Paroksüsmaalne öine hemoglobinuuria – Haiguste Marchiafava Michele

Paroksüsmaalne öine hemoglobinuuria - suhteliselt haruldane omandatud hemolüütilise aneemia vorm, seotud erütrotsüütide struktuuri muutmine, Neutrofiilide granulotsüütide ja trombotsüütide. See jätkub intravaskulaarse hemolüüsi tunnustega, mille korral täheldatakse hemoglobinuuria, gemosiderinuriya, plasma vaba hemoglobiini taseme tõus. Haigust komplitseerib sageli perifeersete veenide ja siseorganite anumate tromboos.

Paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria etioloogia ja patogenees

Esimene haiguse kirjeldus anti aastal 1882 g. Täpsemalt kirjeldati seda aastal 1928 g.

Haiguse üldnimetus on kramplik öise hemoglobinuria (PNG), see ei vasta siiski haiguse olemusele, kuna sellega pole tõelisi paroksüsme ja hemoglobinuuria ei ole alati täheldatav.

Intravaskulaarset hemolüüsi koos hemosiderinuuriaga täheldatakse lisaks PNH-le ka autoimmuunse hemolüütilise aneemia paljudes vormides, nii kuumuse kui ka, ja külmade antikehadega, eriti termiliste hemolüsiinidega vormidega, samuti päriliku hemolüütilise aneemia mõnes vormis, seotud erütrotsüütide membraani struktuuri rikkumisega.

Markiafava-Micheli haigus esineb erinevas vanuses. Punaste vereliblede suurenenud hävimise põhjus on punaste vereliblede endi defekt.

PNH-ga patsientide erütrotsüüdid, nagu eespool öeldud, on selle toimimiseks optimaalsete tingimuste loomisel komplementi poolt kergesti hävitatav, või vadaku hapestamisel, või komplemendi kontsentratsiooni suurenemisega erütrotsüüdi ümber, mis põhjustab sahharoosikeskkonnas ioonide madala kontsentratsiooni tekkimist. PNH-ga patsientide erütrotsüüdid on ülitundlikud selliste antikehade nagu aglutiniinide mõju suhtes, ja, eriti, hemolüsiinid.

PNH mõjutab mitte ainult erütrotsüüte, aga ka patsiendi leukotsüüdid ja trombotsüüdid. PNH-patsientide trombotsüüdid ja leukotsüüdid on suurenenud tundlikkus komplemendi mõju suhtes, nagu seerumi hapestamisel, ja madala ioonse tugevusega keskkonnas sahharoos. Nad on isoaglutiniinide toime suhtes kordades tundlikumad, kui trombotsüüdid ja leukotsüüdid. Seega, trombotsüütidel ja leukotsüütidel on sama membraaniviga, erütrotsüütidena.

Tuvastage immunoglobuliinid erütrotsüütide pinnal, leukotsüüdid ja trombotsüüdid ning seega kõige tundlikumate meetoditega tõestada, et PNH kuulub autoagressiivsete haiguste rühma..

On kindlaid tõendeid kahe sõltumatu erütrotsüütide populatsiooni esinemise kohta PNH-s. Tervisliku inimese kõige vastupidavamad rakud - retikulotsüüdid on PNH-s kõige hapramad. See näitab, et, et ebanormaalne punaste vereliblede populatsioon lihtsalt ei ela küpsuseni, ja vanemad küpsed erütrotsüüdid kuuluvad tervesse või peaaegu tervesse populatsiooni.

IN 1970 mulati erütrotsüütide uurimisel, kannatavad PNG all, sain teada, mida need sisaldavad, nagu tervislikud mulattod, kaks tavalist G-6-FD elektroforeetilist varianti; variant A, Aafrika elanike seas tavaline, ja variant B, iseloomulik Euroopa elanikkonnale. Pärast hemolüüsi selgus, et patoloogilised erütrotsüüdid sisaldavad ainult ühte G-6-PD varianti, ja tavalised erütrotsüüdid - mõlemad G-6-PD elektroforeetilised variandid. Siit, hemolüüsitud punased verelibled on saadud ühest rakust.

