Κυτταροχημική μελέτη της εκσπερμάτισης

Κυτταροχημικές αντιδράσεις, από èâkulâtom, σας επιτρέπει να κρίνουν σχετικά με τη χημική σύνθεση και τη λειτουργική δραστηριότητα των κυττάρων.

Προσδιορισμός της δραστηριότητας όξινη φωσφατάση εκσπερματίζει

Η δραστηριότητα της όξινη φωσφατάση κατά την εκσπερμάτωση είναι πολλές φορές μεγαλύτερη από τη δραστηριότητά του στο αίμα. Όξινη φωσφατάση είναι ένα μέρος του προστάτη αδένα, προϊόντα που διεγείρεται από ανδρικές ορμόνες gonadotropnymi. Χρησιμοποιώντας κυτταροχημικές αντιδράσεις αυτή εντοπίζονται στο σπέρμα και στα άλλα κελιά εκσπερμάτωση. Η δραστηριότητα έχει οριστεί μια μέθοδος Goldberg-Μπαρτσελόνα.

Αντιδραστήρια.

1. Η φορμόλη αλκοόλ (ένα μέρος του τελικού 40 % η φορμόλη διαλυμένο σε εννέα μέρη 96% αιθυλική αλκοόλη).

2. Pararozanilin: 1 ζ βασικές φουξίνης για Fuk- sinosernistoj οξύ διαλύεται όταν η αύξηση της θερμοκρασίας σε το 25 ml 2 ν υδροχλωρικού οξέος; ψύχεται, φιλτράρεται και να αποθηκεύονται στο ψυγείο. Αντιδραστήριο είναι σταθερό.

3. Υδατικό διάλυμα νιτρώδες νάτριο 4 %. 4. Λύση του μεθυλίου πράσινο στο acetatnom buffer 2 % (pH - 5). Το προκύπτον διάλυμα πλένονται χλωροφόρμιο, Γιατί Αναμείξτε περίπου ίσες ποσότητες χλωροφορμίου και 2 % λύση του μεθυλίου πράσινο. Ταρακουνήσει πολλές φορές κατά τη διάρκεια της ημέρας, και στη συνέχεια okrasivšijsâ σε μωβ χλωροφόρμιο αφαιρείται χρησιμοποιώντας διαχωριστική χοάνη.

5. Επώασης Τετάρτη, αποτελούμενο από δύο συστατικά.

• Και το στοιχείο: 20 mg-A5-ναφθόλης φωσφορικού άλατος διαλύεται στο 0,5 (0,3) ml του διμεθυλο-φορμαμίδιο, προσθέστε 40 ml 0,1 n διάλυμα οξικού νατρίου και φιλτράρισμα μέσω φίλτρων χαρτιού; εκπονεί μελέτες καθημερινά.
• Στοιχείο Β-: 8 σταγόνες 4 % διάλυμα νιτρικού νατρίου αναμίχθηκε με 8 pararozanilina σταγόνες; μαγειρεμένα ex tempore. Για να πάρετε και τα δύο συστατικά Τετάρτη επώασης Συνδέστε (pH 5.2-5.4). Εάν είναι απαραίτητο pH διορθώσει είτε 50 % οξικό οξύ, είτε με ένα διάλυμα του καυστικού αλκαλίου.

Μέθοδος. Φρέσκο εκσπερματίζει φυγόκεντρος, Όταν ένας μεγάλος αριθμός των σπερματοζωαρίων χωρίς φυγοκέντρηση. Της ιλύος μαγειρεμένα γυαλιού περικοπών λεπτό επιχρίσματα, ότι, σαν κηλίδες αίματος, αποξηραμένα στον αέρα. Ξηρά επιχρίσματα ρεκόρ περαιτέρω με τη βύθιση τους σε ένα φλιτζάνι με το αλκοόλ formalinovym την 30 από (ΟΧΙ πια) και πλένεται με απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια μπατονέτες βουτηγμένες σε ένα φλιτζάνι με επώασης Τετάρτη και να θέσει σε μια θερμοστάτη σε μία θερμοκρασία 37 ° C 2 όχι. Κατόπιν τους ξεπλύντε με το αποσταγμένο νερό, βυθίζετε το 10 ορυχεία στο Κύπελλο με μια λύση του μεθυλίου πράσινο (για dokrašivaniâ πυρήνες), γρήγορα το νερό πλυσίματος, αποξηραμένα διηθητικό χαρτί και να εξερευνήσετε χρησιμοποιώντας βύθιση μικροσκόπιο σύστημα.

