Kajian hemostasis vaskular-platelet

Gangguan di bahagian hemostasis ini boleh berlaku dengan kecenderungan pendarahan atau trombosis, bergantung pada kaedah penyelidikan yang dipilih. Lebih-lebih lagi, Semua kaedah analisis platelet hemostasis dibahagikan kepada asas dan tambahan, atau ujian baris kedua, yang hanya berlaku jika, Sekiranya ujian mendedahkan sebarang pelanggaran. Ke bahagian utama (asas) Ujian berikut dikenakan.

Ujian untuk rintangan (kerapuhan) Capillaries - Cuff, kalengan, angioresistometry

Dari ujian ini, yang paling mudah diakses dan pada masa yang sama cukup bermaklumat Ujian Konchalovsky-Rumpel-Leede.

Penilaian dibuat dengan bilangan dan saiz pendarahan, terbentuk di bahagian atas permukaan palmar lengan bawah (dalam bulatan dengan diameter 5 melihat) Selepas 5 minit pemampatan bahu dengan cuff pada tekanan 12-13.3 kPa (90-100 mm Hg. Art.). Hasilnya diambil kira melalui 5 min selepas penyingkiran cuff. Bilangan petechiae lebih daripada 10 Menunjukkan peningkatan kerapuhan mikro, yang sering dikaitkan dengan thrombocytopenia atau fungsi platelet angiotropik terjejas. Kejadian pendarahan di bawah cuff itu sendiri juga diambil kira..

Sampel jar dilakukan di kawasan kulit yang sama dengan kenaikan langkah negatif - dari 20 kPa (150 mm Hg. Art.) dan di bawah. Semasa menilai keputusan, petechiae dikira, muncul di bawah bank.

Ujian untuk tempoh dan magnitud pendarahan kapilari

Dengan klasik Ujian Duke Kusyen yang lebih rendah dari telinga, selepas sedikit pemanasan, ditembusi ke kedalaman 3.5-4 mm. Masa pendarahan untuk kajian sedemikian biasanya tidak melebihi 4 m, dan titisan darah pada kertas penapis agak kecil dan mula cepat berkurangan kira-kira dari 1-1.5 minit selepas tusukan. Dengan thrombocytopenia yang teruk (kurang 20 T 1 l) dan disfungsi platelet yang teruk, masa pendarahan meningkat hingga 20-40 minit, Tempat darah menjadi lebih besar dan tidak berkurangan untuk masa yang lama atau menurun dalam gelombang, kemudian meningkat lagi. Ujian Duke tidak cukup sensitif, dalam 2/3 Pada pesakit dengan thrombocytopathies ia memberikan hasil yang normal.

Sampel yang lebih sensitif, di mana masa pendarahan dikaji terhadap latar belakang stasis vena yang dibuat secara buatan, Mengapa manset dari peranti pengukur tekanan darah diletakkan di bahu dan tekanan dikekalkan sepanjang kajian, sama 5,3 kPa (40 mm Hg. Art.). Terhadap latar belakang stasis seperti itu Latihan Borhgrevink-Waaler Di permukaan palmar dari atas ketiga lengan bawah, incisions kedalaman melintang digunakan dengan scarifier 1 mm dan 8-10 mm panjang (Masa pendarahan biasa - hingga 10 m), dan dalam sampel oleh Ivey et al.. Di kawasan lengan yang sama, tiga punca melintang dengan kedalaman 3 mm (Masa pendarahan biasa - hingga 7 m).

Terhadap latar belakang stasis vena yang sama, penyelidikan mengenai a. C. Shitikova, di mana suntikan yang mendalam dibuat ke dalam phalanx terminal jari 3 mm, selepas itu hujung jari direndam dalam segelas 5 ml penyelesaian natrium klorida isotonik dan masa pendarahan dalam cahaya yang ditransmisikan diambil kira (Sekiranya penyelesaiannya sangat bernoda dengan darah, Kemudian untuk pemerhatian selanjutnya jari dipindahkan ke cawan yang lain). Jumlah darah yang hilang ditentukan oleh peningkatan jumlah bendalir dalam cawan (Masa pendarahan biasa - hingga 4 m, jumlah darah yang hilang - dari 0,01 kepada 0,4 ml).

