Studium srážení krve

Způsoby zkoumání koagulační systém zahrnuje následující skupiny:

1. Indikativ (obecný), dává představu o stavu celého koagulační kaskády jako celku a jeho jednotlivých etapách (registrace lze provést vizuálně nebo pomocí samostatných zařízení - koagulografu, tromboelastograf atd.);
2. diferencující deficit jednotlivých faktorů - korektivní koagulační testy, testy míšení studované krevní plazmy s krevní plazmou pacientů se známým deficitem určitých faktorů;
3. kvantitativní určení jednotlivých složek systému jejich funkční činností (koagulační testy, studie na chromogenních a jiných substrátech) a (nebo) imunologickými markery;
4. identifikace intravaskulární aktivace procesu krevní koagulace a fibrinolýzy funkčními charakteristikami nebo molekulárními markery takové aktivace - identifikace aktivovaných koagulačních faktorů v oběhu, produkty degranulace krevních destiček, rozpad složek krevního koagulačního systému nebo jejich metabolitů, vznik nových antigenních markerů aktivovaných faktorů a jejich komplexů, zrychlená metabolizace značených složek krevního koagulačního systému (snížení jejich poločasu v oběhu).

Tak, při hodnocení stavu systému srážení krve se používají jako koagulační techniky (laboratorní a přístrojové), tvoří základ diagnostického procesu, a imunologické, radionuklidy a další typy výzkumu. Navíc v mnoha případech mohou být součásti systému určeny jak funkční činností, a imunologicky - podle obsahu odpovídajícího antigenu v krvi. Paralelní použití takových technik umožňuje odlišit formy patologie, spojené s nedostatkem syntézy odpovídajícího koagulačního faktoru (v tomto případě je obě jeho funkční aktivita stejně snížena, a množství antigenu), a tvary, ve kterém je molekula faktoru syntetizována, ale je abnormální a funkčně vadná.

Pro označení prvních forem se k číslu odpovídajícího faktoru přidá znak „—“. (např, VIII-, IX- a t. d.), a ve druhém - znaménko „+“. (např, VIII+, IX+).

Přibližný (obecný) koagulační testy

Stanovení doby srážení krve

Stanovení doby srážení krve (lepší než Lee-White technika) - dlouho používaný, rychlá realizace (přímo u lůžka pacienta) orientační test, umožňující odhalit významné krvácivé poruchy, spojené s nedostatkem hemokoagulačních faktorů (kromě faktoru VII) nebo s působením antikoagulancií a fibrinolytik. Používá se jako orientační test a ke sledování heparinové terapie, eliminaci účinku heparinu s protaminsulfátem. Test je relativně málo citlivý, jeho ukazatele jsou porušeny pouze s výrazným poklesem obsahu koagulačních faktorů v plazmě (pod 4-5 %), proto není vhodný pro detekci mírných forem hemofilie A a B, stejně jako poruchy srážlivosti krve u angiohemofilie, nedostatek faktoru XI, prekalikrein a vysokomolekulární kininogen. Z těchto důvodů nelze test použít k předoperačnímu vyšetření pacientů.: s normálními výsledky testů (5-10 min) může dojít k hojnému pooperačnímu krvácení.

Doba rekalcifikace plazmy

Doba rekalcifikace plazmy - nestandardizovaný test nízké citlivosti, méně spolehlivé pro detekci hypokoagulace, než doba srážení plné krve. Nelze doporučit pro diagnostiku poruch hemostázy.

Aktivovaný plazmatický parciální tromboplastinový čas

Aktivovaný plazmatický parciální tromboplastinový čas (APTV, kaolin-kefalinový test) - vysoce citlivá metoda, detekce poruch srážlivosti krve, když se proces spustí prostřednictvím vnitřního mechanismu. Selektivně citlivý na nedostatek plazmatických koagulačních faktorů (od nedostatku krevních destiček a faktoru 3 trombocyty jsou kompenzovány externě podávaným cefalinem nebo erytrofosfatidem).

Používá se ke sledování heparinové terapie, předoperační vyšetření pacientů atd.. d. Standardní indikátory závisí na použitých vzorcích kefalinu, ve většině případů je to 37-50 s (optimální - 37-45 s).

