Cytochemickými studium ejakulátu

Cytochemickými reakce, prováděny s ejakulátu, poskytuje vhled do chemického složení a funkční aktivitu svých buněk.

Stanovení kyselá fosfatáza ejakulátu

Acid fosfatázy ejakulátu mnohokrát větší, než je jeho aktivita v krvi. Kyselé fosfatázy je součástí prostatického sekretu, jeho výroba je stimulována mužského gonadotropinu. Použití cytochemické reakce je detekován ve spermatu a dalších buňkách ejakulátu. Aktivita je určena jeho Metoda Goldberg - Barka.

Činidla.

1. Formalín alkohol (jedna část ready 40 % formalinu rozpuštěn v devíti díly 96% ethylalkohol).

2. Pararozanilin: 1 g základní fuchsin pro Phuc- Kyselina sinosernistoy rozpuštěné během zahřívání v 25 ml 2 N kyseliny chlorovodíkové; chlazený, filtrovány a skladovány v chladničce. Reagent odolný.

3. Vodný roztok dusičnanu sodného 4 %. 4. Roztok methyl-zelená pro acetátového pufru 2 % (pH - 5). Výsledný roztok se promyje chloroformem, pak míchá přibližně stejným množstvím chloroformu a 2 % methyl-zelený roztok. Spadl v průběhu dne, a pak se lakované v purpurové barvy, chloroform se odstraní s dělicí nálevkou.

5. Inkubatsionnaya prostředí, skládající se ze dvou složek.

• Komponenta: 20 mg naftol-A5-fosfát byl rozpuštěn v 0,5 (0,3) ml dimethylformamidu, přidat 40 ml 0,1 N roztoku octanu sodného a filtruje se přes filtrační papír; příprava studie den.
• B-složka: 8 kapky 4 % dusičnanu sodného, ​​roztok se smíchá s 8 kapky pararozanilina; jsou ex tempore. Pro získání obě složky inkubačního prostředí je spojen (pH 5,2-5,4). Pokud je to nutné, opravit jakékoli pH 50 % octová kyselina, roztok hydroxidu alkálií.

Metoda. Čerstvý ejakulát se odstředí, kdy velký počet spermií výčepních centrifugace. Od sedimentu připravit leštěné sklo tenké tahy, že, jakož i krevní nátěry, vysuší se na vzduchu. Vysušené pevné skvrny ponořením je v kádince s formalinem alkoholu 30 z (ne více) a promyje se destilovanou vodou. Potom se šmouhy se ponoří do kádinky s inkubačním médiem a umístí do inkubátoru při teplotě 37 ° C 2 žádná. Potom byly opláchnuty destilovanou vodou, ponořily po dobu 10 min ve sklenici s roztokem methyl-zelené (kontrastně pro jádra), rychle smýt vodou, vysušeny s filtračním papírem a zkoumány ponorným systému mikroskopu,.

Kyselé fosfatázy aktivita může být vyjádřena průměrným cytochemické faktoru (SCK) podle Metoda polukolychestvennomu Astaldi-Verga. Podle vzorce

SCK =(3* 2 * b * 1)/100

kde čísla v čitateli indikuje intenzitu barev (maximum - 3, mírné - 2, stopy - 1), a písmena - podle procentuálního podílu buněk počítán určitou intenzitu barev; figura 100 ve jmenovateli - celkový počet buněk počítá.

Například, napočítal 100 buňka, z nichž mají maximální intenzitu barev 20 buňka, mírné - 20 a následující - 60 buňka. Zde:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6

Fosfatáza kyselina spermie nachází v jednotce granulí červeno-oranžové v horní části hlavy.

Obsazeno chromatin část hlavy je zelená a neobsahuje kyselé fosfatázy.

Rozptýlenější bledá barva na kyselé fosfatázy je detekován kolem spodní části hlavy, a někdy se rozšiřuje k hrdlu spermie. Střední cytochemické koeficient kyselé fosfatázy v normálním spermií ejakulátu je 2,0-2,4.