Dalam ujian G. N. Sushkevich Jumlah darah yang hilang ditentukan oleh warna penyelesaian ammonia (0,04 %) , di mana kepingan kertas dengan noda darah direndam, oleh colorimetry menggunakan colorimeter perubatan.

Petunjuk ujian tempoh pendarahan, tidak normal, menunjukkan pelanggaran hemostasis vaskular platelet, Walau bagaimanapun, jika keputusan ujian ini normal, kehadiran thrombocytopati ringan tidak boleh dikecualikan.

Mengira jumlah platelet dalam darah

Mengira jumlah platelet dalam darah (di ruang mengira Goryaev dengan kontras fasa atau dengan warna atau menggunakan kaunter zarah) - Kaedah yang paling penting untuk mendiagnosis thrombocytopenia dan thrombocytopathies, berlaku dengan penurunan malar atau berkala dalam bilangan sel ini (Anomali Bernard-Soulier, MEA -Heggglina et al.).

Kiraan platelet juga mencadangkan, Adakah mungkin untuk menjalankan penyelidikan berfungsi lebih lanjut dan bagaimana cara ia dilakukan? (dengan atau tanpa preconcentration platelet, fotometrik atau mikroskopik, dll.. d.).

Mengkaji saiz platelet dalam smear – trombotsitometriya

Mengkaji saiz platelet dalam smear (trombotsitometriya) membolehkan anda membuat penghakiman awal mengenai populasi sel -sel ini dalam darah subjek dan mendapatkan maklumat mengenai beberapa anomali mereka, serta ketepuan platelet dengan butiran.

Bagi sesetengah thrombocytopathies (Sindrom Wiskott-Aldrich) platelet yang sangat kecil mendominasi darah (kepada 2 μm diameter), dengan yang lain - bentuk raksasa (Anomali Bernard-Soulier, Meya -Heggglina) — untuk 8 m atau lebih. Dalam beberapa thrombocytopathies, sel -sel ini miskin dalam granul (melihat. di bawah), Pada yang lain, pemusatan granul terganggu apabila platelet tersebar di kaca, yang menunjukkan pelanggaran tindak balas pelepasan granul dan bahan yang mereka ada, diperlukan untuk hemostasis. Semua sifat ini, serta keupayaan platelet untuk menyebarkan dan membentuk proses, Penilaian struktur sel -sel ini boleh dikaji menggunakan mikroskopi elektron konvensional dan pengimbasan, dan juga menggunakan optik gangguan mengikut Nomarski.

Penarikan balik darah secara semula jadi dilanggar dengan thrombocytopenia yang teruk (kurang dari 30-40 g dalam 1 l) dan dalam beberapa bentuk kekurangan platelet kualitatif, Selalunya - dengan trombositoastia Glanzmann, Uremic thrombocytopenia, dan lain -lain.

Kajian fungsi platelet pelekat-pelekat (AAFT)

Kajian fungsi platelet pelekat-pelekat (AAFT) - Pautan yang paling penting dalam diagnosis makmal kebanyakan thrombocytopathies. Pada masa ini, beberapa kaedah penyelidikan yang mudah dilaksanakan dan boleh didapati telah dibangunkan., termasuk visual, mikroskopik dan perkakasan (agregometer, microfilters, dll.) Pendaftaran fungsi ini, kaedah berikut boleh dianggap sebagai petunjuk:.

Kaedah untuk pengekalan platelet pada kaca (atau penapis)

Platelet dikira dalam darah vena sebelum dan selepas lulus pada kadar tertentu melalui lajur manik kaca standard atau melalui pigtail gentian kaca.; Berdasarkan kehilangan platelet dari darah, tahap pelekat mereka dinilai.