See kõrge usaldusväärsusega asjaolu näitab kahe erütrotsüütide populatsiooni olemasolu, mitte ainult funktsionaalselt, kui, nt, koos mikrosferotsütoosiga, aga ka päritolu järgi: teisisõnu, see kinnitab patoloogilise rakuklooni olemasolu, t. see on. somaatiline mutatsioon. Erütrotsüütide membraani kahjustuse identiteet, neutrofiilid ja trombotsüüdid näitavad, et patoloogiline teave saab raku tõenäoliselt kätte, järgmine tüvi, t. see on. müelopoeesi eellasrakk. Blastoomi kasv ei ole APG-le tüüpiline. Kirjeldatud on vaid üksikuid PNH-ga kiiret leukeemiat.. Sellest hoolimata, Võib eeldada,, et PNH on veresüsteemi healoomulise kasvaja variant, pikaajaline mittekasvaja proliferatsioon, iseloomulik teistele leukeemia vormidele.

Komplementi tundlikkuse kujunemise mehhanism PNH-s on endiselt ebaselge..

Glükolüüsi ensüümide aktiivsuses ja pentoosi-fosfaadi tsüklis olulisi muutusi ei ole..

PNH-ga väheneb erütrotsüütide atsetüülkoliinesteraasi aktiivsus, tõenäoliselt erütrotsüütide membraani struktuuri rikkumise tõttu, kuna ensüüm asub membraani pinnal ja on kahjustamisel kergesti häiritav. Known, et atsetüülkoliinesteraasi inhibiitorite kasutamine ei mõjuta erütrotsüütide ellujäämist. Kuid atsetüülkoliinesteraasi aktiivsuse vähenemist täheldatakse ka teistes hemolüütilise aneemia vormides., seetõttu ei saa see olla suurenenud komplementi nähtuse selgituseks- tegevused.

On tõendeid, mis näitab küllastumata rasvhapete hulga suurenemist, sisalduvad fosfolipiidide koostises, erütrotsüütide membraanid. Võimalus pole välistatud, et lipiidide muutused peegeldavad ainult kõiki muid muutusi erütrotsüütide membraani struktuuris. PNH-ga patsientide erütrotsüütide membraanivalgu uurimisel polüakrüülamiidgeelis elektroforeesi teel naatriumdodetsüülsulfaadi juuresolekul, et mitmetes fraktsioonides erines valgusisaldus kontrollist oluliselt.

Peamine roll trombootiliste komplikatsioonide patogeneesis PNH-s on määratud erütrotsüütide intravaskulaarsele lagundamisele ja koagulatsiooni stimuleerimisele tegurite mõjul, nende lagunemise ajal erütrotsüütidest vabanenud. PNH hävitab peamiselt retikulotsüüte, võib olla, see peaks selgitama selle haiguse trombootiliste komplikatsioonide sagedust, erinevalt teistest hemolüütiliste aneemiate vormidest, millega kaasneb raske intravaskulaarne hemolüüs.

Paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria kliinilised ilmingud

Haigus algab kõige sagedamini järk-järgult. Patsiendid kaebavad nõrkus, vaevus, peapööritus. Mõnikord märgitakse sclera subicterus. Peavalu kaebused on sageli esimesed., kõhuvalu erinevates lokaliseerimine. Kalduvus suurenenud tromboosile paneb patsiendi arsti juurde minema. Hemoglobinuuria on harva haiguse esimene sümptom ja mõnel patsiendil võib PNH täielikult puududa.. Mõnel juhul ilmub see esimest korda 2-3 aasta pärast ja isegi pärast seda 10 aastat pärast haiguse algust.

PNH üks iseloomulikke tunnuseid on kõhuvalu. Selle lokaliseerimine võib olla väga erinev. Väljaspool kriisiaega on kõhuvalu, tavaliselt, ei täheldatud. Sageli liitub temaga oksendamine.. Tõenäoliselt, kõhuvalu PNH-ga patsientidel on seotud mesenteriaalse tromboosiga.