Čas kaolinové plazmy

Plazmový kaolinový časový test, podobný předchozímu, ale bez přidání cefalinu do plazmy (erytrofosfatid), v důsledku toho je citlivý nejen na nedostatek plazmatických koagulačních faktorů, ale také na nedostatek krevních destiček a faktoru 3 Destiček. Přibližné posouzení aktivity tohoto faktoru lze provést porovnáním kaolinového času plazmy testovaného subjektu s vysokým a nízkým obsahem krevních destiček (norma - 57-70 s).

Použití fosfolipidových složek se nedoporučuje, dává v APTT dobu srážení rovnající se 55 s nebo více, protože to prudce snižuje přesnost a reprodukovatelnost testů, včetně kvantitativního stanovení faktorů VIII a IX.

Doba silikonové plazmy

Doba silikonové plazmy je doba rekalcifikace plazmy, získané silikonizací jehel, zkumavky, pipeta, T. to je. s minimální aktivací kontaktu. Test je citlivý na hyperkoagulaci – intravaskulární aktivaci počáteční kontaktní fáze (faktory XII a XI), tato porucha se však jasněji identifikuje stanovením doby srážení silikonu celé krve (na základě Lee-White metody nebo tromboelastografického záznamu procesu v silikonizované kyvetě).

Standardní indikátory závisí na použitém silikonu a jsou stanoveny testováním krve zdravých lidí pro každý vzorek zvlášť.. Při výběru silikonu je nejlepší ten, která v největší míře prodlužuje dobu srážení krve (plazma).

Protrombin (tromboplastin) plazmový čas

Protrombin (tromboplastin) plazmový čas (Kwik čas, index protrombin) charakterizuje rychlost koagulace rekalcifikované krevní plazmy, když je proces spuštěn vnějším mechanismem, T. to je. s přídavkem tromboplastinu lidského mozku (nebo králíka).

Tromboplastinová aktivita standardizované na smíšené vzorky normální (řízení) plazma. Nejčastěji se používají tromboplastiny s aktivitou 12-18 s. (klasickou metodou Quick - 12-13 s). Čím slabší je tromboplastin, tím větší chyba metody.

Při normálním plazmatickém protrombinovém čase umožňuje test identifikovat izolovaný nebo kumulativní nedostatek faktorů protrombinového komplexu - VII, X, V a II, z toho tři faktory (VII, X a II) K-vitamíny jsou závislé a jejich aktivita se vlivem nepřímých antikoagulancií snižuje. V tomto ohledu je hlavním při sledování dávkování kumarinů protrombinový test (neodikumarin, nebo pelentan, Sinkumar a kol.) a další drogy z této skupiny (fenilin).

Protrombinový čas zůstává normální při deficitu faktorů vnitřního mechanismu aktivace protrombinázy - faktorů XII, XI, IX, VIII (T. to je. pro všechny typy hemofilie a Hagemanovy vady), stejně jako s deficitem prekalikreinu a vysokomolekulárního kininogenu (VM kininogen)

V literatuře jsou přijímány různé věci označení výsledků protrombinového testu. Nejvhodnější je indikovat protrombinový čas testu a kontrolní krevní plazmu v sekundách (který také poskytuje informace o aktivitě použitého tromboplastinu). Někdy se používá poměr těchto dvou veličin, T. to je. index (PT zkušební plazmy, z ,)/(PT kontrolní plazmy, z), (norma je 0,9-1,1).

Další forma hodnocení tohoto ukazatele, který se nejvíce používá v laboratořích, je výpočet protrombinového indexu v procentech sestavením inverzního aritmetického podílu (norma — 90-110 %), tento výpočet je však nesprávný, protože existuje nearitmetický vztah mezi koncentrací faktorů srážení a dobou srážení, a logaritmickou závislost. Kromě, protrombinový test je citlivý pouze na pokles níže uvedených koagulačních faktorů 50 % jejich normální velikost. Z tohoto důvodu je vhodné použít stanovení protrombinového indexu v procentech podle křivky ředění (1:2, 1:4, 1:8 a t. d.) smíšený vzorek normální plazmy. Tato křivka je sestrojena jednou pro tromboplastiny různých počátečních aktivit (z 12 na 18 z) a používá se ke stanovení protrombinového indexu u studovaných pacientů. Výhodou této techniky je také to, že výsledky všech studií, včetně těch, které se provádějí dynamicky v různých dnech, nesouvisejí s náhodně odlišnými vzorky normální krevní plazmy, a na zprůměrované stejné standardní parametry, v důsledku toho se výrazně sníží chyba metody. Indexy, získané z křivky podílu a ředění normální plazmy, navzájem zcela nekonzistentní. To je třeba vzít v úvahu i při sledování účinku nepřímých antikoagulancií., protože snížení obvyklého indexu na 50 % přibližně odpovídá poklesu indexu podél křivky ředění na 25-30 %• V tomto ohledu by analýzy měly vždy ukazovat, Jak se vypočítal protrombinový index?, jaké jsou jeho standardní ukazatele pro tromboplastin této aktivity.