Όξινη φωσφατάση δραστηριότητας μπορεί να εκφραστεί με τη χρήση του λόγου των μέσων citohimičeskogo (SCK) με polukoličestvennomu μέθοδος Astal′di-βέργα. Σύμφωνα με τον τύπο

SCK =(3*και + 2 * β + 1 *)/100

όπου οι αριθμοί στον αριθμητή υποδηλώνουν ένταση του χρωματισμού (κατ 'ανώτατο όριο - 3, μέτρια — 2, ίχνη- 1), και τα γράμματα — το ποσοστό των κυττάρων υπολογίζονται σε ορισμένη ένταση της βαφής; εικόνα 100 ο παρονομαστής είναι ο συνολικός αριθμός των κελιών που υπολογίζονται.

Για Παράδειγμα, θεωρείται 100 κελί, από αυτούς με ανώτατη ένταση του χρωματισμού 20 κελί, με μέτρια- 20 και με ίχνη — 60 κελί. Από εδώ:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6

Spermatozoid σε όξινη φωσφατάση βρίσκεται με τη μορφή της ένα ενιαίο μεγάλο κόκκους κόκκινο-πορτοκαλί για τα κεφάλια επάνω τμήμα.

Λαμβάνονται από χρωματίνη του κεφαλιού είναι πράσινο και περιέχει καμία όξινη φωσφατάση.

Πιο απαλό διάχυτο χρωματισμός σε όξινη φωσφατάση εντοπίζεται γύρω από το κάτω μέρος του κεφαλιού, και μερικές φορές επεκτείνεται στο λαιμό της ένα σπερματοζωάριο. Μέσο συντελεστή κυτταροχημικές όξινη φωσφατάση στο φυσιολογικό σπέρμα εκσπερματίζει είναι 2,0-2,4.

Εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα των άωρων γεννητικών κυττάρων από τη συσσώρευση των κόκκων, Φωτεινή okrašivaûŝihsâ σε συγκεκριμένες (κόκκινο-πορτοκαλί) χρώμα. Στα υποστηρικτικά κύτταρα του μπερδεμένου σπερματικά σωληνάρια, συχνά δραματικά χρωματίζονται θετικά για την όξινη φωσφατάση, άβαφη κεφαλές prosvečivaûtsâ (χρωματίνη) σπέρμα. Ιστιοκύτταρα και μακροφάγα περιέχουν λίγοι κόκκοι, χρωματίζονται θετικά από όξινη φωσφατάση. Σε απομονωμένες λεμφοκύτταρα, και μερικές φορές τα ουδετερόφιλα granoulozitah πληρούν ατομικά κόκκοι, η πυρηνική δραστηριότητα όξινη φωσφατάση.

Προσδιορισμός της δραστηριότητας της αφυδρογονάση του ηλεκτρικού (SDG) κατά την εκσπερμάτωση

Sukcinatdegidrogenaza - Ένζυμο, συμμετέχουν σε Οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις, που περιέχονται στα κύτταρα του την εκσπερμάτωση σε ένα σημαντικό αριθμό. Ωστόσο, η φύση της δραστηριότητας των αλλαγών σε διάφορες παθολογικές διεργασίες δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Η δραστηριότητα της αφυδρογονάση του ηλεκτρικού στα κύτταρα καθορίζεται από την τροποποιημένη μέθοδος Narcissova.

Αντιδραστήρια.

1. Ακετόνη-trilon (ακετόνη είναι 60 ml, αποσταγμένο νερό είναι 40 ml, Β Trilon 250 mg).

2. Λύση του μεθυλίου πράσινο 2 % (την ίδια βαφή, που χρησιμοποιείται για την όξινη φωσφατάση).