Perifeersete veresoonte tromboos (kõige sagedamini - ülemiste ja alajäsemete veenid, harvem - neeruveresooned) ka paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria iseloomulik sümptom. Sisse 12 % PNH-ga patsientidel täheldatakse tromboflebiiti. Trombootilised tüsistused on selle haiguse kõige levinum surmapõhjus..

Patsiendi objektiivses uuringus äratab kõige sagedamini tähelepanu kerge kollatooniga kahvatus.. Sageli täheldatakse näo turset, mõnikord ülekaaluline. Võimalik põrna ja maksa väike suurenemine, kuigi see pole PNG-le tüüpiline.

Paroksüsmaalset öist hemoglobinuuria iseloomustavad intravaskulaarse hemolüüsi tunnused, millest olulisim on vaba plasma hemoglobiini tõus. Seda sümptomit täheldatakse perioodiliselt peaaegu kõigil PNH-ga patsientidel.. Kuid vaba plasma hemoglobiini suurenemise aste varieerub ja sõltub, millises haigusperioodis uuring läbi viidi. Kriisi ajal suureneb see näitaja märkimisväärselt, suureneb ka plasma metallbumiini kogus.

Plasma vaba hemoglobiinitase sõltub hetkel hemolüüsi astmest, haptoglobiini sisaldus, hemoglobiini filtreerimise aste uriinis ja hemoglobiini - haptoglobiini kompleksi hävitamise kiirus. Väikese hemolüüsi korral ei ole vaba hemoglobiini tase plasmas selle neerufiltri filtreerimiseks piisav. Seetõttu ei ole hemoglobinuuria haiguse kohustuslik sümptom.. Kui nefronid läbivad tuubuleid, hävib vabanenud hemoglobiin osaliselt ja ladestub tuubulite epiteelisse. See on põhjus, miks hemosideriin eritub uriiniga..

Hemosideriin eritub uriiniga enamikul paroksüsmaalse öise hemoglobinuuriaga patsientidest. Mõnikord ei ilmne hemosiderinuuria kohe. See on tähtis, kuid mitte PNH-spetsiifiline haigusnäht.

Paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria laboratoorsed näitajad

Hemoglobiinisisaldus PNH-ga patsientidel on vahemikus 1,86 kuni 3,1 mmol / l (30-50 G / l) ja remissiooni ajal normaalsest madalam.

Erütrotsüütide arv PNH-ga patsientidel väheneb vastavalt hemoglobiini languse tasemele. Värvinäidik püsib pikka aega ühe lähedal. Kus, kui patsient kaotab uriinis märkimisväärse koguse rauda hemosideriini ja hemoglobiini kujul, raua tase järk-järgult väheneb. Madalat värviindeksit täheldatakse umbes pooltel patsientidel. Mõnel neist on kõrgenenud hemoglobiini P tase, eriti ajaperioodil ägenemise.

Märkimisväärsel osal patsientidest retikulotsüütide sisaldus on suurenenud, kuid suhteliselt madal (2- 4 %). Leukotsüütide arv PNH-s on enamikul juhtudel vähenenud. Paljudel patsientidel on see 1,5-3 G 1 l, kuid mõnikord väheneb see 0,7-0,8 G-ni 1 l. Leukopeenia, tavaliselt, täheldatud neutrofiilsete granulotsüütide arvu vähenemise tõttu. Mõnikord on leukotsüütide sisaldus PNH-ga normaalne või suurenenud - kuni 10-11 G ühe kohta 1 l.

PNH-ga väheneb neutrofiilsete granulotsüütide fagotsütaarne aktiivsus.

Trombotsütopeenia sageli näha ka koos PNH-ga, trombotsüütide funktsionaalne seisund on siiski normaalne. Arvatavasti, see seletab selle haiguse hemorraagiliste komplikatsioonide haruldust, kuigi trombotsüütide arv väheneb mõnikord märkimisväärselt - kuni 10-20 G ühe kohta 1 l. Tavaliselt on enamikul patsientidel trombotsüütide arv 50-100 g 1 l. Normaalne trombotsüütide arv ei välista paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria diagnoosi.