V cytoplasmě buněk spermatogeneze odhalil hromadění granulí, pestře malovaný v konkrétních (červeno-oranžový) barva. V podpůrných buňkách spletité semenných kanálcích, často ostře pozitivně barveny na kyselé fosfatázy, průsvitný non-barevný head (xromatin) spermie. Histiocytů a makrofágy obsahují několik granulí, pozitivně barveny na kyselé fosfatázy. V izolovaných lymfocytů, a někdy i neutrofily jsou jednotlivé pelety, mající aktivitu kyselé fosfatázy.

Stanovení sukcinát dehydrogenázy (SDG) v ejakulátu

Sukcinatdegidrogenaza - Enzym, účastní redoxních reakcí, obsažené v buňkách, ve značném počtu ejakulátu. Avšak povaha změny své činnosti v různých patologických procesů je stále ještě není dobře pochopena. Sukcinát dehydrogenázy v buňkách se stanoví modifikovanou metodou Nartsissova.

Činidla.

1. Aceton-Trilon (aceton - 60 ml, distillirovannaya voda - 40 ml, Trilon B - 250 mg).

2. Roztok methyl zelené 2 % (stejné barvivo, který se používá pro kyselé fosfatázy).

3. Inkubatsionnaya prostředí, se skládá z následujících komponent:

a) fosfátový pufr (pH 7,2-7,4) - 10 ml;

na) 5,4 % roztoku sukcinátu sodného - 10 ml;

v) Komplexon III (13 zředěný v mg 5 ml destilované vody);

g) destilovaná voda - 5 ml;

d) nitrotetrazolium fialová (10 zředěný v mg 10 ml vody).

Všechny složky se smísí v jednom balení a uloženy v chladničce. Vyrobí se médium mohou být znovu použity - pro 10 dní nebo více.

Metoda. Šmouhy, připravený z ejakulátu, fixovány v acetonu za Trilon- 30 z, promyje destilovanou vodou a vysuší se na vzduchu. Potom se šmouhy se ponoří do inkubačního média a umístěny do inkubátoru při teplotě 37 ° C 1 žádná, načež se promyje destilovanou vodou a dokrashivayut methylovou zelení pro 10 m. Pak znovu rychle promyje vodou, vysušeny s filtračním papírem a zkoumány ponorným systému mikroskopu,.

Normální spermie mají vysokou aktivitu sukcinát dehydrogenázy, zastoupenou velkými modrými-fialové granulí, že, slučování spolu, vytvoří hustá hmota, plnicí hrdlo spermie, některé spermie jednotlivé pelety se nacházejí kolem hlavy.

Vypočítat spojily granule není možná, proto, aby stanovení aktivity sukcinátdehydrogenáza zbarvené části spermií měřeno v mikrometrech. Po celé délce malované speciálně pro sukcinátdehydrogenáza spermií jsou posuzovány na stupni aktivity enzymu v spermií. S oční mikrometrů a délku objektově mikrometrů se měří v konkrétním barevné části 100 spermatozoidax. Přidání délku počítá v obarvených částech spermií, a vydělením výsledného postavu prostřednictvím 100, obdrží průměrnou délku, vyjadřující suktsinatdegidrogenaznuyu aktivity pro jednu spermie. Za normálních okolností, to je 4,3 ± 0,7 m. Tento výpočet LDH aktivita je nejvíce informativní a proto se doporučuje použít pro výzkumné účely.

Pro široké uplatnění v praxi, tato metoda je poměrně složitá, Je výhodné, aby vyjádření množství sukcinát dehydrogenázy Astaldi-metoda Verga. Střední cytochemické koeficient LDH spermií v ejakulátu je normální 2,7 ± 0,3.

V buňkách spermatogeneze Aktivita LDH je detekován ve formě shluků velkých modrofialové granulí, často sloučit do velkých shluků, se nachází v různých oblastech cytoplasmy. Middle cytochemické faktorem v buňkách spermatogeneze toku 2,0. Při zrání buněk ejakulátu a zvyšuje aktivitu LDH v zralého spermií přesahuje 2,0. V cytoplazmě některých lymfocytů nalezeno granulí SDG.

Stanovení aktivity peroxidázy v ejakulátu

Sperma, Spermatogeneze buňky a podpůrné buňky spletité semenných kanálcích Peroxidase chybí.

