Cytochemical uuring hüüatama

tsütokemikaalseks reaktsioon, läbi hüüatama, nähakse arusaamu keemilise koostise ja funktsionaalset aktiivsust oma rakkudes.

Happelise fosfataasi aktiivsuse määramine ejakulaadis

Happelise fosfataasi aktiivsus ejakulaadis on mitu korda suurem kui selle aktiivsus veres. Happeline fosfataas on osa eesnäärme sekretsioonist, selle tootmist stimuleerivad mees gonadotroopsed hormoonid. Tsütokeemiliste reaktsioonide abil tuvastatakse see spermatosoidides ja teistes ejakulaadi rakkudes.. Selle tegevus määratakse kindlaks Goldberg-Barki meetodil.

Reaktiivid.

1. formaliini alkohol (üks osa valmis 40 % formaliin lahustatakse üheksas osas 96% etüülalkoholi).

2. Pararosaniliin: 1 g põhifuksiin tähendab fuk- väävelhape lahustub kuumutamisel 25 ml 2 n vesinikkloriidhape; jahtunud, filtreeritakse ja hoitakse külmkapis. Resistentne reaktiiv.

3. Naatriumnitraadi vesilahus 4 %. 4. Metüülrohelise lahus atsetaatpuhvris 2 % (pH- 5). Saadud lahust pesti kloroformiga, miks segada ligikaudu võrdsetes kogustes kloroformi ja 2 % metüülrohelise lahus. Loksutage korduvalt kogu päeva jooksul, ja seejärel lillat värvi kloroform. Eemaldatakse jaotuslehtriga.

5. Inkubatsioonikeskkond, mis koosneb kahest komponendist.

• Komponent: 20 lahustatakse mg naftool-A5-fosfaati 0,5 (0,3) ml dimetüülformamiidi, lisama 40 ml 0,1 n naatriumatsetaadi lahusega ja filtreeriti läbi filterpaberi; ettevalmistatud õppepäeval.
• B komponent: 8 tilgad 4 % naatriumnitraat lahus segada 8 tilgad pararosaniliini; küpseta ex tempore. Inkubatsioonisöötme saamiseks ühendatakse mõlemad komponendid (pH 5,2—5,4). Vajadusel reguleerige kas pH-d 50 % äädikhape, või söövitava leelise lahus.

Meetod. Värske ejakulaat tsentrifuugitakse, suure hulga spermatosoidide korral loobutakse tsentrifuugimisest. Settetest valmistatakse lihvklaasiga õhukesed määrded., et, nagu veremäärded, õhu käes kuivatada. Järgmisena kinnitatakse kuivanud määrded, kastes need formaliini alkoholiga klaasi 30 pärit (mitte rohkem) ja pestakse destilleeritud veega. Seejärel kastetakse määrded inkubatsioonikeskkonnaga klaasi ja asetatakse temperatuurile termostaadi 37 ° C 2 ei. Pärast seda loputatakse neid destilleeritud vees., sukelduma 10 min keeduklaasis metüülrohelise lahusega (südamike värvimiseks), loputage kiiresti veega, kuivatati filterpaberiga ja uuriti sukelmikroskoobiga.

Happefosfataasi aktiivsust saab väljendada keskmise tsütokeemilise koefitsiendi abil (SCK) poolt poolkvantitatiivne Astaldi-Verga meetod. Vastavalt valemile

SCK=(3*a+2*b+1*c)/100

kus numbrid lugejas näitavad värvi intensiivsust (Maksimaalne - 3, mõõdukas - 2, jäljed - 1), ja tähed näitavad teatud värvi intensiivsusega loendatud rakkude protsenti; joonis 100 nimetaja on loendatud lahtrite koguarv.

Näiteks, loetud 100 rakk, millest kõrgeima värviintensiivsusega 20 rakk, mõõdukaga - 20 ja jälgedega 60 rakk. Siit:

SCK=(3*20+2*20+1*60)/100=1,6

Spermatosoidides paikneb happeline fosfataas üksikute suurte punakasoranžide graanulitena pea ülaosas..

Kromatiini poolt hõivatud peaosa on värvitud roheliseks ja ei sisalda happelist fosfataasi..

Pea alumisel küljel on happelise fosfataasi kahvatum hajus värv., ja mõnikord ulatub sperma kaelani. Spermatosoidide happelise fosfataasi keskmine tsütokeemiline koefitsient normaalses ejakulaadis on 2,0-2,4.