Luuüdi uurimisel ilmnevad sümptomid, peamiselt iseloomulik hemolüütilisele aneemiale - hematopoeesi punase idu ärritus normaalse müelokarüotsüütide arvuga. Paljudel patsientidel on megakarüotsüütide arv veidi vähenenud.

Seerumi rauasisaldus PNH-s sõltub haiguse staadiumist, intravaskulaarse hemolüüsi aste ja hematopoeesi aktiivsus. Kus, kui patsientidel on püsiv või sage hemoglobinuuria, samuti püsiv hemosiderinuuria, rauasisaldus kehas, ja seega, ja seerumi tase väheneb, mõnikord väga palju. Mõnikord algab PNH hüpoplaasia tunnustega. Rauavarud patsiendi kehas koos PNH-ga sõltuvad, ühel küljel, raua kadumisest uriinis, ja teiselt poolt erütropoeesi intensiivsusest. Seetõttu ei saa rauapuudust pidada paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria diagnoosimiseks..

Seerumi bilirubiini tase PNH-s enamikul juhtudel on see kergelt kõrgendatud või normaalne, peamiselt kaudse kaudu. Keskmine bilirubiinisisaldus on 22–28 μmol / l. Tuleb arvestada, et hemoglobiini intravaskulaarse lagunemisega moodustub hemoglobiini-haptoglobiini kompleks, mis lõpuks ka laguneb, moodustades bilirubiini.

Mõnel PNH-patsiendil algab haigus aplastilise aneemia pildiga..

Paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria diagnoosimine

Paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria korral on erütrotsüütide membraani struktuur häiritud, mis avaldub suurenenud tundlikkuses komplemendi mõjude suhtes. Selline suurenenud tundlikkus tuvastatakse kas Hema testi abil, või tundlikum sahharoosiproov. Mõnel juhul siiski, eriti autoimmuunse hemolüütilise aneemia hemolüsiini vormis, sahharoositest võib anda valepositiivse tulemuse. Hemolüsiinid on fikseeritud nende endi erütrotsüütide pinnal ja hävitavad neid sahharoosikeskkonnas oleva komplementi olemasolul, kusjuures PNH-d iseloomustab rakkude hävitamine komplemendi poolt ilma neid mõjutavate antikehadeta.

Autoimmuunse hemolüütilise aneemia hemolüsiini vormi välistamiseks on soovitatav uurida hemolüsiini ülalkirjeldatud meetodil ja ristlõikelise sahharoositestiga patsiendi seerumi ja ühe rühma doonori erütrotsüütide abil., ja mitte vastupidi, nagu kombeks. APH korral on otsene proov positiivne, ja rist on negatiivne. Hemolüsiini vormis võib AIHA-d täheldada positiivsena, ja negatiivne ristproov. Nendel juhtudel on soovitatav kasutada sahharoositesti kolmandat versiooni - kasutades seda seerumina, ja patsiendi erütrotsüüdid. Hemolüüsi aste selles variandis on minimaalne PNH korral ja maksimaalne AIHA hemolüsiini kujul. Seda tulemust saab seletada ainult patsiendi seerumi antikehade kõrge spetsiifilisusega autoimmuunse hemolüütilise aneemia hemolüsiini vormis antigeeni suhtes, saadaval suurtes kogustes patsiendi erütrotsüütides, kui doonori erütrotsüütides. Neil patsientidel on otsene positiivne sahharoositest, arvatavasti, fikseeritud antikehade esinemisega erütrotsüütidel.

Hemolüsiinide tuvastamine hemaglutinatsiooni agregaadiga ja teised aitavad õige diagnoosi panna. Ei saa kasutada patsientide doonorseerumina, kuna see sisaldab hemolüsiini, võib tulemus olla valepositiivne. Negatiivne tulemus võib aset leida, kui komplemendi allikana kasutatakse PNH-ga patsiendi seerumit või maksatsirroosiga patsiendi seerumit, reumatoidartriit, süsteemne erütematoosluupus ja muud haigused, mille korral komplemendi tase väheneb. Sahharoosi ja Hemi proovid muutuvad vähem väljendunud, kui patsiendilt vere võtmisel kasutatakse hepariini antikoagulandina, mitte naatriumtsitraat. Pärast hemolüütilist kriisi väheneb Hemi ja sahharoosiproovi intensiivsus, kuid samal ajal ei muutu nad negatiivseks.