Lebih mudah diakses, Walaupun agak kurang tepat, Kaedah untuk menentukan bilangan platelet dalam darah sebelum dan selepas hubungannya untuk tempoh masa tertentu dengan permukaan dalaman kelalang, berputar pada kelajuan tertentu. Kaedah yang lebih tepat untuk menentukan pengekalan platelet pada penapis millipore (Diameter liang - 15-20 mikron). Dalam ujian ini, penilaian boleh dijalankan dengan meningkatkan kecerunan tekanan di atas dan di bawah penapis (Menyumbat liang dengan platelet dan agregat mereka membawa kepada peningkatan penunjuk ini).

Kaedah untuk mengkaji fungsi agregasi platelet

Ujian agregasi hemolisat berdasarkan keupayaan hemolisis sel darah merah yang dibasuh, dikaji untuk pembiakan 10^-2 dan 10^-6, menyebabkan pengagregatan dalam plasma ketika diaduk, mengandungi sebilangan besar platelet (Nisbah jilid plasma sitrat dan hemolisis - 1,0:0,2). Masa kejadian agregasi diambil kira (norma pada kepekatan tinggi hemolysate-11-17 s, pada rendah - 40-54 s) dan keterukannya. Dinamika proses dan keamatannya juga boleh dinilai secara fotometri (colorimeter perubatan, Penapis Hijau, kacau) dan pada agregografi reka bentuk.

Semasa merakam proses secara grafik, gunakan pencairan hemolisis yang tinggi (10^-6) membolehkan anda mendapatkan agregogram dua gelombang, di mana gelombang kedua dikaitkan dengan pembebasan stimulator agregasi endogen dari platelet - ADP, Catecholamines, thromboxane, dll.. Gelombang kedua ini mencirikan tindak balas pembebasan, Ia tidak diperhatikan dengan ketiadaan granul padat di platelet (Penyakit Kolam Penyimpanan) atau sekiranya melanggar reaksi pelepasan (Sindrom seperti aspirin, dll.).

Ujian pengagregatan hemolisis boleh dilakukan di mana -mana makmal, tidak memerlukan reagen khas.

Micromethod visual untuk menentukan agregasi platelet

Intinya adalah, Darah vena yang diperolehi di bawah keadaan silikonisasi stabil dengan jumlah berganda 3,8 % Natrium sitrat (nisbah 2,4:0,6 ml), ia disentrifugasi 6 min 100 rpm, selepas itu plasma kaya platelet yang dihasilkan digunakan 0,02 мл на предметные стекла и смешивают с таким же объемом агрегирующих агентов — АДФ, тромбином, коллагеном, норадреналином или ристомицином. Kepekatan akhir agen agregat dalam plasma darah di bawah kajian harus:

• ADF 0,5*10^-4 mmol / l;
• norepinephrine - 0,015%;
• Thrombin - 0,125 Unit/ml (Kepekatan kolagen dipilih secara eksperimen).

Adalah mungkin untuk menguji kedua -duanya lebih rendah, dan kepekatan agen agregat yang lebih tinggi. Pemilihan kepekatan mereka mungkin berbeza -beza bergantung kepada aktiviti dadah yang tidak sama rata dari pengeluar yang berbeza dan dengan pelbagai aktiviti sampel, Oleh itu, pelarasan awal kepekatan setiap ejen pada plasma biasa diperlukan.

Campuran agen agregat plasma yang kaya dengan platelet dicampur dengan menggoncang slaid, terhadap latar belakang gelap, menggunakan kaca pembesar, masa penampilan agregat dalam bentuk "ribut salji" direkodkan. Semasa menilai keputusan, bilangan platelet dalam plasma diambil kira. Sejak, Masa pengagregatan ADP, meningkat dari 27-37 s pada 400 T 1 L platelet sehingga 62-75 s pada 50 T 1 l, dan pengagregatan thrombin- masing-masing dari 40-52 hingga 79- 106 dengan.

Rakaman grafik proses pengagregatan

Pendaftaran grafik proses pengagregatan di bawah pengaruh agen agregat yang sama adalah kaedah yang sangat bermaklumat untuk kajian fungsional platelet. Dilakukan pada agregograf atau.

Semasa merakam secara grafik, bukan sahaja masa permulaan pengagregatan ditentukan, tetapi juga keamatannya (dengan sisihan lengkung dan kawasan agregat), Kehadiran gelombang agregasi pertama dan kedua - apabila menggunakan kepekatan rendah adrenalin dan ADP (Gelombang kedua mencirikan reaksi pembebasan), serta penyisihan patologi.

