Kraujagyslių-trombocitų hemostazės tyrimo

Šios hemostazės dalies sutrikimai gali atsirasti polinkio į hemoragiją ar trombozę, Priklausomai nuo to, kokie tyrimo metodai pasirenkami. Be, Visi trombocitų analizės metodai Hemostazė yra padalinta į pagrindinius ir papildomus, arba antrosios eilutės testai, kurie taikomi tik jei, Jei testai atskleidžia bet kokius pažeidimus. Į pagrindinį (Pagrindinis) Taikomi šie testai.

Atsparumo testai (kaulų lūžių) Kapiliarai - rankogaliai, konservuota, Antrooresistometrija

Iš šių testų labiausiai prieinami ir tuo pačiu metu gana informatyvūs Konchalovsky-Rumpel-Leede testas.

Vertinimas atliekamas pagal kraujavimų skaičių ir dydį, susiformavusi viršutinėje dilbio delno paviršiaus dalyje (ratu su skersmeniu 5 cm) Po 5 minučių suspaudimo peties su rankogalyje esant slėgiui 12-13,3 kPa (90–100 mm Hg. Str.). Rezultatus atsižvelgiama per 5 Min po rankogalių pašalinimo. „Petechiae“ skaičius yra daugiau nei 10 rodo padidėjusį mikroversių trapumą, kuri dažnai siejama su trombocitopenija arba sutrikusi angiotrofine trombocitų funkcija. Taip pat atsižvelgiama į kraujavimus po pačiu rankogaliu..

Stiklainio pavyzdys atliekamas tose pačiose odos vietose, kai laipsniškai padidėja neigiamas slėgis - nuo 20 kPa, (150 mmHg. Str.) ir mažesnis. Vertinant rezultatus, suskaičiuojami Petechiae, pasirodė po bankais.

Kapiliarų kraujavimo trukmės ir dydžio bandymai

Su klasikiniu Kunigaikščio testas Apatinė ausies laužo pagalvėlė, šiek tiek sušildžius, pradurta iki 3,5–4 mm gylio. Kraujavimo laikas tokiam tyrimui paprastai neviršija 4 m,, o kraujo lašai ant filtravimo popieriaus yra palyginti maži ir pradeda greitai sumažėti maždaug nuo 1–1,5 minučių po punkcijos. Su sunkia trombocitopenija (mažiau 20 T 1 L) ir sunki trombocitų disfunkcija, kraujavimo laikas padidėja iki 20–40 minučių, Kraujo dėmės tampa žymiai didesnės ir ilgą laiką nesumažėja arba bangų sumažėjimas, Tada dar kartą padidinkite. Kunigaikščio testas nėra pakankamai jautrus, į 2/3 Pacientams, sergantiems trombocitopatija, tai rodo normalius rezultatus.

Jautresni mėginiai, kuriame kraujavimo laikas tiriamas dirbtinai sukurto venų sustingimo fone, Kodėl ant peties dedamas rankogalių iš kraujospūdžio matavimo įtaiso, o slėgis palaikomas viso tyrimo metu, lygus 5,3 kPa, (40 mmHg. Str.). Tokio sustingimo fone Zondo borhgrevinka-vaalera Ant viršutinio dilbio trečdalio delno paviršiaus skersiniai gylio pjūviai yra naudojami su brizu 1 mm ir 8–10 mm ilgio (normalus kraujavimo laikas - iki 10 m,), ir Ivey ir kt. Imtyje.. toje pačioje dilbio srityje trys skersiniai pradūrimai su gyliu 3 mm (normalus kraujavimo laikas - iki 7 m,).

Atsižvelgiant į tos pačios veninės sustingimo foną, A. IŠ. Shitikova, kuriame gili injekcija atliekama į piršto galinę falangą 3 mm, po kurio piršto galas panardinamas į stiklinę 5 ML izotoninio natrio chlorido tirpalo ir kraujavimo laikas perduodamoje šviesoje atsižvelgiama (Jei tirpalas yra labai intensyviai dažytas krauju, Tada tolesniam stebėjimui pirštas perkeliamas į kitą tokią taurę). Prarastą kraujo kiekį lemia padidėjęs skysčių tūris puodeliuose (normalus kraujavimo laikas - iki 4 m,, prarasto kraujo tūris - iš 0,01 į 0,4 ml).