Vaba hemoglobiini määramine vereplasmas Dervizi ja Byalko poolt modifitseeritud Bingi meetodil paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria korral

Meetod põhineb hemoglobiini võimel reageerida vesinikperoksiidi manulusel happelises keskkonnas bensidiiniga rohelise värvi moodustamiseks, muutudes kõigepealt siniseks, ja siis punakaslillaks. Värvi intensiivsus on proportsionaalne hemoglobiini kogusega.

Reaktiivid.

1. Atsetaatpuhver 0,1 M, pH 4,6: 27,22 g naatriumatsetaati lahustatakse 1 l vett (0,2 M lahus); valmistatakse teises mõõtekolvis 1 l 0,2 M äädikhappe lahus; segatud 480 ml lahust nr. 1 ja 520 ml lahust nr. 2.
2. Vesinikperoksiid 0,3 % lahendus (valmistatud enne kasutamist perhüdrooli lahjendamisel 100 aeg).
3. Bensidiini vesinikkloriidhape 0,1 % lahendus: 50 mg bensidiini vesinikkloriidhapet lahustatakse 35-40 ml atsetaatpuhvris, soojendage lahus temperatuurini 80 ° C veevannis ja pärast jahutamist viiakse temperatuurini 50 ml.

Filtreeritakse pimedasse pudelisse ja hoitakse toatemperatuuril mitte rohkem kui 7 päeva. Kolletunud reaktiiv on kasutuskõlbmatu, kiire tumenemisega on vaja bensidiin alkoholist ümber kristallida.

Meetod.

Uurimiseks mõeldud veri võetakse kuiva nõelaga veenist silikoonitud torusse, mis sisaldab mis tahes antikoagulanti. Vere antikoagulandiga tsentrifuugiti mitte rohkem kui 10 minutit 1500 / Min. Pärast plasma eraldamist tsentrifuugitakse uuesti 10 minutit 8000 p / min leukotsüütide settimiseks.

Valati katseklaasi 4 ml atsetaatpuhvris, 2 ml vesinikperoksiidi, 2 ml bensidiini ja 0,04 ml uuritavat vereseerumit segatakse ja lastakse seista 3 m, seejärel valati optilise tee pikkusega küvetti 1 cm ja fotomeetria rohelise filtriga kompenseerimislahuse suhtes. Sinise värvi intensiivsus suureneb 4-5 minuti jooksul, seetõttu korratakse mõõtmist 3-5 korda järjest ja registreeritakse maksimaalsed näidud. 5-6 minuti pärast omandab seerumi värv sirelpruuni tooni, ja optilise tiheduse väärtus hakkab vähenema. Võetakse kahe tuvastatud maksimaalse optilise tiheduse tulemuste keskmine.

Kompenseeriv lahus, koosnevad 6 ml atsetaatpuhvris, 8 ml vesinikperoksiidi, 3 ml bensidiini lahust ja 0,06 ml isotooniline naatriumkloriidi lahus, küpseta prooviga samaaegselt.

Kalibreerimiskõver tuletatakse hemoglobiini lahusest. Vere, võetud hemoglobiini lahuse valmistamiseks, mõõta selle sisu (meditsiinilisel kolorimeetril või meditsiinilisel refraktomeetril). Valmistage kontsentratsiooniga hemoglobiinilahus 1 g / l, sellest valmistatakse madalama kontsentratsiooniga lahused: 0,005,0,025, 0,05, 0,1 ja 0,2 g / l. Igast saadud lahusest lisage 0,04 ml segu 4 ml atsetaatpuhvris, 2 ml bensidiini lahust ja 2 ml vesinikperoksiidi.

Hemolüsaadi põhilahus (1 g / l) kalibreerimiskõver peab olema külm, ja vahetult enne katset tuleks valmistada madalama kontsentratsiooniga töölahused..