Graanulite kogunemist leidub spermatogeneesirakkude tsütoplasmas, erksavärviline konkreetses (punakasoranž) värv. Keerdunud seemnetorukeste tugirakkudes, sageli tugevalt positiivne happelise fosfataasi suhtes, poolläbipaistvad värvimata pead (kromatiin) sperma. Histiotsüüdid ja makrofaagid sisaldavad vähe graanuleid, happelise fosfataasi suhtes positiivselt värvunud. Üksikutes lümfotsüütides, ja mõnikord on neutrofiilsetes granulotsüütides üksikud graanulid, happelise fosfataasi aktiivsusega.

Suktsinaatdehüdrogenaasi aktiivsuse määramine (SDG) ejakulaadis

Suktsinaatdehüdrogenaas - Ensüüm, osaleb redoksreaktsioonides, sisaldub ejakulaadi rakkudes märkimisväärses koguses. Selle aktiivsuse muutumise olemus erinevates patoloogilistes protsessides pole aga siiani hästi mõistetav.. Suktsinaatdehüdrogenaasi aktiivsus rakkudes määratakse modifitseeritud Narcissovi meetodil.

Reaktiivid.

1. Atsetoon-trilon (atsetoon - 60 ml, destilleeritud vesi - 40 ml, trilon B - 250 mg).

2. Metüülroheline lahus 2 % (sama värvaine, mida kasutatakse happelise fosfataasi jaoks).

3. Inkubatsioonikeskkond, mis koosneb järgmistest komponentidest:

ja) fosfaatpuhver (pH 7,2—7,4) - 10 ml;

kuni) 5,4 % naatriumsuktsinaadi lahus 10 ml;

sisse) Trilon B (13 mg lahjendatud 5 ml destilleeritud vesi);

g) destilleeritud vesi - 5 ml;

d) nitrotetrasooliumviolett (10 mg lahjendatud 10 ml vett).

Kõik komponendid segatakse ühes pudelis ja hoitakse külmkapis.. Valmis keskkonda saab kasutada korduvalt – ajal 10 päeva või kauem.

Meetod. määrib, valmistatud ejakulaadist, fikseeritud atsetooni-triloniga 30 pärit, pestakse destilleeritud veega ja kuivatatakse õhu käes. Seejärel kastetakse määrded inkubatsioonikeskkonda ja asetatakse termostaadi temperatuurile. 37 ° C 1 ei, misjärel neid pestakse destilleeritud veega ja värvitakse metüülrohelisega 10 m. Seejärel loputage uuesti kiiresti veega., kuivatati filterpaberiga ja uuriti sukelmikroskoobiga.

Normaalsed spermatosoidid neil on kõrge suktsina dehüdrogenaasi aktiivsus, mida esindavad suured sinakasvioletsed graanulid, et, üksteisega sulandumine, moodustavad tiheda massi, spermatosoidi kaela täitmine, mõnel spermatosoidil leidub üksikuid graanuleid ka pea ümber.

Omavahel kokku sulanud graanuleid pole võimalik kokku lugeda., seetõttu mõõdetakse suktsinaatdehüdrogenaasi aktiivsuse määramiseks spermatosoidide värvilist osa mikromeetrites. Spetsiaalselt suktsinaatdehüdrogenaasi jaoks värvitud sperma osa pikkust kasutatakse ensüümi aktiivsuse määramiseks selles spermas. Okulaari mikromeetri ja objekti mikromeetri abil mõõdetakse konkreetset värvi osa pikkust 100 spermatosoidid. Loendatud spermatosoidide värvunud alade pikkuse liitmine ja saadud arvu jagamine 100, saada keskmine pikkus, ekspresseerivad suktsinaatdehüdrogenaasi aktiivsust ühe sperma kohta. Tavaliselt on see 4,3 ± 0,7 mikronit. See SDH aktiivsuse arvutus on kõige informatiivsem ja seetõttu soovitatav teaduslikuks kasutamiseks..

Praktikas laialdaseks rakendamiseks on see meetod üsna keeruline., eelistatav on väljendada suktsinaatdehüdrogenaasi kogust Astalda-Verga meetod. Normaalses ejakulaadis spermatosoidide SDH keskmine tsütokeemiline koefitsient on 2,7 ±0,3.

Spermatogeneesi rakkudes SDH aktiivsus tuvastatakse suurte sinakasvioletsete graanulite klastritena, sageli ühinevad suurteks tükkideks, paiknevad tsütoplasma erinevates osades. Spermatogeneesirakkude keskmine tsütokeemiline koefitsient ei ulatu 2,0. Ejakulaadi rakkude küpsedes suureneb SDH aktiivsus ja küpsetes spermatosoidides ületab 2,0. Üksikute lümfotsüütide tsütoplasmas leidub suuri SDH graanuleid..

Peroksidaasi aktiivsuse määramine ejakulaadis

Spermatosoidides, peroksidaas puudub spermatogeneesirakkudes ja keerdunud seemnetorukeste tugirakkudes.