Pemeriksaan visual atau grafik agregasi platelet di bawah pengaruh ristomisin

Sangat Pemeriksaan visual atau grafik agregasi platelet di bawah pengaruh ristomycin adalah penting. Pengagregatan jenis ini rosak (Kepekatan akhir ristomycin 0.8-1.0 mg/ml) dengan salah satu diathesis hemorrhagic yang paling biasa - angiohemophilia (Penyakit Von Willebrand), Serta dengan Anomali Platelet Bernard-Soulier dan dengan beberapa jenis perencatan sintesis faktor von Willebrand (uremia, Perencatan imun, dll.. d.).

Penentuan Kuantitatif Faktor Von Willebrand dalam Plasma Darah

Penentuan kuantitatif faktor von willebrand dalam plasma darah dijalankan oleh agglutination ristomycin penggantungan platelet formalinized normal dalam pelbagai pencairan plasma bebas platelet yang dikaji.

Kaedah ini penting untuk diagnosis angiohemophnia dan perencatan sekunder sintesis faktor ini, dan untuk menilai keterukan kerosakan endothelial (Nodular, Atherosclerosis, dll.) dan kecenderungan untuk trombosis, di mana tahap faktor von willebrand dalam darah sering meningkat dengan ketara.

tahap faktor von willebrand Menunjukkan keupayaan endothelium untuk mensintesisnya (dikurangkan dalam aigiohemophilia) dan tahap kerosakan endothelial dalam vasculitis, aterosklerosis dan penyakit lain, berlaku dengan kerosakan pada lapisan dalaman saluran darah.

Untuk mendapatkan platelet normal tetap, platelet ditambah secara berurutan kepada plasma darah yang kaya dengan platelet individu yang sihat. 0,2 % Penyelesaian EDTA (0,5 ml pada 5 ml plasma) dan oleh 2 Min - Memperbaiki penyelesaian (20 ml 40 % formalin dalam 1000 ml penampan fosfat dengan 0,2 G EDTA, pH 6,4).

Campuran disimpan pada suhu +4 ° C sekurang -kurangnya 1 tidak, selepas itu ia tertakluk kepada sentrifugasi, Supernatan dikeluarkan, dan sedimen platelet dibasuh dua kali dengan penyelesaian penggantungan (satu kelantangan 3,8 % Penyelesaian sodium sitrat dan lima jilid larutan natrium klorida isotonik; pH diselaraskan ke 7,4). Penggantungan yang disediakan bagi platelet formalinisasi biasa dibungkus mengikut 1 ml dan disimpan pada -20 ° C. Kurva penentukuran pencairan dibina menggunakan plasma normal bebas platelet, dengan sampel yang mana platelet formalinized bercampur. Seterusnya, agglutination ristomycin ditentukan dalam campuran. Lengkung penentukuran digunakan untuk menentukan jumlah faktor von willebrand dalam plasma darah ujian. Platelet tetap lebih baik dipelihara apabila sedikit natrium azide ditambah kepada penyelesaian pengawet.

Ujian, mencerminkan agregasi platelet spontan

Semasa memeriksa pesakit dengan tromboembolisme atau dengan kecenderungan peningkatan trombosis dan iskemia, ujian dimasukkan ke dalam kaedah utama, mencerminkan agregasi platelet spontan, t. ia adalah. berlaku di seluruh darah atau plasma darah tanpa penambahan agen agregat.

Untuk mengenal pasti fenomena ini, mikroskopi smear darah memberi perhatian kepada nisbah bilangan platelet individu dan agregatnya, terdiri daripada 3-5 platelet atau lebih. Fenomena ini lebih baik diturunkan ketika melihat sedimen, diperoleh dengan zeitrif intensif- pencernaan plasma kaya platelet (20-30 min di 6000 RPM), stabil dengan penyelesaian sitrat atau edta-sitrat. Walau bagaimanapun, hasil yang lebih stabil diperolehi dengan kaedah berikut untuk menentukan agregasi spontan.