Tavaliselt on 1 l vereplasma sisaldab 0,0005 mmol / l (0,01-0,04 g) Hemoglobiin.

Uriini hemosideriini määramine paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria korral

Kui hemoglobiin laguneb, adsorbeeritakse selle raud neerutuubulite epiteelis ja on osa hemosideriinist. Neerutuubulite epiteeli eemaldatud rakud sisaldavad nendel juhtudel hemosideriini terasid.

Uriinisette põhjalik uurimine pärast hemosideriiniterade tsentrifuugimist on nähtav ka ilma erivärvita. Värvimisel paistavad need aga selgemini silma Perlsi meetod.

Meetod.

Pärast uriini tsentrifuugimist imetakse selle ülemine kiht ära, settele lisatakse värskelt valmistatud lahus 1 % kollane veresool ja 1 % vesinikkloriidhappe lahus (segage võrdsed mahud 2 % vesinikkloriidhappe ja kollase vere soola lahus). Pärast 10 min pärast segamist segu tsentrifuugitakse ja vaadatakse sadet. Hemosideriini terad muutuvad siniseks.

Plasma methemalbumiini määramine spektrofotomeetrilise meetodiga

Reaktiivid.

1. Fosfaadi isoosmootiline puhver (pH 7,4): segatud 18 ml 0.15 M naatriumvesinikfosfaadi lahus (24,4 r YaH2P04 sisse lülitatud 1 l vett) ja 82 ml 0,15 M naatriumvesinikfosfaadi lahus (21,3 г NaH₂PÄRAST₄ edasi 1 l vett).
2. Naatriumvesiniksulfit.
3. Naatriumkarbonaadi lahus 1 M.
4. Inimeseerumi albumiini lahus (40 g / l).
5. Hemin lahendus (5 mg / 100ml); valmistatakse kohe, lahustades hemiini väikeses koguses seebikivi, ja siis: vajaliku mahuni viimine seerumi albumiinilahusega.

Meetod.

K 2 Lisatakse ml seerumit või vereplasmat 1 ml puhverdatud isoosmootilist lahust, pH 7,4. Segu tsentrifuugitakse 30 min kiirusel 1200-1500 p / min. Määrake optiline tihedus temperatuuril 569 nm. Seejärel pannakse lahjendatud plasma katseklaasi ja umbes 5 mg kuiva naatriumvesiniksulfaati. Läbi 5 min mõõta optiline tihedus uuesti samal lainepikkusel. Kahe optilise tiheduse väärtuse erinevus vastab methemalbumiini optilisele tihedusele. Methemalbumiini kontsentratsioon määratakse kalibreerimisgraafiku abil.

Kalibreerimisgraafik väljastatakse järgmiselt. Hemiini ja albumiini lahus viiakse katseklaasidesse koguses alates 0,01 kuni 0,1 g / l (pärit 0,2 kuni 2 ml). Neisse katseklaasidesse, kus lahuse kogus on väiksem 2 ml, kokku liitma 2 ml albumiini lahust. Seejärel lisage 1 ml fosfaat-isoosmootilist puhvrit. Segu tsentrifuugitakse temperatuuril 1500 / Min, ja seejärel mõõta optiline tihedus. Mõõtmiste erinevus joonistatakse vastavalt hemiini kogusele..

Tavaliselt hemalbumiin vereplasmas puudub. See ilmneb intravaskulaarse hemolüüsi korral, nt, paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria või autoimmuunse hemolüütilise aneemia hemolüsiini vormiga, ja ka haptoglobiini puudumisel, kui heem seondub albumiiniga.

Tema test paroksüsmaalse öise hemoglobinuuriaga

Hemi test põhineb PNH-patsientide erütrotsüütide resistentsuse vähenemisel söötme pH langusele värske seerumi komplemendi juuresolekul.

Reaktiivid.

1. Lisati soolhapet 0,2 n.
2. Ammoniaagi lahus 0,04 %.

Meetod.