3. Επώασης Τετάρτη, αποτελείται από τα ακόλουθα στοιχεία::

και) φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (pH 7,2-7.4) - 10 ml;

να) 5,4 % διάλυμα νατρίου ηλεκτρικό- 10 ml;

σε) β trilona (13 ρίξει mg 5 ml αποσταγμένου νερού);

ζ) αποσταγμένο νερό είναι 5 ml;

δ) nitrotetrazoliâ μωβ (10 ρίξει mg 10 ml νερού).

Όλα τα συστατικά αναμειγνύονται σε ένα μπουκάλι και φυλάξτε το στο ψυγείο. Τελικά Τετάρτη μπορεί να χρησιμοποιηθεί πολλές φορές εντός 10 ημέρες ή περισσότερο.

Μέθοδος. Τα εγκεφαλικά επεισόδια, φτιαγμένο από την εκσπερμάτωση, σταθερό σε ακετόνη-trilone κατά τη διάρκεια 30 από, πλένεται με απεσταγμένο νερό και αποξηραμένα στον αέρα. Στη συνέχεια, επιχρίσματα βουτηγμένα σε επώαση Τετάρτη και να θέσει σε μια θερμοστάτη σε θερμοκρασία 37 ° C 1 όχι, στη συνέχεια πλένονται με αποσταγμένο νερό και μεθυλο dokrašivaût πράσινο κατά τη διάρκεια 10 m. Στη συνέχεια και πάλι γρήγορα πλένονται με νερό, αποξηραμένα διηθητικό χαρτί και να εξερευνήσετε χρησιμοποιώντας βύθιση μικροσκόπιο σύστημα.

Φυσιολογικό σπέρμα έχουν ένα υψηλής δραστηριότητας του αφυδρογονάση του ηλεκτρικού, υποβλήθηκε από μεγάλα κοκκία μπλε-μωβ, ότι, τη συγχώνευση μεταξύ ενός, σχηματίσουν μια πυκνή μάζα, Συμπληρώστε το λαιμό σπέρματος, κάποιο σπέρμα επιμέρους κοκκία βρίσκονται γύρω από το κεφάλι.

Υπολογίστε την τήξη με κάθε άλλο σφαιρίδια δεν είναι δυνατόν, Ως εκ τούτου, για να προσδιορίσετε την δραστηριότητα του ηλεκτρικού αφυδρογονάση βαμμένο μέρος του σπέρματος που μετράται σε Μικρομέτρα. Μήκος συγκεκριμένων ζωγραφισμένα στο sukcinatdegidrogenazu το μέρος του το κεφάλι σπέρμα κρίνεται ο βαθμός της δραστηριότητας του ενζύμου σε αυτό spermatozoide. Χρησιμοποιώντας ένα μικρόμετρο προσοφθάλμιο το μικρόμετρο και το μήκος που μετρήσατε ζωγραφισμένα συγκεκριμένα μέρη 100 σπέρμα. Διπλωμένο μήκος βάφονται οικόπεδα που μετριούνται spermatozoid και διαίρεση ο αριθμός που προκύπτει από 100, Αποκτήστε το μέσο μήκος, εκφράζοντας sukcinatdegidrogenaznuû δραστηριότητα για ένα σπερματοζωάριο. Εντάξει είναι 4,3 ± 0,7 μm. Αυτό μετράει δραστηριότητα SDG πιο κατατοπιστική και ως εκ τούτου συνιστάται για χρήση για επιστημονικούς σκοπούς.

Για ευρεία εφαρμογή στην πράξη αυτή η μέθοδος είναι κάπως περίπλοκη, Είναι προτιμότερο να εκφράζουν τον αριθμό των ηλεκτρικό αφυδρογονάσης στον Η μέθοδος Astal′di-βέργα. Είναι μέσο συντελεστή κυτταροχημικές SDG σπερματοζωάρια σε ένα κανονικό εκσπερμάτωση 2,7 ± 0.3.

В клетках сперматогенеза активность СДГ выявляется в виде скоплений крупных сине-фиолетовых гранул, часто сливающихся в крупные глыбки, располагающиеся в различных участках цитоплазмы. Средний цитохимический коэффициент в клетках сперматогенеза не достигает 2,0. По мере созревания клеток эякулята активность СДГ нарастает и в зрелых сперматозоидах превышает 2,0. В цитоплазме отдельных лимфоцитов обнаруживаются крупные гранулы СДГ.