G bandyme. N.. Sushkevichas prarastą kraujo tūrį lemia amoniako tirpalo spalva (0,04 %) , kurioje popieriaus lapuose su kraujo dėmėmis panardinami, pagal kolorimetriją naudojant medicininį kolorimetrą.

Kraujavimo trukmės testų požymiai, nenormalus, nurodyti ryškų trombocitų ir kraujagyslių hemostazės pažeidimą, Tačiau jei šių testų rezultatai yra normalūs, negalima pašalinti lengvų trombocitopatijų.

Skaičiuojant trombocitų skaičių kraujyje

Skaičiuojant trombocitų skaičių kraujyje („Goryaev“ skaičiavimo kameroje su fazės kontrastu arba su atspalviu arba naudojant dalelių skaitiklius) - Svarbiausias metodas diagnozuoti trombocitopeniją ir trombocitopatijas, pasireiškia pastoviu ar periodiniu šių ląstelių skaičiaus sumažėjimu (Bernard-Soulier anomalijos, MEA - Hegglina ir kt.).

Taip pat siūloma trombocitų skaičius, Ar įmanoma atlikti tolesnius funkcinius tyrimus ir kokiu būdu jie turėtų būti vykdomi? (su išankstiniu koncentracija ar be jos, Fotometriškai arba mikroskopiškai, kt.. d.).

Tyrinėjant trombocitų dydį tepinėlyje – trombotsitometriya

Tyrinėjant trombocitų dydį tepinėlyje (trombotsitometriya) Leidžia jums iš anksto įvertinti skirtingą šių ląstelių populiaciją tiriamojo kraujyje ir gauti informacijos apie daugelį jų anomalijų, taip pat trombocitų prisotinimas granulėmis.

Kai kurioms trombocitopatijoms (Wiskott-Aldrich sindromas) labai maži trombocitai vyrauja kraujyje (į 2 µm skersmens), Su kitais - milžiniškos formos (Bernard-Soulier anomalijos, Meya - hegglina) - Norėdami 8 m arba daugiau. Daugelyje trombocitopatijų šios ląstelės yra prastos granulėse (cm. žemiau), Kiti, o tai rodo granulių išleidimo reakcijos pažeidimą, būtina hemostazei. Visos šios savybės, taip pat trombocitų gebėjimas skleisti ir formuoti procesus, Šių ląstelių struktūros įvertinimą galima ištirti naudojant įprastinę ir skenavimo elektronų mikroskopiją, taip pat naudotis trukdžių optika pagal „Nomarski“.

Kraujo krešulio atitraukimas Natūraliai pažeidžiamas dėl sunkios trombocitopenijos (Mažiau nei 30–40 g colių 1 L) ir kai kuriose kokybinio trombocitų trūkumo formose, Dažniausiai - su Glanzmanno trombocitoastija, Ureminės trombocitopatijos ir kt..

Trombocitų klijų agregacijos funkcijos tyrimas (AAFT)

Trombocitų klijų agregacijos funkcijos tyrimas (AAFT) - Svarbiausias ryšys daugumos trombocitopatijų laboratorinėje diagnozėje. Šiuo metu buvo sukurta keletas lengvai įmanomų ir viešai prieinamų tyrimų metodų., įskaitant vaizdinį, Mikroskopinė ir aparatūra (agregometrai, Mikrofiltrai ir kt.) Šios funkcijos registracija gali būti laikomi šie metodai:.

Trombocitų sulaikymo ant stiklo metodai (arba filtrai)

Trombocitai yra skaičiuojami venų kraujyje prieš ir po to, kai jis tam tikru greičiu praėjo per standartinę stiklo karoliuko koloną arba per stiklo pluošto košę.; Remiantis trombocitų praradimu iš kraujo, vertinamas jų klijavimo laipsnis.

Labiau prieinama, Nors šiek tiek mažiau tikslus, metodas, skirtas nustatyti trombocitų skaičių kraujyje prieš ir po jo kontakto tam tikrą laiką su vidiniu kolbos paviršiumi, sukasi tam tikru greičiu. Tiksliau (Poro skersmuo - 15–20 mikronų). Atliekant šiuos bandymus vertinimą galima atlikti padidinus slėgio gradientą virš ir po filtru (Porų užsikimšimas trombocitais ir jų užpildais padidina šį indikatorių).