Võtke 5- 6 ml verd. Antikoagulandina kasutatakse naatriumoksalaati või naatriumtsitraati. Samal ajal võta sama rühma doonorilt 15–20 ml verd. Erütrotsüüdid eraldatakse patsiendi ja doonori veres plasmast.

Doonori vereseerum valatakse 0,5 ml kuues tuubis, neist kaks pannakse peale 20 min temperatuuriga veevannis 56 ° C seerumi komplemendi inaktiveerimiseks, ülejäänud neli toru jäetakse toatemperatuurile. Patsiendi erütrotsüüte pestakse kaks korda isotoonilise naatriumkloriidi lahusega, seejärel suspendeeritakse samas lahuses vahekorras 1:1.

Uurimisskeem on toodud tabelis.

Segage iga tuubi sisu, panema 1 h termostaadis temperatuuril 37 ° C, ja seejärel tsentrifuugiti.

Tühja proovi jaoks 0,05 m patsiendi ja doonori erütrotsüütidest lisatakse eraldi 0,55 ml isotooniline naatriumkloriidi lahus.

Pärast tsentrifuugimist saab hemolüüsi astet hinnata silma järgi. Hemolüüsi määra kvantifitseerimiseks igas torus kuni 4,7 ml 0,04 % lisatakse ammoniaagi lahus 0,3 ml pinnakiht, ja katseklaasis tühja prooviga - 0,3 ml algset vereseerumit.

Et tuvastada 100 % hemolüüs kuni 4,7 Lisatakse ml ammoniaagi lahust 0,3 ml erütrotsüütide suspensiooni (0,05 ml patsiendi erütrotsüüte 0,55 ml isotooniline naatriumkloriidi lahus).

Lahuse optiline tihedus mõõdetakse meditsiinilisel kolorimeetril ja saadud tulemusi võrreldakse erütrotsüütideta ammoniaagi lahuse optilise tihedusega:

% hemolüüs =((IS₁-IS₂)/IS₃)*100;

kus E₁ - uuritava proovi optiline tihedus; IS₂- pimekatse optiline tihedus; IS₃- optiline tihedus 100 % hemolüüs.

Tavaliselt enam hemolüüsitud 5 % erütrotsüüt.

Tema testi loetakse positiivseks, kui, kui rohkem kui 6 % erütrotsüüt.

Paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria ja autoimmuunse hemolüütilise aneemia hemolüsiini vormi korral on hemolüüsid mõnikord kuni 50-80 % erütrotsüüt. Neid haigusi iseloomustab hemolüüs ainult inaktiveerimata vereseerumi juuresolekul. (katseklaas nr. 2). Kui seerumi inaktiveerimine ei takista hemolüüsi (katseklaas nr. 3), on võimalik eeldada hemolüütilise aneemia mõne muu vormi olemasolu või viga uuringu ülesehituses.

Erütrotsüütide hävitamiseks paroksüsmaalse öise hemoglobinuuriaga patsientidel söötme pH tasemel 6,5 kohustuslik komplementi olemasolu on vajalik, sisaldub värskes vereseerumis.

Paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria sahharoosianalüüs

Suhkrutesti põhineb, et paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria ja autoimmuunse hemolüütilise aneemia hemolüsiini vormis patsientide erütrotsüüdid hävitatakse madala ioonse tugevusega lahustes komplementi juuresolekul.

Reaktiivid.

1. Sahharoosilahus: 9,42 sahharoos lahustatakse 0,005 M fosfaatpuhver; pH 6,2 (91 ml 0,005 МNaH₂PÄRAST₄ ja 9 ml 0,005 М Na₂HPO₄).
2. Reagent hemoglobiini kontsentratsiooni määramiseks: 200 mg punast veresoola lahustatakse 1 l destilleeritud vesi, sinna lisada 0,5 ml atsetonetsüanohüdriini.

Meetod.

Patsiendi veri võetakse veenist kahes katseklaasis - kuiv (8—10 ml) ja antikoagulandiga (2- 3 ml). Antikoagulandina kasutatakse naatriumtsitraati. Antikoagulandiga katseklaasi erütrotsüüte pestakse kaks korda isotoonilise naatriumkloriidi lahusega. Pärast supernatandi pesemist ja vaakumi eemaldamist 0,4 Lisatakse ml erütrotsüüte 0,25 ml isotooniline naatriumkloriidi lahus.