Определение активности пероксидазы в эякуляте

В сперматозоидах, клетках сперматогенеза и поддерживающих клетках извитых семенных канальцев пероксидаза отсутствует.

В нейтрофильных гранулоцитах эякулята активность пероксидазы выражена в значительной степени и может изменяться в зависимости от характера патологического процесса, так же как и в периферической крови. Уровень активности пероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах важен для оценки их функционального состояния и активности воспалительного процесса в мужских половых органах. Окраска мазков эякулята по Грэму—Кноллю и учет активности фермента по Астальди—Вергу проводятся аналогично мазкам крови.

Активность пероксидазы в клетках эякулята определяется по методу Грэма—Кнолля.

Αντιδραστήρια.

1. Η φορμόλη αλκοόλ (ίδιο, что и для кислой фосфатазы).

2. Пероксидазный реактив: ʙenzidin (на кончике скальпеля) διαλυμένο σε 6 ml 96 % αιθυλική αλκοόλη, προσθέστε 4 ml αποσταγμένου νερού 0,02 ml 3 % υπεροξείδιο του υδρογόνου. Реактив годен к употреблению в течение 5—6 дней.

3. Краситель Романовского в разведении 1—2 капли на 1 ml αποσταγμένου νερού.

Μέθοδος. Свежие мазки эякулята фиксируют в течение 30 с формалиновым спиртом, промывают проточной водой и высушивают. Затем мазки заливают пероксидазным реактивом на 5—7 мин, тщательно промывают в проточной воде и высушивают. После этого их докрашивают 15— 20 мин красителем Романовского, промывают проточной водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа.

При положительной реакции на пероксидазу в нейтрофильных гранулоцитах обнаруживаются крупные золотисто-коричневые гранулы в значительном количестве. При большом количестве лейкоцитов необходимо подсчитывать средний цитохимический коэффициент (SCK). В цитоплазме отдельных гистиоцитов пероксидаза содержится в виде небольших скоплений таких же гранул.

Определение гликогена в эякуляте

Изменения содержания гликогена в различных клетках отражаются на их функции или свидетельствуют о развитии патологического процесса. Определение гликогена в клетках проводится методом Мак-Мануса.

Αντιδραστήρια.

1. Водный раствор йодной кислоты 1 % (готовится перед употреблением).

2. Сернистая вода: 5 ml 10 % метабисульфита калия или натрия, 5 ml 1 ν υδροχλωρικού οξέος, вода до 100 ml (готовится перед употреблением).

3. Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина для фуксиносернистой кислоты, предварительно растертого в фарфоровой ступке, растворяют при постоянном встряхивании в течение 5 мин в 200 мл кипящей дистиллированной воды, пропускают через бумажный фильтр и добавляют при охлаждении до 50 ° C 20 ml 1 ν υδροχλωρικού οξέος, а при охлаждении до 25 °С — 1 г метабисульфита калия или натрия. Приготовленный реактив выдерживают в холодильнике в течение 24 ч после чего он просветляется и стано вится пригодным для употребления

4.Водный раствор метилового зеленого 2 %, промытый хлороформом

5.Химически чистый метиловый спирт.

Μέθοδος.

Тонкие высушенные мазки эякулята фиксируют химически чистым метиловым спиртом в течение 3 m, ополаскивают дистиллированной водой и опускают в стаканчик с 1 % водным раствором йодной кислоты на 5 m. Затем мазки промывают дистиллированной водой, высушивают, ополаскивают в сернистой воде и снова высушивают.

Далее опускают мазки в стаканчик с реактивом Шиффа на 15 m, ополаскивают их в трех порциях сернистой воды (με 3 мин в каждой), промывают 10 мин в воде и докрашивают ядра клеток 3 мин метиловым зеленым. После этого снова ополаскивают мазки водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с помощью иммерсионной системы микроскопа.

В зрелых сперматозоидах гликоген отсутствует. В цитоплазме молодых сперматозоидов, особенно с «воротничком», выявляются следы гликогена (±), иногда в виде единичных гранул в верхней части головки или в области «воротничка».