Neutrofilní granulocyty ejakulátu peroxidázová aktivita je vyjádřena v podstatné míře a může se lišit v závislosti na povaze tohoto patologického procesu, jakož i v periferní krvi. Úroveň aktivity peroxidázy v neutrofilech, je důležité vyhodnotit jejich funkční stav a aktivitu zánětlivého procesu v mužských pohlavních orgánů. Stained šmouhy spermatu Graham-Knoll a účetnictví aktivity enzymu Astaldi-Verga jsou obdobné krevní nátěr.

Aktivita peroxidázy v buňkách ejakulátu je určena Způsob Graham-Knoll.

Činidla.

1. Formalín alkohol (stejný, a tím, že kyselé fosfatázy).

2. Peroksidaznыy činidlo: ʙenzidin (na špičce skalpelem) rozpustí v 6 ml 96 % ethylalkohol, přidat 4 ml destilované vody 0,02 ml 3 % peroxid vodíku. Reagent použitelný pro 5 až 6 dnů.

3. Romanovský Dye v ředění 1-2 kapek na 1 ml destilované vody.

Metoda. Čerstvé sperma stěry byly stanoveny pro 30 formalinu s alkoholem, promyje se tekoucí vodou a vysuší. Potom se přidá Strokes peroxidázy činidlo pro 5-7 minut, důkladně promyje v tekoucí vodě a suší. Od té doby se dokrashivayut 15 20 min barvivo Romanovský, promyta tekoucí vodou, usuší a mikroskopiruyut pomocí ponoření mikroskopu systému.

Když pozitivní reakce na peroxidázu v neutrofilních granulocytů odhaluje velké zlato-hnědé granule ve velkých množstvích. Díky velkému počtu bílých krvinek, potřebné pro výpočet Průměrná cytochemické faktor (SCK). Cytoplazma histiocytů individuálního peroxidázy je přítomna jako malé shluky, jako jsou granule.

Stanovení glykogenu v ejakulátu

Změny v obsahu glykogenu v různých buňkách ovlivnit jejich funkci nebo důkazy rozvoje patologického procesu. Stanovení glykogenu v buňkách se provádí by McManus.

Činidla.

1. Vodný roztok kyseliny jodisté 1 % (příprava k použití).

2. Sernistaya voda: 5 ml 10 % metasiřičitan draslík nebo sodík, 5 ml 1 N kyseliny chlorovodíkové, voda 100 ml (příprava k použití).

3. Reagent Shiffa: 1 g základní fuchsin pro kyselinu fuksinosernistoy, předem rozdrcené v porcelánové třecí, se rozpustí za stálého třepání po dobu 5 min 200 ml vroucí destilované vody, prošel přes papírový filtr a byl přidán za chlazení do 50 ° C 20 ml 1 N kyseliny chlorovodíkové, a když se ochladí na 25 ° C - 1 g draselný nebo disiřičitan sodný. Připravený činidlo se uchovávat v ledničce pro 24 h po kterém on osvícen a stávají nevhodnými k lidské spotřebě vitsya

4.Vodný roztok methylovou zelení 2 %, promyje chloroformem

5.Chemicky čistá metylalkohol.

Metoda.

Tenké sušené šmouhy ejakulát pevně chemicky čistá methyl alkohol 3 m, opláchnuty destilovanou vodou a ponoří do kádinky s 1 % vodného roztoku kyseliny jódu 5 m. Pak šmouhy se promyjí destilovanou vodou, vysuší, siřičité opláchne vodou a suší se znovu.

Další tampony máčené v šálku s Schiffovým činidlem na 15 m, opláchněte je ve třech částech sirné vody (podle 3 min každý), promyje 10 min ve vodě a buněčných jádrech dokrashivayut 3 min methylová zeleň. Pak znovu propláchne vodou tampóny, Filtrační papír se vysuší mikroskopiruyut pomocí ponoření systému mikroskopu.

Ve zralé spermie chybí glykogen. V cytoplazmě mladého spermií, zejména s "límcem", odhalila stopy glykogenu (±), někdy i ve formě jednotlivých pelet v horní části hlavy, nebo v "límec".