Kaedah Wu-Hoak

Kaedah Wu-Hoak berdasarkan, Darah itu diambil dari urat ke dalam dua tiub ujian, salah satunya mengandungi penyelesaian EDTA, dan di sisi lain - campuran penyelesaian EDTA yang sama dengan 4 % penyelesaian formalin. Setelah mencampurkan, kandungan tiub dibenarkan untuk menyelesaikannya 30 minit pada suhu bilik.

Semasa menetap, agregat menetap, dan platelet individu kekal di lapisan supernatan. Setelah menetap, bilangan platelet di lapisan supernatan di setiap tiub dikira. Biasanya, perbezaan bilangan platelet dalam kandungan kedua-dua tiub tidak melebihi 10-15 %, dengan peningkatan agregasi spontan ia meningkat.

Kaedah n. DAN. Tarasova

Encik kaedah. DAN. Tarasova (1984) Kehilangan platelet dari seluruh darah citrated ke dalam agregat diambil kira selepas menggegarkannya selama 3 minit pada shaker avu-1 pada kelajuan 90-100 kali per setiap 1 m.

Dalam tiub ujian dengan 0,5 ml darah, goyah, diperkenalkan 1 ml 1 % Penyelesaian formaldehid dalam larutan natrium klorida isotonik. Tiub kawalan kedua tidak digoncang, dan ke dalam darah yang terkandung di dalamnya orang yang sama diperiksa melalui 3 Penyelesaian formalin min juga disuntik.

Darah di kedua -dua tiub menetap 30 m, selepas itu bilangan platelet di lapisan supernatan dikira. Biasanya, perbezaan kiraan platelet tidak melebihi 20 %, Dengan peningkatan kecenderungan untuk pengagregatan, ia meningkat.

Dalam kes di mana pelanggaran dikesan semasa menggunakan ujian asas, mencirikan hemostasis platelet, menjalankan seperti yang diperlukan untuk menjalankan penyelidikan tambahan. Dari ini, yang paling penting adalah yang berikut.

Kajian tambahan untuk menentukan hemostasis platelet

Kajian bilangan megakaryocytes dalam myelogram dan tulang sumsum tulang dengan kajian morfologi sel -sel ini

Peningkatan ketara dalam bilangan megakaryosit di bahagian sumsum tulang, biasanya digabungkan dengan peningkatan yang lebih kurang dalam jumlah platelet dalam darah, diperhatikan dengan erythremia, trombositosis hemorrhagic dan penting dan penyakit myeloproliferative lain. Megakaryocytosis sederhana, Digabungkan dengan thrombocytopenia, Ciri -ciri purpura thrombocytopenic (Penyakit Werlhof).

Sekiranya terdapat aplasia sumsum tulang dan hipoplasia dari mana -mana asal, kandungan megakaryosit dalam bahagian sumsum tulang dikurangkan, dan bilangan platelet dalam darah periferal.

Amegakaryocytosis separa diperhatikan dengan kekurangan thrombocytopoietin (bentuk thrombocytopenia kongenital yang jarang berlaku), Penampilan antibodi antimegakaryocyte dalam darah, aplasia megakaryocytes separa penting (boleh mendahului perkembangan leukemia).

Perubahan morfologi dan sitokimia dalam megakaryocytes diperhatikan dalam banyak thrombocytopathies.

Kajian mikroskopik elektron ultrastruktur platelet

Kajian mikroskopik elektron ultrastruktur platelet adalah penting untuk diagnosis beberapa thrombocytopathies, di mana bilangan granul bukan protein ketumpatan optik tinggi tidak hadir atau dikurangkan dengan ketara (mengandungi ADP, serotonin, daripada catecholamines, kalsium, dll.), atau protein α-granul, yang tipikal untuk sejumlah thrombocytopathies, dikelompokkan ke dalam kumpulan penyakit kolam penyimpanan, atau penyakit kekurangan granul.

Kecacatan dalam alat kontraksi juga boleh dikesan. (Sistem Microtubule) dan lysosomes platelet.