Ejakulaadi neutrofiilsetes granulotsüütides väljendub peroksidaasi aktiivsus suurel määral ja see võib varieeruda sõltuvalt patoloogilise protsessi olemusest., samuti perifeerses veres. Peroksidaasi aktiivsuse tase neutrofiilsetes granulotsüütides on oluline nende funktsionaalse seisundi ja meessuguelundite põletikulise protsessi aktiivsuse hindamiseks.. Ejakulaadi määrimine Graham-Knolli järgi ja ensüümi aktiivsuse registreerimine Astaldi-Vergi järgi toimub sarnaselt vereäigetega..

Peroksidaasi aktiivsus ejakulaadi rakkudes määratakse Graham-Knolli meetod.

Reaktiivid.

1. formaliini alkohol (sama, nagu happelise fosfataasi puhul).

2. Peroksidaasi reaktiiv: ʙenzidin (skalpelli otsas) lahustatud 6 ml 96 % etüülalkoholi, lisama 4 ml destilleeritud vett 0,02 ml 3 % vesinikperoksiidi. Reaktiiv on kasutatav 5-6 päeva jooksul.

3. Värvaine Romanovsky lahjendatud 1-2 tilka kohta 1 ml destilleeritud vesi.

Meetod. Värsked ejakulaadi määrded registreeritakse 30 formaliini alkoholiga, pestakse voolava veega ja kuivatatakse. Seejärel täidetakse määrded 5-7 minutiks peroksidaasreagendiga., pestakse põhjalikult voolavas vees ja kuivatatakse. Pärast seda värvitakse need uuesti 15 - 20 kaevandused Romanovski värviga, pestakse voolava veega, kuivatatakse ja mikroskoobitakse sukelmikroskoobisüsteemi abil.

Positiivse reaktsiooniga peroksidaasile leitakse neutrofiilsetes granulotsüütides märkimisväärses koguses suuri kuldpruune granulotsüüte.. Suure leukotsüütide arvu korral on vaja loendada keskmine tsütokeemiline koefitsient (SCK). Üksikute histiotsüütide tsütoplasmas sisaldub peroksidaas samade graanulite väikeste kogunemiste kujul..

Glükogeeni määramine ejakulaadis

Glükogeeni sisalduse muutused erinevates rakkudes mõjutavad nende funktsiooni või viitavad patoloogilise protsessi arengule.. Tehakse glükogeeni määramine rakkudes McManuse meetodil.

Reaktiivid.

1. Joodhappe vesilahus 1 % (valmistada enne tarbimist).

2. väävelvesi: 5 ml 10 % kaalium- või naatriummetabisulfit, 5 ml 1 n vesinikkloriidhape, vett juurde 100 ml (valmistada enne tarbimist).

3. Schiffi reaktiiv: 1 g aluselist fuksiani väävelhappe jaoks, eelnevalt jahvatatud portselanmördis, lahustage pidevalt loksutades 5 min sisse 200 ml keeva destilleeritud veega, lastakse läbi paberfiltri ja lisatakse jahutades kuni 50 ° C 20 ml 1 n vesinikkloriidhape, ja kui see on jahutatud 25 °C - 1 g kaalium- või naatriummetabisulfiti. Valmistatud reaktiivi hoitakse külmkapis 24 h mille järel muutub selgeks ja muutub tarbimiskõlbulikuks

4.Metüülrohelise vesilahus 2 %, pestakse kloroformiga

5.Keemiliselt puhas metüülalkohol.

Meetod.

Õhukesed kuivatatud ejakulaadi määrded kinnitatakse keemiliselt puhta metüülalkoholiga 3 m, loputatakse destilleeritud veega ja pannakse keeduklaasi 1 % joodhappe vesilahus 5 m. Seejärel pestakse määrdeid destilleeritud veega., kuivama, loputatakse väävelvees ja kuivatatakse uuesti.

Järgmisena lastakse määrded Schiffi reagendiga klaasi 15 m, loputage neid kolmes portsjonis väävelvees (poolt 3 min igas), pestud 10 min vees ja värvige raku tuumad 3 min metüülroheline. Pärast seda loputatakse määrdeid uuesti veega., kuivatati filterpaberiga ja mikroskoobiti sukelmikroskoobisüsteemi abil.

Glükogeen puudub küpsetes spermatosoidides.. Noorte spermatosoidide tsütoplasmas, eriti kraega, tuvastatakse glükogeeni jälgi (±), mõnikord üksikute graanulite kujul pea ülaosas või "krae" piirkonnas.

