Cytochemical pētījums ejakulāta

Cytochemical reakcija, veica ar ejakulāta, sniedz ieskatu ķīmisko sastāvu un funkcionālo aktivitāti tās šūnas.

Noteikšana skābes fosfatāzes aktivitātes ejakulāta

Acid fosfatāzes aktivitāte izšļākt vairākas reizes lielākas nekā tās darbības asinīs. Acid fosfatāzes ir daļa no prostatas sekrēta, tā ražošanu ir stimulē vīriešu gonadotropīnu. Izmantojot cytochemical reakcijas tas tiek konstatēts spermas un citām šūnām no ejakulāta. Aktivitāti nosaka, tās metode Goldberg - Barka.

Reaģenti.

1. Formalīna alkohols (viena daļa no gatavs 40 % formalīna izšķīdina deviņās daļās 96% etilspirts).

2. Pararozanilin: 1 g pamata fuchsin par Phuc- sinosernistoy acid izšķīst apkures laikā 25 ml 2 N sālsskābes; atdzesēts, filtrēts un uzglabāt ledusskapī. Reaģents izturīgs.

3. Ūdens šķīdums, nātrija nitrāts 4 %. 4. Metilspirta zaļa risinājums acetāta buferi 2 % (pH - 5). Iegūtais šķīdums tika mazgāti ar hloroformu, Tad sajauc apmēram vienādos daudzumos hloroforma un 2 % metil zaļš šķīdums. Krītoties dienas laikā, un pēc tam krāsotas purpura krāsā, hloroforma tika noņemts ar dalāmo piltuvi.

5. Inkubatsionnaya vide, kas sastāv no divām sastāvdaļām.

• Komponents: 20 mg naftolu-A5-fosfāta tika izšķīdināta 0,5 (0,3) ml dimethylformamide, pievienot 40 ml 0,1 Nātrija acetāta N šķīdumu un filtrē caur filtra papīru; Sagatavojot pētījumu diena.
• B-komponents: 8 pilieni 4 % nātrija nitrāts šķīdums tika samaisīts ar 8 pilieni pararozanilina; ir ex tempore. Abām inkubācijas vidēja sastāvdaļas iegūšanas ir savienots (pH 5,2-5,4). Ja nepieciešams, labot jebkuru pH 50 % etiķskābe, risinājums kodīgu sārmu.

Metode. Fresh izšļākt centrifugē, kad liels skaits spermas iztikt centrifugēšanas. No nogulsnēs sagatavot pulēta stikla plānas insultu, ka, kā arī asins uztriepes, air-dried. Kaltētas uztriepes fiksētās, iegremdējot tos vārglāzē ar formalīnā alkohola 30 no (vairāk ne) un mazgā ar destilētu ūdeni. Tad uztriepes ir iegremdēti vārglāzē ar inkubācijas nesēju un ievieto inkubatorā pie temperatūras 37 ° C 2 nē. Pēc tam, tie skaloja destilētā ūdenī, iegremdē 10 min glāzi ar šķīdumu, metil zaļš (counterstained par kodolu), ātri jānomazgā ar ūdeni, nosusina ar filtrpapīru un ar imersijas mikroskopa sistēma pārbaudīts.

Acid fosfatāzes aktivitāti var izteikt ar vidējo cytochemical faktors (SCK) līdz polukolychestvennomu metode Astaldi-Verga. Saskaņā ar formulu

SCK =(3* 2 * b * 1)/100

kur skaitļi skaitītājā norāda krāsu intensitāti (maksimālais - 3, mērena - 2, pēdas - 1), un burti - par šūnu daļu ieskaita noteiktu krāsu intensitāti; skaitlis 100 saucējā - skaitīts kopējais šūnu skaits.

Piemēram, skaitīti 100 šūna, no kuriem ir maksimālais krāsas intensitāti 20 šūna, mērena - 20 un ar šādu - 60 šūna. Šeit:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6

Spermatozoīdu skābes fosfatāzes atrodas vienībā kibbles sarkani-oranža augšējā daļā, galvas.

Aizņemts hromatīna daļa galvas ir zaļa un nesatur skābes fosfatāze.

Difūzāks bāli krāsa uz skābes fosfatāzes tiek konstatēts ap apakšējo daļu galvas, un dažreiz tas attiecas arī uz kakla spermu. Middle cytochemical koeficients skābes fosfatāzes normālā spermas ejakulāta ir 2,0-2,4.