V buňkách spermatogeneze Glykogen je nalezený ve velkých množstvích ve formě vytvoří třešňově červené granule, vyplní celý cytoplasmy. S zrání buněk ztratí glykogenu až do jeho zmizení v zralé spermie. Spermatocitы glykogen obsahuje nejen v cytoplazmě, ale také v jádru. V podpůrných buňkách spletité semenných kanálcích, glykogen se vytvoří třešňově červené granule a difuzní. Zralé neutrofilních granulocytů v ejakulátu, stejně jako v nátěru periferní krve, obsahují značné množství glykogenu. Při chronické prostatitidy v neutrofilních granulocytů ejakulátu výraznému zvýšení množství glykogenu a zvyšuje aktivitu peroxidázy. V ojedinělých lymfocytů jsou někdy nalezené v normálních glykogenu granule.

Makrofágy obsahovat stopy glykogen pozadí spermatu nátěrech obarvených v třešňově červené zabarvení,, což ukazuje na přítomnost v plazmě ejakulátu velkého množství glykosaminoglykanů (mukopolisaxaridov).

Definice ribonukleové kyseliny (RNA) v ejakulátu

Zvýšené hladiny RNA v buňkách To ukazuje vysokou aktivitu proti jejich růstu, sekretornoй, syntetické a další aktivity. Snížení množství RNA v mladých buňkách často spojena se sníženou schopnost těchto buněk pro regeneraci. Obsah RNA v buňkách se stanoví metoda kurníku.

Činidla.

1. Reagent Chicken Coop: připravené odděleně 2 % methyl zelených řešení a pyronine, methyl-zelený roztok se pečlivě promyje chloroformem; barviva pracovní roztok se připraví smícháním 2 % Řešení pyronine (12,5 ml) a 2 % methyl-zelený roztok (7,5 ml) s přídavkem 30 ml destilované vody. Barvivo odolné, uchováván v chladničce.

2. Lock - chemicky čistý metylalkohol.

Metoda. Skvrny jsou upevněny s methanolem za 3 m, barviva pracovní roztok pyronine-methylová zeleň 15 m, rychle se propláchne vodou a suší se filtračním papírem. Mikroskopiruyut pomocí ponoření mikroskopu systému. RNA pyronine maloval v zářivě červené barvě, buněčná jádra - methyl zelená zelená.

Zralé spermie neobsahují RNA. Buňky jsou bohaté na RNA spermatogeneze, což snižuje počet buněk při jejich splatnosti. V spermatohonyy Cytoplazma bohatou růžovou barvu, v spermatotsytov co blednutí, a v spermatid světle růžová. V mladém spermií "límec" pink maloval převážně "límec".

Spermie, se nachází v poslední fázi jeho vývoje, v podpůrných buňkách spletité semenných kanálcích ztratí zbytky růžové látky (RNA) a stát se zralé spermie.

V buňkách spermatogeneze obsahuje velké množství glykogenu, RNA byla významně vyjádřena LDH aktivitu a CF. Ale, obvykle, tyto izolované buňky v ejakulátu, proto počítat CBFV nepraktické. V takových případech, omezeno na narativní formě závěru.

Cytochemické charakterizace leukocytů Je důležitým ukazatelem jejich funkční aktivity. Počítání počtu leukocytů v ejakulátu látky se provádí ve stejném, Stejně jako v jiných buňkách v ejakulátu a periferní krve.

V nátěrech obarvených obvyklými metodami ejakulátu (azurozinovymi směsi, Hematoxylin-eosin a další.), stejně jako nativní přípravky nejsou vždy snadné rozlišit leukocytů, buňky spermatogeneze, prostaty epitel, histiocyty, a další prvky.

Cytochemické techniky ve spojení s morfologických často pomůže stanovit druh buněk. Tak, vyjádřeno aktivita peroxidázy, poskytované velké zlaté, hnědé korálky, vyplní celý cytoplazmy buněk, charakteristika zralých neutrofilů, v jiných buňkách, jako je pozorována reakce. Těžká reakce na glykogenu je typické pro neutrofily a buněk spermatogeneze, ty však nemají aktivitu peroxidázy. RNA obsažené v buňkách a spermatogeneze žádné zralé granulocyty. Buňky spermatogeneze mají výraznější reakce na kyselé fosfatázy, a neutrofilní granulocyty, ona vyjádřila velmi špatně, a tak dále. d.