Plazmatický trombinový čas

Plazmatický trombinový čas, T. to je. doba srážení citrátové plazmy, když je k ní přidán trombin standardní aktivity, je hlavním testem pro posouzení konečného stadia koagulace krve. Zohlednění tohoto ukazatele je důležité pro správnou interpretaci všech ostatních koagulačních testů, protože narušení konečného stádia srážení krve by u všech výše uvedených metod nevyhnutelně mělo vést ke zvýšení doby srážení.

Ve většině případů se při provádění trombinového testu používá tato koncentrace roztoku trombinu, který po smíchání se stejným objemem krevní plazmy produkuje koagulaci za 12– 18 z, ale při rozpoznání dysfibrinogenémie se používají i slabší koncentrace (což vede ke koagulaci za 30-35 s).

Trombinový čas - důležitý diagnostický ukazatel, jeho porušení je pozorováno jako u vrozených, a s často se vyskytujícími získanými (sekundární) hypoprotrombinémie, s většinou dysfibrinogenemií, a také pod vlivem heparinu, produkty fibrinolýzy (PDF) a řada dalších antitrombinů a inhibitorů samouspořádání fibrinových monomerů. Z tohoto důvodu je trombinový čas primárně a ve větší míře narušen u akutních a subakutních syndromů DIC, který hraje důležitou roli pro rychlou diagnostiku této patologie.

Autokoagulační test

Autokoagulační test (AKT) - vysoce citlivý dvoustupňový, charakterizuje proces srážení krve, když je spuštěn vnitřním mechanismem. Stejně jako APTV, test není citlivý na nedostatek faktoru VII, ale zároveň jeho indikace nezávisí na obsahu fibrinogenu (faktor I) ve studované krevní plazmě, jak se liší od všech ostatních indikativních koagulačních testů.

Další výhodou ACT je to, že se testuje zředěná krev, díky čemuž je citlivost testu na deficit koagulačních faktorů a, Kromě, provádění ACT nevyžaduje použití kaolinu a cefalinu, protože standardizace kontaktu a aktivace fosfolipidů v něm je dosažena hemolyzátem vlastních červených krvinek testovaného subjektu.

Podstatou ACT je, co 2 ml hypotonického roztoku (0,222 %) přidá se chlorid vápenatý 0,1 ml krve subjektu.

V této směsi hemolyzát-vápník se tvoří protrombináza a trombin, jehož aktivita je určena sekvenčním přidáváním 0,2 ml této směsi do 0,2 ml plazmy subjektu (každý 2 min během prvního 10 m, a pak každý 10 minut 1 žádná).

Plazma subjektu je zdrojem fibrinogenu, na kterém se testuje aktivita trombinu vzniklého ve směsi. Jak ukázaly četné studie, lze jej nahradit krevní plazmou zdravých lidí nebo roztokem fibrinogenu. V tomto případě se spotřeba krve pacienta sníží na 0,1-0,2 ml (lze sejmout z prstu!), co transformuje autokoagulační test na mikrokoagulační test (ICT) a je velmi vhodný pro použití v pediatrii, včetně při studiu hemostázy u novorozenců.

Koagulační aktivita u ACT a MCT zpočátku se zvyšuje a u zdravých lidí obvykle dosahuje maxima do 10. minuty, inkubace směsi krve a vápníku (KCS), kdy koagulace substrátové plazmy nastane za 10±1 s. Poté začne koagulační aktivita CCS klesat, což ukazuje na inaktivaci v něm vytvořeného trombinu. U hemofiliků, expozice heparinu a dalším poruchám koagulace je koagulační aktivita CCS prudce snížena, a maximum se přesune z 10. minuty na pozdější datum. Při hyperkoagulaci je pozorováno dřívější a výraznější zvýšení aktivity trombinu v CCS.