Trombocitų agregacijos funkcijos tyrimo metodai

Hemolizato agregacijos testas remiantis plaunamų raudonųjų kraujo kūnelių hemolizato gebėjimu, studijuojamas veisimui 10^-2 ir 10^-6, sukelkite agregaciją jos plazmoje, kai maišoma, kuriame yra daugybė trombocitų (Citrato plazmos ir hemolizato tūrio santykis - 1,0:0,2). Atsižvelgiama į agregacijos atsiradimo laiką (norma esant didelei hemolizato koncentracijai-11-17 s, žemai - 40–54 s) ir jo sunkumas. Proceso dinamiką ir jo intensyvumą taip pat galima įvertinti fotometriškai (Medicinos kolorimetras, Žalias filtras, Maišymas) ir dėl bet kokio dizaino agregografo.

Įrašydami procesą grafiškai, naudokite didelį hemolizato praskiedimą (10^-6) leidžia jums gauti dviejų bangų agregogramą, kurioje antroji banga yra susijusi su endogeninių agregacijos stimuliatorių išsiskyrimu iš trombocitų - ADP, katecholaminų, „Thromboxane“ ir kt.. Ši antroji banga apibūdina išsivadavimo reakciją, Tai nepastebima, jei nėra tankių granulių trombocituose (saugojimo baseino ligos) arba pažeidus išleidimo reakciją (Aspiriną ​​panašus sindromas ir kt.).

Hemolizato agregacijos testą galima atlikti bet kurioje laboratorijoje, nereikalauja jokių specialių reagentų.

Vaizdinis mikrometodas trombocitų agregacijai nustatyti

Jo esmė yra, Tas veninis kraujas, gautas silikonizacijos sąlygomis, yra stabilizuotas dvigubu tūriu 3,8 % natrio citratas (santykis 2,4:0,6 ml), Jis centrifuguotas 6 minučių 100 RPM, po to taikoma gauta trombocitų turtinga plazma 0,02 ml ant stiklinių skaidrių ir sumaišytas su tuo pačiu agreguojančių agentų tūriu - ADP, trombinas, Kolagenas, norepinefrinas arba ristomicinas. Galutinės agreguojančių agentų koncentracijos tiriamoje kraujo plazmoje turėtų būti:

• ADT 0,5*10^-4 mmol / l;
• norepinefrinas - 0,015%;
• trombinas 0,125 ed / ml (Kolageno koncentracija pasirenkama eksperimentiniu būdu).

Galima išbandyti abu žemesnius, ir didesnės agreguojančių agentų koncentracijos. Jų koncentracijos pasirinkimas gali skirtis priklausomai nuo nevienodo skirtingų gamintojų vaistų aktyvumo ir skirtingos mėginių veiklos, Todėl būtina išankstinis kiekvieno agento koncentracijos normalioje plazmoje koregavimas.

Trombocitų turtingas kraujo plazmos agregavimo agentų mišinys sumaišomas purtant skaidrę, Tamsiame fone, naudojant padidinamąjį stiklą, užfiksuotas užpildų išvaizdos laikas „sniego audra“. Vertinant rezultatus, atsižvelgiama į trombocitų skaičių plazmoje. Taip, ADP agregacijos laikas, padidėja nuo 27-37 s 400 T 1 l trombocitų iki 62–75 s 50 T 1 L, ir trombino agregacija- atitinkamai nuo 40–52 iki 79- 106 nuo.

Grafinis agregacijos proceso įrašymas

Grafinė agregacijos proceso registracija veikiant toms pačioms agreguojantiems agentams yra labai informatyvus metodas trombocitų funkciniam tyrimui. Atliktas agregografuose arba.

Įrašant grafiškai, nustatomas ne tik agregacijos pradžios laikas, bet ir jo intensyvumas (kreivės nukrypimo ir agraminės srities srities), Pirmosios ir antrosios agregacijos bangų buvimas - naudojant mažą adrenalino ir ADP koncentraciją (Antroji banga apibūdina išsivadavimo reakciją), taip pat patologinis išskaidymas.