Samal ajal võetakse sama veregrupi doonorilt verd kahes tuubis - antikoagulandiga (2—3 ml), seda koheldakse samamoodi, nagu haige veri, ja kuiv (8- 10 ml) vadaku tootmiseks. Pärast doonori seerumi eraldamist 0,5 ml see asetatakse temperatuuril veevanni 56 ° C 30 min komplemendi inaktiveerimiseks. Doonorilt saadud vereseerum tuleb võtta katsepäeval ja hoida külmas. Uurimisskeem on toodud tabelis.

Torud asetatakse sisse termostaati 30 min temperatuur 37 ° C, ja seejärel tsentrifuugiti 10 min kiirusega 2000 p / min ja hinnake hemolüüsi astet.

Selleks valage katseklaasidesse 3,4 ml reagenti hemoglobiini kontsentratsiooni määramiseks ja 0,6 ml üle- igast torust settekiht. Läbi 10 min mõõta katseklaasides lahuse optilist tihedust temperatuuril 540 nm meditsiinilisel refraktomeetril (spektrofotomeeter) või meditsiiniline kolorimeeter (fotokolorimeeter FEK-M) rohelise filtriga, saadud andmete võrdlemine lahuse optilise tihedusega hemoglobiini määramiseks. Võetakse iga katse kahe näidu keskmine. Arvutamine toimub valemi järgi:

% hemolüüs in vitro =((IS₁-IS₅)/(IS₈-IS₅))*100

kus E₁ - lahuse optiline tihedus katseklaasis nr. 1; IS₅ - lahuse optiline tihedus katseklaasis nr. 5, vajalik seerumi enda värvi välistamiseks; IS₈ - lahuse optiline tihedus katseklaasis nr. 8, kus toimus 100% hemolüüs?.

Ristlõikelise sahharoosiproovi jaoks (katseklaas nr. 2) 100%-hemolüüsi uuritakse katseklaasis nr. 7.

Tulemuste hindamine.

Tavaliselt katseklaasis nr. 1, mis sisaldab uuritava patsiendi erütrotsüüte, hemolüüs ei ületa 2-3 %.

Paroksüsmaalse öise hemoglobinuuria ja autoimmuunse hemolüütilise aneemia hemolüsiini vormiga (AIGA) selles katseklaasis ületab hemolüüs 6 % Juhtimistorudes - ei. 4, mis sisaldab patsiendi erütrotsüüte ja inaktiveeritud doonori vereseerumit, katseklaas nr 5, mis sisaldab doonori erütrotsüüte ja vereseerumit, ja number 6, sisaldab seerumi asemel isotoonilist naatriumkloriidi lahust - hemolüüs ei tohiks ületada 1-2 %.

Ristsahharoosi test (katseklaas nr. 2) AIHA hemolüsiini vormiga tavaliselt positiivne (hemolüsiinide juuresolekul vereseerumis), kuid see võib olla negatiivne. Katseklaasis nr. 3 (erütrotsüüdid ja patsiendi vereseerum) hemolüüsi täheldatakse nagu PNH-s, ja AIHA hemolüsiini vormiga. Kui paroksüsmaalne öine hemoglobinuria maksimaalse hemolüüs avastatakse tavapäraste sahharoosi proovi (katseklaas nr. 1), vähem väljendunud - proovis patsiendi enda punaste vereliblede (katseklaas nr. 3); no hemolüüs rist sahharoosi proovi (katseklaas nr. 2).

Kui hemolüsiin kujul AIHA Kõige märgatavam hemolüüs avastatakse proovi omal vereseerumis ja punaste vereliblede patsiendi (katseklaas nr. 3), Mõnevõrra vähem väljendunud - katseklaasis number 1. Katseklaasis nr. 2 hemolüüs sagedamini täheldatud, kuid selle puudumine ei välista hemolüsiin kujul AIHA.