Citoplazmā šūnu spermatoģenēzi atklāja uzkrāšanos granulu, spilgti krāsotas īpašs (sarkano apelsīnu) krāsa. In apliecinošajiem šūnās spirālveida sēklas kanāliņu kanāliņu, bieži krasi pozitīvi krāso skābes fosfatāzes, caurspīdīgs bez krāsas galva (xromatin) sperma. Histiocytes un makrofāgi satur dažus graudiņus, pozitīvi krāso skābes fosfatāzes. Izolētos limfocīti, un dažreiz neitrofilu ir atsevišķi granulas, kuru darbību skābes fosfatāzes.

Noteikšana sukcināta dehidrogenāzes aktivitāte (SDG) in ejakulāta

Sukcinatdegidrogenaza - Fermentu, piedalās oksidēšanās-reducēšanās reakcijas, ietverta šūnas ievērojamā skaitā ejakulāta. Tomēr raksturs maiņu savas darbības dažādos patoloģisko procesu joprojām nav labi izprasts. Sukcināta dehidrogenāzes aktivitāte šūnās nosaka ar modificētu metodi Nartsissova.

Reaģenti.

1. Acetons-Trilon (acetons - 60 ml, distillirovannaya ūdens - 40 ml, Trilon B - 250 mg).

2. Metilhlorīdu zaļš šķīdums 2 % (pats krāsviela, kas tiek izmantots, lai skābes fosfatāzes).

3. Inkubatsionnaya vide, kas sastāv no šādām sastāvdaļām:

un) fosfāta buferis (pH 7,2-7,4) — 10 ml;

līdz) 5,4 % Nātrija sukcināta - 10 ml;

uz) kompleksona III (13 mg atšķaidīts 5 ml destilēta ūdens);

g) destilēts ūdens - 5 ml;

d) nitrotetrazolium violeta (10 mg atšķaidīts 10 ml ūdens).

Visas sastāvdaļas sajauc vienā paketē un uzglabā ledusskapī. Sagatavots medijs var izmantot atkārtoti - par 10 dienas vai vairāk.

Metode. Uztriepes, sagatavota no ejakulāta, fiksēts acetonu par Trilon- 30 no, mazgā ar destilētu ūdeni un žāvē gaisā. Tad uztriepes ir iegremdēti inkubācijas barotnē un ievieto inkubatorā pie temperatūras 37 ° C 1 nē, pēc tam tie tiek mazgāti ar destilētu ūdeni un dokrashivayut metil zaļš par 10 m. Pēc tam atkal ātri nomazgā ar ūdeni, nosusina ar filtrpapīru un ar imersijas mikroskopa sistēma pārbaudīts.

Normal sperma ir augsts aktivitātes sukcināta dehidrogenāzes, pārstāv lieli zili violeti granulu, ka, apvienojot kopā, veido blīvu masu, uzpildes kakla spermu, daži sperma individuālie granulas ir atrodami ap galvu.

Aprēķināt sakausē kopā granulas nav iespējama, Tāpēc, lai noteiktu sukcināta dehidrogenāzes- krāsas porciju spermatozoīdu aktivitāti mēra mikrometriem. Gar krāsotas speciāli sukcināta dehidrogenāzes par spermu tiek vērtēti par pakāpi darbības fermentu spermu. Ar acu mikrometru un objektu mikrometru garumu mēra konkrētā krāsainās daļas 100 spermatozoidax. Pievienojot garums skaitāmi iekrāso sadaļās spermatozoīdu, un dalot iegūto skaitli ar 100, saņem vidējo garumu, paužot suktsinatdegidrogenaznuyu darbību vienam spermas. Parasti, tas ir 4,3 ± 0,7 m. Šis aprēķins LDH aktivitāte ir visvairāk informatīvs, un tāpēc ir ieteicams izmantot pētniecības nolūkos.

Par plašu pielietojumu praksē, šī metode ir diezgan sarežģīti, Vēlams, lai izteiktu summu sukcināta dehidrogenāzes Astaldi-metode Verga. Middle cytochemical koeficients LDH no spermas ejakulāta ir normāls 2,7 ± 0,3.

Šūnās spermatoģenēzi LDH aktivitāte ir konstatēta veidā klasteru lielu zili violeta granulu, bieži saplūst lielās pikas, atrodas dažādās jomās citoplazmu. Middle cytochemical faktors šūnās spermatoģenēzi sasniedz 2,0. Ar nobriešanas šūnām ejakulāta un palielina aktivitāte LDH in nobriedušu spermatozoīdu pārsniedz 2,0. Citoplazmā dažu limfocītu atrasts kibble SDG.