Při provádění testu v jedné zkumavce (stanovení pouze v 10. minutě inkubace CCS) lze jej použít ke sledování heparinové terapie. Výhodou této techniky oproti testu aktivovaného parciálního tromboplastinového času je to, že neutralizuje nestejný vliv různých cefalinů na dobu srážení heparinu.

Na základě ACT (ICT) byla vyvinuta jednoduchá a přesná metoda pro diferenciální diagnostiku hemofilie.

Pomocí převodních tabulek uvedených v referenčních knihách, hodnoty ACT (ICT) lze vyjádřit v procentech a znázornit jako graf - autokoagulogram.

Instrumentální metody výzkumu jsou také široce používány k posouzení řady obecných parametrů srážení krve., především pomocí různých koagulografů a tromboelastografů.

Tromboelastografie dává představu nejen o časových parametrech srážení krve či plazmy, ale také o struktuře a mechanických vlastnostech výsledných sraženin. V posledních letech byla do hardwarových registračních metod zavedena standardizace kontaktní a fosfolipidové aktivace koagulačního procesu.. Vznikají také koagulogramy pro hromadné provádění obecných koagulačních testů - APTT, protrombin, trombin a další s automatickým záznamem výsledků.

Metody diferenciace deficitů různých koagulačních faktorů a jejich kvantifikace

Údaje v tabulce níže ukazují, že indikativní studie krevní koagulace pomocí tří hlavních testů umožňuje skupinovou diferenciaci deficitu různých plazmatických hemokoagulačních faktorů. Tak, zpomalení koagulace pouze v protrombinovém testu (I typ porušení) při normálních hodnotách pro všechny ostatní je charakteristický dědičný nedostatek faktoru VII nebo snížení hladiny tohoto faktoru v raných fázích rozvoje obstrukční žloutenky nebo v prvních 1-2 dnech léčby nepřímými antikoagulancii, když potlačení syntézy faktoru VII postupuje v jeho vývoji pokles hladiny všech ostatních koagulačních faktorů závislých na vitaminu K.

Pouze narušení vnitřního koagulačního mechanismu, T. to je. aktivovaný parciální tromboplastinový čas a ACT (II typ), pozorováno při nedostatku faktoru XII, XI, IX, VIII, von Willebrand (ne ve všech formách), prekallikrein a kininogen VM. Z toho u dědičných poruch koagulace nedostatek faktoru XII, prekalikrein a VM kininogen jsou pozorovány extrémně vzácně a nejsou doprovázeny žádným krvácením, zatímco nedostatek faktoru VIII (hemofilie A), IX (hemofilie v) a von Willebrandův faktor je velmi častý (je větší než 96 % všechny dědičné koagulopatie) a je doprovázeno těžkým krvácením. Mezi nimi se nejprve provádí další diferenciální diagnostika..

Nedostatek faktoru XI je poměrně vzácný (asi 0,5-1,0 % všechny hemofilie), dochází při velmi mírném krvácení (hlavně po úrazech a operacích) a zaujímá mezilehlé místo mezi první podskupinou asymptomatických poruch a hemofilií a von Willebrandovou chorobou.

Další typ poruchy je charakterizován prodloužením jak parciálního tromboplastinového času, tak ACT, a protrombinový čas. Je charakteristický pro nedostatek faktoru V, X nebo II nebo pro komplexní deficit všech K-vitamin-dependentních faktorů (VII, X, IX, II), co je pozorováno u obstrukční žloutenky a jiných typů nedostatku vitaminu K, a také při užívání nepřímých antikoagulancií.

A nakonec, jak je vidět z téže tabulky, Možné porušení všech tří testů (IV typ), co se pozoruje u dědičné a získané hypo- a dysfibrinogenemie (ne vše), při užívání přímých antikoagulancií (geparina, heparinoidy, Girudin a další.), léčba aktivátory fibrinolýzy a defibrinačními léky (streptokináza, urokináza atd.), výskyt patologických antitrombinů a látek v krvi, brání připojení (shromáždění) fibrinové monomery – paraproteiny, kryoglobuliny, imunitní komplexy, i u komplexních krvácivých poruch, způsobené syndromem DIC. V tomto případě je trombinový čas často narušen ve větší míře a poněkud dříve, než jiné testy.

