hari.

3. Pewarna Romanovsky dicairkan 1-2 titis setiap 1 ml air suling.

Kaedah. Calitan ejakulasi segar diikat di dalamnya 30 dengan alkohol formalin, dibasuh dengan air mengalir dan dikeringkan. Kemudian smear diisi dengan reagen peroksidase selama 5-7 minit., dicuci bersih dalam air mengalir dan dikeringkan. Selepas ini mereka selesai melukis 15— 20 min pewarna Romanovsky, dibasuh dengan air mengalir, dikeringkan dan dimikroskop menggunakan sistem mikroskop rendaman.

Dengan tindak balas positif terhadap peroksidase, butiran besar berwarna coklat keemasan ditemui dalam kuantiti yang ketara dalam granulosit neutrofil.. Sekiranya bilangan leukosit adalah besar, perlu dikira pekali sitokimia purata (SCK). Dalam sitoplasma histiosit individu, peroksidase terkandung dalam bentuk pengumpulan kecil butiran yang sama.

Penentuan glikogen dalam ejakulasi

Perubahan kandungan glikogen dalam pelbagai sel menjejaskan fungsi mereka atau menunjukkan perkembangan proses patologi. Penentuan glikogen dalam sel dijalankan dengan kaedah McManus.

Reagen.

1. Larutan akueus asid berkala 1 % (disediakan sebelum digunakan).

2. Air sulfur: 5 ml 10 % kalium atau natrium metabisulfit, 5 ml 1 n asid hidroklorik, air sehingga 100 ml (disediakan sebelum digunakan).

3. Reagen Schiff: 1 g fuchsin asas untuk asid fuksulfur, sebelum ini dikisar dalam mortar porselin, larut dengan goncangan berterusan untuk 5 min masuk 200 ml air suling mendidih, melalui penapis kertas dan ditambah sambil menyejukkan sehingga 50 ° C 20 ml 1 n asid hidroklorik, dan apabila disejukkan ke 25 °C — 1 g kalium atau natrium metabisulfit. Reagen yang disediakan disimpan di dalam peti sejuk untuk 24 h selepas itu ia hilang dan menjadi sesuai untuk dimakan

4.Larutan akueus metil hijau 2 %, dibasuh dengan kloroform

5.Metil alkohol tulen secara kimia.

Kaedah.

Calitan nipis kering ejakulasi difiksasi dengan metil alkohol tulen secara kimia untuk 3 m, bilas dengan air suling dan masukkan ke dalam gelas dengan 1 % larutan akueus asid berkala 5 m. Calitan kemudiannya dibasuh dengan air suling, dikeringkan, bilas dalam air sulfur dan keringkan semula.

Seterusnya, smear dicelup ke dalam gelas dengan reagen Schiff. 15 m, bilas mereka dalam tiga bahagian air sulfur (pada 3 min dalam setiap), dibasuh 10 min dalam air dan mengotorkan nukleus sel 3 min metil hijau. Selepas ini, bilas semula calitan dengan air., dikeringkan dengan kertas turas dan dimikroskop menggunakan sistem mikroskop rendaman.

Tiada glikogen dalam sperma matang. Dalam sitoplasma spermatozoa muda, terutamanya dengan kolar, kesan glikogen dikesan (±), kadang-kadang dalam bentuk butiran tunggal di bahagian atas kepala atau di kawasan "kolar"..

Dalam sel spermatogenesis glikogen didapati dalam kuantiti yang banyak dalam bentuk butiran merah ceri, memenuhi seluruh sitoplasma. Apabila sel matang, mereka kehilangan glikogen sehingga ia hilang dalam sperma matang.. Spermatosit mengandungi glikogen bukan sahaja dalam sitoplasma, tetapi juga dalam inti. Dalam sel penyokong tubulus seminiferus berbelit, glikogen terletak dalam bentuk butiran merah ceri dan meresap. Granulosit neutrofil matang dalam ejakulasi, seperti dalam smear darah periferi, mengandungi sejumlah besar glikogen. Dalam prostatitis kronik, jumlah glikogen dalam granulosit neutrofilik ejakulasi meningkat dengan ketara dan aktiviti peroksidase meningkat. Biasanya, limfosit terpencil kadangkala mengandungi butiran glikogen.