Noteikšana peroksidāzes aktivitātes ejakulāta

Sperma, spermatoģenēzi šūnas un atbalsta šūnas spirālveida sēklas kanāliņu kanāliņu peroksidāzes pazudis.

Neutrophilic granulocītu izšļākt peroksidāzes aktivitāte ir izteikta, lai lielā mērā un var mainīties atkarībā no patoloģiskā procesa, kā arī perifēriskās asins. Peroksidāzes aktivitātes līmenis neitrofīlu ir svarīga, lai novērtētu to funkcionālo stāvokli un darbību iekaisuma procesa vīriešu dzimumorgānus. Iekrāso uztriepes spermas Graham-Knoll un grāmatvedības darbības enzīma Astaldi-Verga ir analogi asins uztriepe.

Peroksidāzes aktivitāte šūnās ejakulāta nosaka metode Graham-Knoll.

Reaģenti.

1. Formalīna alkohols (tas pats, un ka skābes fosfatāzes).

2. Peroksidaznыy reaģents: ʙenzidin (uz galu skalpeli) izšķīdina 6 ml 96 % etilspirts, pievienot 4 ml destilēta ūdens 0,02 ml 3 % ūdeņraža peroksīds. Reaģents izmantojamas 5-6 dienām.

3. Romanovsky Dye atšķaidījumā 1-2 pilieni uz 1 ml destilēta ūdens.

Metode. Svaigi sperma uztriepes tika noteiktas 30 formalīns ar alkoholu, mazgā ar tekošu ūdeni un žāvē. Tad ieber insultu peroksidāzes Reaģents 5-7 minūtes, rūpīgi jānomazgā tekošā ūdenī un žāvē. Pēc tam viņi dokrashivayut 15 20 min krāsu Romanovsky, mazgāt ar tekošu ūdeni, žāvēti un mikroskopiruyut izmantojot iegremdēšanas mikroskopa sistēmu.

Ja pozitīva reakcija uz peroksidāzi in neutrophilic granulocītu atklāj galvenos zeltaini brūnas granulas lielā skaitā. Ar lielu skaitu balto asinsķermenīšu aprēķināšanai nepieciešamās Vidēji cytochemical faktors (SCK). No histiocytes individuālā peroksidāzes citoplazma ir klāt kā mazos kopumos, piemēram, granulām.

Noteikšana glikogēna ejakulāta

Izmaiņas glikogēna saturu dažādās šūnās ietekmēt savu funkciju vai pierādījumus attīstības patoloģiskā procesa. Noteikšana glikogēna šūnās tiek veikta ar McManus.

Reaģenti.

1. Ūdens šķīdums periodiskās skābes 1 % (gatavojas izmantot).

2. Sernistaya ūdens: 5 ml 10 % kālija vai nātrija metabisulfīts, 5 ml 1 N sālsskābes, ūdens 100 ml (gatavojas izmantot).

3. Reaģents Shiffa: 1 g pamata fuchsin par fuksinosernistoy skābes, iepriekš sasmalcināta porcelāna piestā, izšķīdina pastāvīgi kratot 5 min 200 ml verdoša destilēta ūdens, laiž caur papīra filtru un tika pievienota ar dzesēšanas uz 50 ° C 20 ml 1 N sālsskābes, un kad atdzesēts līdz 25 ° C - 1 g kālija vai nātrija metabisulfīts. Gatavi reaģents ir jāuzglabā ledusskapī 24 ч после чего он просветляется и стано вится пригодным для употребления

4.Водный раствор метилового зеленого 2 %, промытый хлороформом

5.Химически чистый метиловый спирт.

Metode.

Тонкие высушенные мазки эякулята фиксируют химически чистым метиловым спиртом в течение 3 m, ополаскивают дистиллированной водой и опускают в стаканчик с 1 % водным раствором йодной кислоты на 5 m. Затем мазки промывают дистиллированной водой, высушивают, ополаскивают в сернистой воде и снова высушивают.

Далее опускают мазки в стаканчик с реактивом Шиффа на 15 m, izskalot trijās daļās sērūdeņu (līdz 3 min katra), mazgāt 10 min ūdens un šūnu kodoliem dokrashivayut 3 min metil green. Tad atkal jānoskalo ar ūdeni tamponiem, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с помощью иммерсионной системы микроскопа.