В клетках сперматогенеза гликоген обнаруживается в большом количестве в виде вишнево-красных гранул, заполняющих всю цитоплазму. По мере созревания клетки теряют гликоген вплоть до исчезновения его в зрелых сперматозоидах. Сперматоциты содержат гликоген не только в цитоплазме, но и в ядре. В поддерживающих клетках извитых семенных канальцев гликоген располагается в виде вишнево-красных гранул и диффузно. Зрелые нейтрофильные гранулоциты в эякуляте, как и в мазках периферической крови, содержат значительное количество гликогена. При хроническом простатите в нейтрофильных гранулоцитах эякулята значительно возрастает количество гликогена и повышается активность пероксидазы. В единичных лимфоцитах в норме иногда встречаются гранулы гликогена.

Τα μακροφάγα содержат следы гликогена Фон мазков эякулята окрашивается в вишнево-красный цвет, что свидетельствует о наличии в плазме эякулята большого количества гликозаминогликанов (mukopolisaxaridov).

Определение рибонуклеиновой кислоты (RNA) κατά την εκσπερμάτωση

Повышенное содержание РНК в клетках свидетельствует о высокой активности их в отношении роста, секреторной, синтетической и другой деятельности. Снижение содержания РНК в молодых клетках часто сопряжено с пониженной способностью этих клеток к регенерации. Содержание РНК в клетках определяется методом Курника.

Αντιδραστήρια.

1. Реактив Курника: готовят отдельно 2 % растворы метилового зеленого и пиронина, раствор метилового зеленого тщательно промывают хлороформом; рабочий раствор красителя приготавливают путем смешивания 2 % раствора пиронина (12,5 ml) και 2 % λύση του μεθυλίου πράσινο (7,5 ml) с добавлением 30 ml αποσταγμένου νερού. Краситель стойкий, αποθηκεύονται στο ψυγείο.

2. Фиксатор — химически чистый метиловый спирт.

Μέθοδος. Мазки фиксируют метиловым спиртом в течение 3 m, окрашивают рабочим раствором пиронин-метилового зеленого 15 m, быстро ополаскивают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа. РНК окрашивается пиронином в ярко-красный цвет, ядра клеток — метиловым зеленым в зеленый.

Зрелые сперматозоиды не содержат РНК. Клетки сперматогенеза богаты РНК, количество которой убывает в клетках по мере их созревания. У сперматогоний цитоплазма насыщенно-розового цвета, у сперматоцитов она бледнее, και у сперматид бледно-розовая. У юных сперматозоидов с «воротничком» в розовый цвет окрашивается преимущественно «воротничок».

Σπέρμα, находящиеся на последней стадии своего развития, в поддерживающих клетках извитых семенных канальцев теряют остатки розовой субстанции (RNA) и превращаются в зрелые сперматозоиды.

В клетках сперматогенеза содержится большое количество гликогена, РНК и значительно выражена активность СДГ и КФ. Αλλά, συνήθως, эти клетки единичные в эякуляте, поэтому подсчет СЦК нецелесообразен. В таких случаях ограничиваются описательной формой заключения.

Цитохимическая характеристика лейкоцитов является важным показателем их функциональной активности. Учет количества вещества в лейкоцитах эякулята проводится так же, как и в других клетках эякулята и в периферической крови.

В окрашенных обычными методами мазках эякулята (азурозиновыми смесями, гематоксилин-эозином и пр.), а также в нативных препаратах не всегда легко различить лейкоциты, κύτταρα της σπερματογένεσης, эпителий предстательной железы, гистиоциты и другие элементы.

Цитохимические методы в сочетании с морфологическими нередко помогают установить вид клеток. Έτσι, выраженная активность пероксидазы, представленной крупными золотисто-коричневыми гранулами, заполняющими всю цитоплазму клетки, характерна для зрелых нейтрофильных гранулоцитов, у других клеток такая реакция не наблюдается. Выраженная реакция на гликоген типична для нейтрофильных гранулоцитов и клеток сперматогенеза, но последние не обладают пероксидазной активностью. РНК содержится в клетках сперматогенеза и отсутствует в зрелых гранулоцитах. Клетки сперматогенеза обладают выраженной реакцией на кислую фосфатазу, а в нейтрофильных гранулоцитах она выражена очень слабо и т. δ.