Semasa mengimbas mikroskopi elektron atau mengkaji platelet menggunakan optik gangguan menurut Nomarski, kecacatan dalam penetapan platelet di permukaan asing juga dapat dikesan, mereka menyebarkannya, Pembentukan menembak, pemusatan dan rembesan granul, yang tipikal untuk pelbagai jenis thrombocytopathies.

Penentuan antibodi antiplatelet oleh immunofluorescence- Penyelidikan dalam penggantungan platelet immunoglobulin, dikaitkan dengan sel -sel ini – Kaedah Dixon

Kaedah yang canggih ini memungkinkan untuk membezakan antara thrombocytopenias imun dan bukan imun..

Walau bagaimanapun, dalam bentuk penyakit yang paling teruk dengan thrombocytopenia yang teruk, ia tidak boleh diterima, Oleh kerana penentuan immunoglobulin terikat memerlukan cukup besar (lebih daripada 40-50 g dalam 1 l) Bilangan sebagai platlet.

Penentuan jangka hayat platelet autologous berlabel

Penentuan jangka hayat platelet autologous berlabel memungkinkan untuk membezakan thrombocytopenia dari jangka hayat biasa platelet dalam edaran (mengenai 9 Malam) dan bentuk penyakit dengan jangka hayat sel -sel ini.

Yang pertama paling sering dikaitkan dengan penurunan pengeluaran platelet di sumsum tulang, yang kedua - dengan kematian mereka yang dipercepatkan, atau dengan tindakan antibodi antiplatelet (Dengan thrombocytopenia autoimun, jangka hayat platelet dikurangkan hingga beberapa jam), atau dengan kehilangan sel -sel ini intensif ke dalam agregat dan trombi dengan pembekuan intravaskular yang disebarkan atau trombosis besar -besaran (Penggunaan thrombocytopenia).

Penentuan Kuantitatif Kandungan dalam Plasma Darah Sebelum dan Selepas Pengagregatan Faktor Platelet

Penentuan kuantitatif kandungan dalam plasma darah sebelum dan selepas pengagregatan beberapa faktor platelet - faktor fosfolipid membran 3, Kandungan α-granul (Faktor Antiheparin 4, β-thromboglobulin, Faktor mitogenik platelet) dan granul bukan protein ketumpatan elektron-optik yang tinggi (Serotonin, Catecholamines, ADF), serta hidrolase asid.

Kajian -kajian ini memberikan gambaran mengenai kandungan struktur yang berkaitan dan komponen mereka dalam platelet, mengenai pembebasan mereka ke plasma semasa proses pengagregatan, dan juga mengenai dalaman- Pengaktifan platelet vaskular, disertai dengan pembebasan platelet ke dalam plasma darah dengan peningkatan kepekatan komponen padat dan α-granul di kedua (Faktor Antiheparin 4, β-thromboglobulin, dll.).

Kaedah untuk penyelidikan kuantitatif faktor platelet adalah penting untuk mengenal pasti sejumlah thrombocytopathies (Pelanggaran keselamatan butiran dan komponen mereka, Paresis tindak balas untuk pembebasan komponen ini, peningkatan kandungan mereka dalam plasma darah kerana dalaman yang sengit- Lekatan vaskular dan agregasi platelet, dll.). Sejumlah thrombocytopati dicirikan oleh penurunan kandungan faktor platelet dalam membran 3 atau melanggar ketersediaannya untuk mengambil bahagian dalam proses pembekuan darah.

Kajian ciri -ciri biokimia platelet dan struktur individu mereka

Kajian ciri -ciri biokimia platelet dan struktur individu mereka - Stroma, Granules bersama, mitokondria, dll.. d. Benarkan anda mendokumenkan sambungan antara pelbagai jenis patologi dan disfungsi platelet dengan jenis kekurangan enzim tertentu (Kekurangan siklooxygenase, Thromboxane Synthetase, dll.), dengan pelanggaran komposisi lipoprotein membran, perlu untuk interaksi dengan agen agregat, dll. d.

Kajian sedemikian hanya tersedia untuk makmal penyelidikan yang dilengkapi dengan baik dan oleh itu tidak digunakan dalam amalan yang meluas..