В зрелых сперматозоидах гликоген отсутствует. В цитоплазме молодых сперматозоидов, особенно с «воротничком», выявляются следы гликогена (±), иногда в виде единичных гранул в верхней части головки или в области «воротничка».

Šūnās spermatoģenēzi гликоген обнаруживается в большом количестве в виде вишнево-красных гранул, заполняющих всю цитоплазму. По мере созревания клетки теряют гликоген вплоть до исчезновения его в зрелых сперматозоидах. Сперматоциты содержат гликоген не только в цитоплазме, но и в ядре. В поддерживающих клетках извитых семенных канальцев гликоген располагается в виде вишнево-красных гранул и диффузно. Зрелые нейтрофильные гранулоциты в эякуляте, как и в мазках периферической крови, содержат значительное количество гликогена. При хроническом простатите в нейтрофильных гранулоцитах эякулята значительно возрастает количество гликогена и повышается активность пероксидазы. В единичных лимфоцитах в норме иногда встречаются гранулы гликогена.

Makrofāgi содержат следы гликогена Фон мазков эякулята окрашивается в вишнево-красный цвет, что свидетельствует о наличии в плазме эякулята большого количества гликозаминогликанов (mukopolisaxaridov).

Определение рибонуклеиновой кислоты (RNS) in ejakulāta

Повышенное содержание РНК в клетках свидетельствует о высокой активности их в отношении роста, секреторной, синтетической и другой деятельности. Снижение содержания РНК в молодых клетках часто сопряжено с пониженной способностью этих клеток к регенерации. Содержание РНК в клетках определяется методом Курника.

Reaģenti.

1. Реактив Курника: готовят отдельно 2 % растворы метилового зеленого и пиронина, раствор метилового зеленого тщательно промывают хлороформом; рабочий раствор красителя приготавливают путем смешивания 2 % раствора пиронина (12,5 ml) un 2 % metil zaļš šķīdums (7,5 ml) с добавлением 30 ml destilēta ūdens. Краситель стойкий, uzglabāta ledusskapī.

2. Фиксатор — химически чистый метиловый спирт.

Metode. Мазки фиксируют метиловым спиртом в течение 3 m, окрашивают рабочим раствором пиронин-метилового зеленого 15 m, быстро ополаскивают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа. РНК окрашивается пиронином в ярко-красный цвет, ядра клеток — метиловым зеленым в зеленый.

Зрелые сперматозоиды не содержат РНК. Клетки сперматогенеза богаты РНК, количество которой убывает в клетках по мере их созревания. У сперматогоний цитоплазма насыщенно-розового цвета, у сперматоцитов она бледнее, un у сперматид бледно-розовая. У юных сперматозоидов с «воротничком» в розовый цвет окрашивается преимущественно «воротничок».

Sperma, находящиеся на последней стадии своего развития, в поддерживающих клетках извитых семенных канальцев теряют остатки розовой субстанции (RNS) и превращаются в зрелые сперматозоиды.

В клетках сперматогенеза содержится большое количество гликогена, РНК и значительно выражена активность СДГ и КФ. Bet, parasti, эти клетки единичные в эякуляте, поэтому подсчет СЦК нецелесообразен. В таких случаях ограничиваются описательной формой заключения.

Цитохимическая характеристика лейкоцитов является важным показателем их функциональной активности. Учет количества вещества в лейкоцитах эякулята проводится так же, как и в других клетках эякулята и в периферической крови.

В окрашенных обычными методами мазках эякулята (азурозиновыми смесями, гематоксилин-эозином и пр.), а также в нативных препаратах не всегда легко различить лейкоциты, šūnas spermatoģenēzi, эпителий предстательной железы, гистиоциты и другие элементы.

Цитохимические методы в сочетании с морфологическими нередко помогают установить вид клеток. Tik, выраженная активность пероксидазы, представленной крупными золотисто-коричневыми гранулами, заполняющими всю цитоплазму клетки, характерна для зрелых нейтрофильных гранулоцитов, у других клеток такая реакция не наблюдается. Выраженная реакция на гликоген типична для нейтрофильных гранулоцитов и клеток сперматогенеза, но последние не обладают пероксидазной активностью. РНК содержится в клетках сперматогенеза и отсутствует в зрелых гранулоцитах. Клетки сперматогенеза обладают выраженной реакцией на кислую фосфатазу, а в нейтрофильных гранулоцитах она выражена очень слабо и т. d.