S přihlédnutím k délce trvání onemocnění a možnosti jeho dědičné geneze nebo sekundární souvislosti s jinými typy patologie a léčivými či jinými vlivy, přítomnost či nepřítomnost krvácení a jeho typ, je možné správně určit genezi těchto hlubokých poruch srážlivosti krve.

Všechno diferenciační testy jsou založeny na principu korekce, T. to je. na definici, do jaké míry se zjištěná krvácivá porucha upraví popř, naopak, není eliminován vzorky krevní plazmy nebo uměle získanými krevními produkty se známým deficitem určitého koagulačního faktoru.

Za tímto účelem si specializované laboratoře vytvářejí sbírky krevní plazmy s deficitem faktoru., přijímat je od pacientů se známou hloubkou (méně 1 %) nedostatek každého z faktorů a skladujte je v malých obalech (podle 0,5 ml) při teplotě - 30 ° C. V případě potřeby se tyto vzorky rozmrazí a použijí při diagnostických testech..

Plazma, náhodně rozmražené nebo ponechané bez použití, nelze znovu zmrazit. V korekčních testech by se neměla používat plazma s imunitními inhibitory určitého faktoru.. Diagnostické soupravy od řady společností obsahují lyofilizované vzorky krevní plazmy s nedostatkem detekovatelných koagulačních faktorů (substrátová plazma). Řada krvácivých poruch je však v klinické praxi extrémně vzácná., v tomto ohledu se používají uměle připravené složky normální krve s deficitem některých koagulačních faktorů, stejně jako heterogenní plazmy (kuřata, kachňata atd.).

V tabulce jsou uvedeny informace o obsahu faktorů srážení krve v krevních složkách, používá se pro korekční koagulační testy v závislosti na jejich skladovatelnosti. Pomocí této tabulky, snadné dešifrování hodnot kteréhokoli ze tří hlavních koagulačních testů. V nápravných metodách tohoto druhu se používají testy, standardizované pro kontaktní a fosfolipidovou aktivaci, T. to je. kaolin-kefalin nebo pomocí hemolyzátu (v AKT).

Testy na míšení pacientovy krevní plazmy s plazmou, имеющей заведомо известный дефицит того или иного фактора

Определяют активированное парциальное тромбопластиновое время в исследуемой плазме крови, нормальной плазме (контроль) и в плазме с заведомо известным дефицитом факторов VIII (от больного гемофилией А), IX (от больного гемофилией В), XI и XII. Затем готовят смесь из образцов цитратной плазмы исследуемого (7/10 объема) и последовательно с каждой из дефицитных плазм (3/10 объема), начиная с дефицита фактора VIII и IX (наиболее частые формы патологии!).

К смеси добавляют каолин и кефалин, a 2 мин подвергают ее рекальцификации (na 37 ° C). В той смеси, где активированное парциальное тромбопластиновое время не нормализуется, имеется один и тот же дефект свертывания.

Tak, если у обследуемого больного активированное парциальное тромбопластиновое время не нормализуется добавлением плазмы крови больного с заведомо известным дефицитом фактора VIII, но корригируется плазмой крови больного с дефицитом фактора IX, у него имеется hemofilie A.

Podobně,, но на основе протромбинового теста дифференцируют дефицит факторов протромбинового комплекса (X, PROTI, VII и II).

Тест генерации тромбопластина

Для дифференциации нарушений внутреннего механизма свертывания крови чаще всего используется классический тест генерации тромбопластина с заменой тромбоцитарного компонента, приготовление которого требует значительной затраты времени и крови, кефалином Недостатками теста генерации тромбопластина являются его громоздкость, необходимость приготовления большого числа реагентов, значительная затрата времени на его выполнение.

Коррекционный тест, основанный на базе аутокоагуляционного теста.

Задачам экспресс-диагностики вполне отвечает другой коррекционный тест, основанный на проведении коррекции теми же компонентами нормальной крови на базе аутокоагуляционного теста.

Этот тест отличается высокой надежностью, быстротой и легкостью выполнения и требует небольшого (ne více 0,5 ml) количества крови исследуемого, что позволяет использовать его в педиатрической практике.