Spermatogeneesi rakkudes glükogeeni leidub suurtes kogustes kirsipunaste graanulite kujul, täites kogu tsütoplasma. Kui rakud küpsevad, kaotavad nad glükogeeni, kuni see kaob küpsetes spermatosoidides.. spermatsüüdid sisaldavad glükogeeni mitte ainult tsütoplasmas, vaid ka tuumas. Keerdunud seemnetorukeste tugirakkudes paikneb glükogeen kirsipunaste graanulite kujul ja hajusalt. Küpsed neutrofiilsed granulotsüüdid ejakulaadis, nagu perifeerse vere määrdumisel, sisaldavad märkimisväärses koguses glükogeeni. Kroonilise prostatiidi korral suureneb oluliselt glükogeeni hulk ejakulaadi neutrofiilsetes granulotsüütides ja suureneb peroksidaasi aktiivsus.. Glükogeeni graanuleid leidub mõnikord üksikutes lümfotsüütides..

Makrofaagid sisaldavad glükogeeni jälgi Ejakulaadi määrdumise taust muutub kirsipunaseks, mis näitab suure hulga glükoosaminoglükaanide olemasolu plasmas ejakulaadis (mukopolisaxaridov).

Ribonukleiinhappe määratlus (RNA) ejakulaadis

Suurenenud RNA sisaldus rakkudes näitab nende suurt aktiivsust kasvu suhtes, sekretoorne, sünteetilised ja muud tegevused. RNA sisalduse vähenemist noortes rakkudes seostatakse sageli nende rakkude vähenenud taastumisvõimega.. Määratakse RNA sisaldus rakkudes Kurniku meetodil.

Reaktiivid.

1. Kurniku reaktiiv: eraldi keedetud 2 % metüülrohelise ja püroniini lahused, metüülrohelise lahusega, mida pestakse põhjalikult kloroformiga; töövärvi lahus valmistatakse segamise teel 2 % püroniini lahus (12,5 ml) ja 2 % metüülrohelise lahus (7,5 ml) koos lisandiga 30 ml destilleeritud vesi. Värvikindel, hoida külmkapis.

2. Fiksaator – keemiliselt puhas metüülalkohol.

Meetod. Määrdused fikseeritakse metüülalkoholiga 3 m, värvitud püroniin-metüülrohelise töölahusega 15 m, loputage kiiresti veega ja kuivatage filterpaberiga. Mikroskoopiliselt, kasutades sukelmikroskoobi süsteemi. RNA värvitakse püroniiniga helepunaseks., raku tuumad - metüülroheline kuni roheline.

Küpsed spermatosoidid ei sisalda RNA-d. Spermatogeneesi rakud on rikas RNA-ga, mille hulk rakkudes küpsedes väheneb. Spermatogoonias roosakas tsütoplasma, spermatotsüütides see tuhmub, ja spermatiidis kahvaturoosa. Noortel spermatosoididel, millel on "krae" “krae” on värvitud valdavalt roosaks.

Sperma, nende arengu viimasel etapil, keerdunud seemnetorukeste tugirakkudes kaotavad nad roosa aine jäänused (RNA) ja muutuvad küpseteks spermatosoidideks.

Spermatogeneesi rakud sisaldavad suures koguses glükogeeni, RNA ja SDH ja CP märkimisväärselt väljendunud aktiivsus. Kuid, tavaliselt, need rakud on ejakulaadis üksikud, seetõttu ei ole SCC arvutamine asjakohane. Sellistel juhtudel piirduvad need järelduste kirjeldava vormiga..

Leukotsüütide tsütokeemiline iseloomustus on nende funktsionaalse aktiivsuse oluline näitaja. Ejakulaadi leukotsüütides sisalduva aine koguse arvestamine toimub samal viisil, nagu ka teistes ejakulaadi rakkudes ja perifeerses veres.

Tavapäraste meetoditega värvitud ejakulaadi määrdudes (asurosiini segud, hematoksüliin-eosiin jne.), samuti natiivsetes preparaatides ei ole alati lihtne leukotsüüte eristada, rakkude spermatogeneesi, eesnäärme epiteel, histiotsüüdid ja muud elemendid.

Tsütokeemilised meetodid koos morfoloogiliste meetoditega aitavad sageli määrata rakutüüpi.. Nii, väljendunud peroksüdaasi aktiivsus, mida esindavad suured kuldpruunid graanulid, täites kogu raku tsütoplasma, iseloomulik küpsetele neutrofiilsetele granulotsüütidele, teised rakud seda reaktsiooni ei näita.. Selge reaktsioon glükogeenile on tüüpiline neutrofiilsetele granulotsüütidele ja spermatogeneesi rakkudele., kuid viimastel puudub peroksüdaasi aktiivsus. RNA esineb spermatogeneesirakkudes ja puudub küpsetes granulotsüütides. Spermatogeneesi rakkudel on väljendunud reaktsioon happelise fosfataasi suhtes, ja neutrofiilsetes granulotsüütides väljendub see väga nõrgalt ja t. d.