Makrofaj mengandungi kesan glikogen Latar belakang sapuan ejakulasi berwarna merah ceri, yang menunjukkan kehadiran sejumlah besar glikosaminoglikan dalam plasma ejakulasi (macromolecular).

Penentuan asid ribonukleik (RNA) dalam ejakulasi

Peningkatan kandungan RNA dalam sel menunjukkan aktiviti tinggi mereka dari segi pertumbuhan, rahsia, sintetik dan aktiviti lain. Penurunan kandungan RNA dalam sel muda sering dikaitkan dengan pengurangan keupayaan sel ini untuk menjana semula. Kandungan RNA dalam sel ditentukan dengan kaedah Kurnik.

Reagen.

1. Reagen Kurnik: disediakan secara berasingan 2 % larutan metil hijau dan pironin, larutan metil hijau dibasuh dengan kloroform; Penyelesaian kerja pewarna disediakan dengan mencampurkan 2 % larutan pyronine (12,5 ml) dan 2 % larutan metil hijau (7,5 ml) dengan penambahan itu 30 ml air suling. Pewarna kekal, disimpan dalam peti ais.

2. Fixative - metil alkohol tulen secara kimia.

Kaedah. Calitan dibetulkan dengan metil alkohol untuk 3 m, diwarnai dengan larutan kerja pyronin-metil hijau 15 m, cepat bilas dengan air dan keringkan dengan kertas turas. Mikroskop menggunakan sistem mikroskop rendaman. RNA diwarnai merah terang oleh pyronine, nukleus sel - metil hijau ke hijau.

Sperma matang tidak mengandungi RNA. Sel spermatogenesis kaya dengan RNA, jumlahnya berkurangan dalam sel apabila ia matang. Dalam spermatogonia sitoplasma merah jambu dalam, dalam spermatosit ia pudar, dan dalam spermatid merah jambu pucat. Dalam sperma muda dengan "kolar" Kebanyakannya "kolar" dicat merah jambu.

Sperma, berada di peringkat terakhir perkembangan mereka, dalam sel penyokong tubul seminiferus berbelit-belit mereka kehilangan sisa bahan merah jambu (RNA) dan bertukar menjadi sperma matang.

Sel spermatogenesis mengandungi sejumlah besar glikogen, RNA dan aktiviti SDH dan CP dinyatakan dengan ketara. Walau bagaimanapun,, sebagai peraturan, sel-sel ini jarang berlaku dalam ejakulasi, oleh itu, pengiraan SCV adalah tidak praktikal. Dalam kes sedemikian, ia terhad kepada bentuk deskriptif kesimpulan..

Ciri-ciri sitokimia leukosit adalah penunjuk penting aktiviti fungsi mereka. Perakaunan untuk jumlah bahan dalam leukosit ejakulasi dilakukan dengan cara yang sama, seperti dalam sel-sel lain ejakulasi dan dalam darah periferi.

Dalam calitan ejakulasi yang diwarnakan secara konvensional (campuran azurosin, hematoxylin-eosin, dsb.), dan juga dalam persediaan asli tidak selalu mudah untuk membezakan leukosit, sel-sel spermatogenesis, epitelium prostat, histiosit dan unsur lain.

Kaedah sitokimia dalam kombinasi dengan kaedah morfologi sering membantu untuk menubuhkan jenis sel. Sejak, aktiviti peroksidase yang ketara, diwakili oleh butiran coklat keemasan yang besar, mengisi keseluruhan sitoplasma sel, ciri granulosit neutrofilik matang, sel lain tidak mempunyai tindak balas ini. Tindak balas yang ketara terhadap glikogen adalah tipikal bagi granulosit neutrofilik dan sel spermatogenesis, tetapi yang kedua tidak mempunyai aktiviti peroksidase. RNA ditemui dalam sel spermatogenesis dan tiada dalam granulosit matang. Sel-sel spermatogenesis mempunyai tindak balas yang ketara kepada asid fosfatase, dan dalam granulosit neutrofil ia dinyatakan dengan sangat lemah, dsb.. d.