В нем, как и в тесте генерации тромбопластина, используют для коррекции адсорбированную плазму и старую сыворотку крови, которую повторно центрифугируют перед проведением исследования. В три пробирки разливают по 2 ml 0,222 % раствора хлорида кальция и в две из них добавляют 0,1 мл адсорбированной нормальной плазмы крови (1-я пробирка) a 0,1 мл старой нормальной сыворотки крови (2-я пробирка). В три другие пробирки вносят по 0,2 мл нормальной цитратной плазмы. Затем во все пробирки с раствором хлорида кальция добавляют по 0,1 мл цитратной крови исследуемого.

Ровно через 4 мин инкубации этой смеси ее свертывающую активность тестируют на нормальной плазме.

Резкое снижение коагулирующей активности только в первой пробирке (с нормальной BaSO₄-плазмой) свидетельствует о наличии у больного дефицита фактора IX (hemofilie v), только во второй пробирке (со старой сывороткой) — о дефиците фактора VIII (hemofilie A); если коррекция происходит в обеих пробирках (одинаково сильная), pak, samozřejmě, имеется дефицит фактора XI или XII (cm. Stůl. 14).

Данный тест высокочувствителен, так как исследование проводится на разведенной в 20 раз крови при компенсации фактора 3 тромбоцитов гемолизатом. Единственный используемый реактив — гипотонический раствор хлорида кальция, что делает пробу общедоступной.

Technika korekčních testů je stejně jednoduchá., prováděno na základě protrombinového testu k odlišení deficitu faktoru II, V a VII+, X (v tabulce).

Для того чтобы разграничить дефицит факторов VII и X, выполняется дополнительный коагуляционный тест с добавлением к исследуемой плазме крови раствора яда змеи гюрзы — препарат лебетокс (подбирается такая концентрация яда, которая в присутствии кефалина и хлорида кальция вызывает свертывание за 20—25 с; все ингредиенты берутся в количестве 0,1 мл и смешиваются) (таблица ниже).

С этой же целью используется препарат яда гадюки Расселла, обитающей в Индии (příprava стипвен).

Дифференциальную диагностику завершают при необходимости количественным определением дефицитных факторов или их специфических иммунных ингибиторов, для чего применяются специальные высокочувствительные стандартизированные методики. В этих методиках используется построение кривых разведения смешанных образцов нормальной плазмы крови с коррекцией дефицита всех факторов, кроме исследуемого. По этим кривым определяется активность исследуемого фактора в плазме больных.

Zvláště важно количественное определение концентрации факторов VIII и IX, а также наличия их ингибиторов у больных гемофилией А и В (особенно до и во время хирургических вмешательств и при проведении интенсивной заместительной терапии), а также при отсроченных профузных послеродовых кровотечениях, когда приходится дифференцировать ДВС-синдром и более редкую патологию — появление иммунного ингибитора фактора VIII (еще намного реже — фактора V).

При глубоком дефиците фактора XIII (очень редкая наследственная патология) все коагуляционные пробы нормальны, но сгустки растворяются в 5М или 7М мочевине.

Помогает дифференцировать дефицит различных факторов свертывания также и учет степени и, zvláště, сроков нормализации показаний тестов после внутривенного введения больным препаратов крови, T. to je. zaúčtování opravy žít podle metody L. 3. Všechno.

Tato technika je zvláště účinná, když existuje velký rozdíl v očekávané délce života diferencujících faktorů v oběhu. Tak, Poločas faktorů protrombinového komplexu se pohybuje od několika hodin (faktor VII) až několik dní (faktor II). Faktory X mezi nimi zaujímají mezilehlou pozici (2- 2,5 dne) a V (12— 18 hodin).

Поэтому после массивной струйной трансфузии плазмы протромбиновый индекс повышается при дефиците фактора VII очень кратковременно, при дефиците фактора V — несколько более длительно (примерно в 4—6 раз), а при дефиците факторов X и, zvláště, II на более продолжительный срок (свыше 1—2 суток). Показательно в этом отношении и влияние на протромбиновый индекс препарата ППСБ (концентрата факторов VII, IX, X a II). Он также кратковременно нормализует протромбиновое время при дефиците фактора VII и более длительно (во много раз!) при дефиците факторов X и II. Поскольку в этом препарате отсутствует фактор V, данный дефицит им не корригируется.

Аналогичное различие выявляется при трансфузионной и заместительной терапии факторов внутреннего механизма свертывания (XII, XI, IX и VIII), co zaznamená aktivovaný parciální tromboplastinový test.