Vizualinis ar grafinis trombocitų agregacijos tyrimas veikiant ristomicinui

Labai Svarbu vizualinis ar grafinis trombocitų agregacijos tyrimas, veikiant ristomicinui. Šio tipo agregacijos nutrūksta (Galutinė ristomicino koncentracija 0,8–1,0 mg/ml) su viena iš labiausiai paplitusių hemoraginės diatezės - angiohemofilija (von Willebrando liga), taip pat su Bernard-Soulier trombocitų anomalija ir su kai kuriais įgytomis von Willebrand faktoriaus sintezės slopinimo rūšimis (uremija, imuninis jo slopinimas ir kt.. d.).

Kiekybinis von willebrand faktoriaus nustatymas kraujo plazmoje

Kiekybinis von Willebrand faktoriaus nustatymas kraujo plazmoje yra atliekamas rintomicino agliutinacija. Normalios formalinuotų trombocitų suspensija įvairiuose plazmose, kuriose nėra trombocitų be plazmos, plazmoje..

Šis metodas yra svarbus tiek norint diagnozuojant angiohemofniją, tiek antrinį šio faktoriaus sintezės slopinimą, ir įvertinti endotelio žalos sunkumą (vaskulitas, aterosklerozė ir kt.) ir polinkis į trombozę, kuriame von willebrand faktoriaus lygis kraujyje dažnai žymiai padidėja.

von willebrand faktoriaus lygis rodo endotelio sugebėjimą jį sintetinti (Sumažinta Aigiohemofilijoje) ir endotelio pažeidimų laipsnis vaskulite, aterosklerozė ir kitos ligos, Pažeidus vidiniam kraujagyslių pamušalui.

Norint gauti fiksuotus normalius trombocitus, trombocitai iš eilės pridedami sveikų asmenų trombocitų turtingoje kraujo plazmoje. 0,2 % EDTA sprendimas (0,5 ml 5 ml plazma) ir 2 Min - tvirtinimo sprendimas (20 ml 40 % formalinas 1000 ml fosfato buferis su 0,2 G Edta, pH vertė 6,4).

Mišinys bent jau yra +4 ° C temperatūroje 1 ne, po to jis patiria centrifugavimą, Supernatantas pašalinamas, ir trombocitų nuosėdos du kartus plaunamos pakabos tirpalu (Vienas tomas 3,8 % natrio citrato tirpalas ir penki tūriai izotoninio natrio chlorido tirpalo; PH pritaikomas iki 7,4). Parengta normalios formalinuotų trombocitų pakaba yra supakuota pagal 1 ml ir laikoma -20 ° C. Skiedimo kalibravimo kreivė sukonstruota naudojant normalią trombocitų neturinčią plazmą, su pavyzdžiais, kurių formalinuotų trombocitų yra maišomi. Toliau mišinyje nustatoma ristomicino agliutinacija. Kalibravimo kreivė naudojama nustatant von Willebrand faktoriaus kiekį bandomosios kraujo plazmoje. Fiksuoti trombocitai yra geriau išsaugoti, kai į konservantų tirpalą įpilamas nedidelis natrio azido kiekis.

Testai, atspindintis spontanišką trombocitų agregaciją

Tiriant pacientus, sergančius tromboembolija arba padidėjus polinkiui į trombozę ir išemiją, testai yra įtraukti į pagrindinius metodus, atspindintis spontanišką trombocitų agregaciją, T. tai yra. pasireiškia viso kraujo ar kraujo plazmoje, nepridedant agreguojančių agentų.

Norint nustatyti šį reiškinį, kraujo tepinėlio mikroskopija atkreipia dėmesį į atskirų trombocitų skaičiaus ir jų agregatų skaičių santykį, susideda iš 3–5 ar daugiau trombocitų. Šis reiškinys geriau atskleidžiamas žiūrint nuosėdas, gautas naudojant intensyvų zeitiką- trombocitų turtingos plazmos virškinimas (20–30 min 6000 / Min), stabilizuotas citratu arba EDTA-citrato tirpalu. Tačiau stabilesni rezultatai gaunami šiais spontaniškos agregacijos nustatymo metodais.