Zvláštního zájmu je динамика коррекции уровня фактора VIII и показаний АПТВ при трансфузионной терапии гемофилии А и болезни Виллебранда. При первом из этих заболеваний выявляется немедленное максимальное улучшение свертываемости после трансфузии (sprej, rychlý!) антигемофильной плазмы или введения криопреципитата, а затем довольно быстрое (за 10—18 ч) неуклонное снижение ее, тогда как при болезни Виллебранда наблюдается некоторое нарастание свертывающей активности в течение нескольких часов после трансфузии, а затем ее снижение — намного более медленное, чем при. В связи с этим при лечении болезни Виллебранда более редко прибегают к заместительным трансфузиям, чем при гемофилии А.

Исследование функциональной активности факторов свертывания и компонентов калликреин-кининовой и фибринолитической систем с помощью хромогенных субстратов

Методы основаны на исследовании активности протеолитических ферментов и их ингибиторов, участвующих в свертывании крови, фибринолизе и образовании кининов, по интенсивности и скорости расщепления специфически чувствительных к этим ферментам пептидов, при деградации которых освобождается красящий агент (β-нитроанилин).

Степень окраски реагирующей смеси определяется спектрофотометрически, и по ее интенсивности судят об активности соответствующих ферментов (srážecí faktory, kallickreina, плазмина и др.), а по торможению процесса — об активности ингибиторов ферментов.

Tak, např, действие гепарина и антитромбина III может быть оценено по ослаблению расщепления хромогенных субстратов фактором Xa или тромбином, а активность α₂-антиплазмина — по ослаблению действия плазмина на соответствующий хромогенный субстрат. Хромогенные субстраты либо имеют цифровое обозначение (např, s-2222), либо именуются хромозинами с сокращенной приставкой, обозначающей тот фермент, к которому чувствителен этот субстрат (např, Chromozym PL — субстрат плазмина, Chromozym TH — субстрат тромбина, Chromozym PK — субстрат прекалликреина/калликреина и т. d.).

Хромогенные субстраты расширяют возможности исследования системы гемостаза, но пока недостаточно доступны для многих лабораторий. Nějaký výzkum, vyrobený s jejich pomocí, nemají žádné výhody oproti konvenčním koagulačním testům a poskytují výsledky, které se s nimi shodují; в других случаях их использование упрощает и ускоряет исследование, делает его более точным; V třetí - tyto techniky mají samostatný význam a nelze vyměnit koagulační testy (např, prekallikrein stanovení).

Imunologické stanovení složek hemostatického systému

Imunologické stanovení složek hemostatického systému, se provádí způsoby, které jsou:

• Immunoprecipitacii;
• Immunoelektroforeza;
• Radioimunotest a druhá se příslušných antisér

Zároveň se do látky v krevní plazmě antigenu na srážecí faktor (nebo jeho fragmenty), není funkční aktivita, которая может быть резко сниженной при нормальном содержании антигена в плазме. Такая ситуация характерна для всех тех случаев, когда в организме синтезируются аномальные (функционально неполноценные) faktory, сохраняющие свою антигенность, но лишенные способности участвовать в гемостазе.

Это позволяет разграничивать полное прекращение синтеза соответствующих факторов и образование их аномальных форм.

Řadu složek hemostatického systému lze však stanovit pouze imunologicky.

Tato skupina zahrnuje takové důležité studie, jako definování následujících komponent:

• β-тромбоглобулина;
• α2-макроглобулина;
• протеинов C и S;
• антигенов факторов VIII:C и VIII:R_cof;
• produkty fibrinolýzy (PDF);
• неоантигенов комплексов тромбин — антитромбин III и плазмин — антиплазмин;
• ряд других тестов.

Поэтому иммунологическое исследование существенно дополняет функциональную оценку разных звеньев системы гемостаза.

Diagnostické testy, основанные на использовании в качестве реагентов препаратов из змеиных ядов

Давно установлено, что яды многих змей содержат высокоактивные протеолитические ферменты, вызывающие свертывание крови и воздействующие на разные звенья коагуляционного каскада. Вследствие этого змеиные яды и выделенные из них коагулазы широко используются для распознавания нарушений гемостаза, количественного определения факторов свертывания, выявления и количественного определения растворимых фибрин-мономерных комплексов (RFMK) и ряда других исследований.