Wu-Hoak metodas

Wu-hoak metodas yra pagrįstas, Tas kraujas iš venos ištraukiamas į du bandomuosius vamzdelius, Viename iš jų yra EDTA sprendimas, o kitame - to paties EDTA tirpalo mišinys su 4 % formalino tirpalas. Po maišymo vamzdžių turiniui leidžiama nusistovėti 30 min kambario temperatūroje.

Susitaikymo metu agregatai įsikuria, ir atskiri trombocitai lieka supernatantiniame sluoksnyje. Nusistovėjus, skaičiuojamas trombocitų skaičius supernatantiniame sluoksnyje kiekviename vamzdyje. Paprastai abiejų vamzdžių turinio trombocitų skaičiaus skirtumas neviršija 10-15 %, Padidėjus spontaniškam agregacijai, padidėja.

Metodas n. IR. Tarasova

Pagal metodą n. IR. Tarasova (1984) Trombocitų praradimas iš viso citrininio kraujo į agregatus atsižvelgiama po to, kai 3 minutes jį purtant AVU-1 purtikliui, 90–100 kartų per 1 m,.

Bandymo vamzdyje su 0,5 ml kraujo, sukrėstas, įvesta 1 ml 1 % Formaldehido tirpalas izotoniniame natrio chlorido tirpale. Antrasis valdymo vamzdis nėra sukrėstas, ir į tą patį asmenį, kurį buvo tiriamas per jį 3 taip pat švirkščiamas Min formalino tirpalas.

Abiejų vamzdžių kraujas nusistovi 30 m,, po kurio suskaičiuojamas trombocitų skaičius supernatantiniame sluoksnyje. Paprastai trombocitų skaičiaus skirtumas neviršija 20 %, Padidėjus tendencijai į agregaciją, jis padidėja.

Tais atvejais, kai nustatomas pažeidimas taikant pagrindinius testus, apibūdina trombocitų hemostazę, Atlikite, jei reikia atlikti papildomus tyrimus. Iš jų svarbiausi yra šie.

Papildomi tyrimai, skirti nustatyti trombocitų hemostazę

Megakariocitų skaičiaus megakariocitų skaičiaus tyrimas mielių ir kaulų čiulpų trefinuose tiriant šių ląstelių morfologiją

Reikšmingas megakariocitų skaičiaus padidėjimas kaulų čiulpų skyriuose, paprastai derinamas su daugiau ar mažiau ryškiu trombocitų skaičiaus padidėjimu kraujyje, stebima su eritremija, Hemoraginė ir esminė trombocitozė ir kitos mieloproliferacinės ligos. Vidutinio sunkumo megakariocitozė, Kartu su trombocitopenija, būdinga trombocitopeninei purpurai (Werlhofo liga).

Kaulų čiulpų aplazijos ir bet kurios kilmės hipoplazijos atveju sumažėja megakariocitų kiekis kaulų čiulpų skyriuose, ir trombocitų skaičius periferiniame kraujyje.

Dalinė amegakariocitozė pastebima esant trombocitopoetino trūkumui (Reta įgimtos trombocitopenijos forma), antimegakariocitų antikūnų atsiradimas kraujyje, esminė dalinė megakariocitų aplazija (gali būti prieš leukemijos vystymąsi).

Morfologiniai ir citocheminiai megakariocitų pokyčiai pastebimi daugelyje trombocitopatijų.

Elektroninis mikroskopinis trombocitų ultrastruktūros tyrimas

Norint diagnozuoti daugybę trombocitopatijų diagnozuoti elektroninis mikroskopinis trombocitų ultrastruktūros elektronų mikroskopinis tyrimas, kuriame nėra didelio optinio tankio ne baltymų granulių skaičiaus arba smarkiai sumažėja (su ADP, Serotonino, katecholaminų, Kalcis ir kt.), arba baltymų α-granulės, o tai būdinga daugeliui trombocitopatijų, suskirstyti į saugyklų baseino ligų grupę, arba granulių trūkumo ligos.

Taip pat gali būti aptikti susitraukimo aparato trūkumai. („MicroTRube“ sistemos) ir trombocitų lizosomos.

Nuskaitydami elektroninę mikroskopiją arba tiriant trombocitus, naudojant interferencijų optiką pagal Nomarski, taip pat galima aptikti trombocitų fiksavimo defektus ant svetimo paviršiaus, jie pasklido ant jos, šaudymo formavimas, granulių centralizavimas ir sekrecija, kuris būdingas daugelio rūšių trombocitopatijoms.

Antitrombocitinių antikūnų nustatymas imunofluorescencijoje- Imunoglobulino trombocitų suspensijos tyrimai, Susijęs su šiomis ląstelėmis – Dixono metodas

Šis sudėtingas metodas leidžia atskirti imuninę ir ne imuninę trombocitopeniją..

Tačiau esant sunkiausioms ligos formoms, sergantiems sunkia trombocitopenija, ji yra nepriimtina, nes nustatant surištą imunoglobuliną reikia gana daug (Daugiau nei 40–50 g colių 1 L) trombocitų skaičius.

Pažymėtų autologinių trombocitų gyvenimo trukmės nustatymas

Pažymėtų autologinių trombocitų gyvenimo trukmės nustatymas leidžia atskirti trombocitopeniją nuo normalios trombocitų gyvenimo trukmės cirkuliacijoje (apie 9 Naktimis) ir ligos formos su sutrumpinta šių ląstelių gyvenimo trukme.

Pirmieji dažniausiai susiję su trombocitų gamybos sumažėjimu kaulų čiulpuose, antrasis - su pagreitinta mirtimi, arba veikiant antitrombocitiniams antikūnams (Naudojant autoimuninę trombocitopeniją, trombocitų gyvenimo trukmė sumažėja iki kelių valandų), arba intensyviai prarandant šias ląsteles į agregatus ir trombus (Trombocitopenijos vartojimas).

Kiekybinis kiekio nustatymas kraujo plazmoje prieš ir po trombocitų faktorių sujungimo

Kiekybinis kiekio nustatymas kraujo plazmoje prieš ir po daugelio trombocitų faktorių - membranos fosfolipidinio faktoriaus - membranos fosfolipidų faktoriaus sujungimas 3, α-granulių turinys (Antiheparino faktorius 4, β-tromboglobulinas, Trombocitų mitogeninis faktorius) ir ne baltymų granulės, turinčios didelį elektronų optinį tankį (Serotonino, katecholaminų, ADT), taip pat rūgšties hidrolazės.

Šie tyrimai suteikia įžvalgos apie atitinkamų struktūrų ir jų komponentų turinį trombocituose, apie jų išleidimą į plazmą agregacijos proceso metu, ir apie vidinį- Kraujagyslių trombocitų aktyvacija, lydimas trombocitų išsiskyrimo į kraujo plazmą, padidėjus tankių komponentų ir α-granulių koncentracijai pastarosiose (Antiheparino faktorius 4, β-tromboglobulinas ir kt.).

Kiekybinių trombocitų veiksnių kiekybinių tyrimų metodai yra svarbūs norint nustatyti daugybę trombocitopatijų (granulių ir jų komponentų saugumo pažeidimai, reakcijos parezė šių komponentų išsiskyrimui, padidėjęs jų kiekis kraujo plazmoje dėl intensyvaus vidaus- Kraujagyslių adhezija ir trombocitų agregacija ir kt.). Daugeliui trombocitopatijų būdingas membranų trombocitų faktoriaus kiekio sumažėjimas membranų kiekio sumažėjimas 3 arba jo galimybės dalyvauti kraujo krešėjimo procese pažeidimas.

Trombocitų ir jų atskirų struktūrų biocheminių savybių tyrimas

Trombocitų ir jų atskirų struktūrų biocheminių savybių tyrimas - stroma, granulės, mitochondrijos ir kt.. d. Leiskite dokumentuoti įvairių tipų patologijos ir trombocitų disfunkcijos ryšį su tam tikrų tipų fermento trūkumu (ciklooksigenazės trūkumas, „Thromboxane SynteTase“ ir kt.), pažeidžiant membranos lipoproteinų sudėtį, būtina sąveikai su agreguojančiais agentais, ir t,. d.

Tokie tyrimai yra prieinami tik gerai įrengtoms tyrimų laboratorijoms, todėl jie nėra naudojami plačiai paplitusioje praktikoje..