Testy s hadím jedem často velmi zjednodušují a zefektivňují diagnostiku poruch hemostázy..

В таблице приведены данные о механизме действия ядов на свертывающую систему крови и возможностях диагностического использования каждого из них.

Эти возможности еще более расширяются при одновременном использовании нескольких ядов и простейших общих коагуляционных тестов. Tak, např, одновременное применение коагуляционных проб с ядом гюрзы и эфы позволяет легко дифференцировать дефицит факторов VII, Х-V и II (в таблице ниже), а с дополнительной коррекцией профильтрованной нормальной плазмой (источник факторов V и II) —дефицит факторов X и V.

Определение основных физиологических антикоагулянтов

Наиболее важное значение имеет определение активности основного физиологического антикоагулянта — антитромбина III, снижение которой может быть генетически обусловленным (первичная тромбофилия) либо вторичным вследствие интенсивного потребления (DIC, массивные тромбозы) или ускоренного метаболизма (лечение гепарином, L-аспарагиназой, синтетическими контрацептивными средствами) и блокады иммунными комплексами, парапротеинами, фибронектином, белками острой фазы.

В любом случае снижение активности антитромбина III ниже 60—65 % поддерживает внутрисосудистое свертывание крови, делает менее выраженным антикоагулянтное действие гепарина. Вместе с тем очень часто между уровнем антитромбина III и снижением чувствительности к гепарину нет закономерного соответствия.

V tomto případě obvykle výrazně převažuje oslabení antikoagulačního účinku heparinu nad stupněm snížení aktivity antitrombinu III.. Prokázané, что при разных формах дефицита антитромбина III сродство его к гепарину может меняться в различной степени. Kromě, разные фракции гепарина, соотношение которых в лекарственных средствах весьма изменчиво, также имеют различное сродство к антитромбину III. Поэтому практически важно исследовать как собственно активность антитромбина III, так и его способность превращаться под влиянием гепарина в быстродействующий антикоагулянт.

Антикоагулянтная активность антитромбина III

Антикоагулянтная активность антитромбина III определяется по способности исследуемой плазмы крови (разведенной — метод Копли—Винтерштейна или дефибринированной тепловой денатурацией na 56 °С — методы Лолигера, Абильдгаарда и др.) инактивировать в течение определенного срока вводимый извне тромбин. Остаточная активность тромбина в такой плазме может определяться по ее свертывающей активности (на фибриногене, адсорбированной сульфатом бария плазме) либо по расщеплению хромогенного субстрата, чувствительного к тромбину или фактору Xa (поскольку антитромбин III инактивирует и этот фактор).

Гепарин-кофакторная активность

Гепарин-кофакторная активность содержащегося в плазме крови антитромбина III длительный период определялась с помощью теста толерантности плазмы к гепарину, который может считаться ориентировочным, поскольку дает очень большой разброс нормальных показателей и недостаточно воспроизводим.

Значительно более точны и воспро изводимы тесты, в которых исследуется влияние различных концентраций гепарина на тромбиновое время исследуемой плазмы, содержащей небольшое количество тромбоцитов. Сравнение проводится с удлинением тромбинового времени контрольной нормальной плазмы крови, к которой добавляются те же образцы гепарина.

Tak, в тромбин-гепариновом тесте к исследуемой плазме крови добавляются такие количества гепарина, которые в контроле удлиняют тромбиновое время с 15 до 32—35 с (малая концентрация) и до 95—110 с (vysoká koncentrace heparinu). Na základě těchto údajů se vypočítají indexy plazmatické aktivity antitrombinu. (AAP) a antikoagulační plazmatická rezerva (ARP).

Также широко используются сходные методики с оценкой степени инактивации тромбина как в коагуляционных тестах, так и на хромогенных субстратах.

Иммунологическое определение антигена антитромбина III

Иммунологическое определение антигена антитромбина III позволяет дифференцировать различные виды тромбофилии:

• с недостаточным синтезом антитромбина III (уровень антигенного маркера снижен адекватно снижению активности);
• с сохраненным синтезом аномальных и функционально неполноценных его форм (уровень антигенного маркера намного выше, чем активность).

Протеины C и S, тромбомодулин и α₂-макроглобулин определяются иммуноэнзиматическими методами.