โรคโลหิตจาง, เนื่องจากกิจกรรมของกลูโคส-6-ฟอสเฟตพร่อง

การกิจกรรมสะสม glukozo-6-fosfatdegidrogenaza (G-6-PD) มีความผิดปกติทางพันธุกรรมที่พบมากที่สุดของเซลล์เม็ดเลือดแดง, สาเหตุ haemolytic krizam, เกี่ยวข้องกับการซื้อของจำนวนยา วิธี. Вне кризов у большинства больных наблюдается состояние полной компенсации, хотя у отдельных лиц имеет место постоянная гемолитическая анемия.

Первое описание дефицита активности Г-6-ФД было сделано в 1956 ก.. ในคน, принимавших с профилактической целью противомалярийный препарат примахин. Независимо от этих исследований в 1957 ก.. Был обнаружен дефицит Г-6-ФД в эритроцитах больного, у которого периодически наблюдались гемолитические кризы без приема каких-либо лекарственных средств.

В настоящее время описано более 250 различных мутантных форм Г-6-ФД. Они отличаются друг от друга по электрофоретической подвижности фермента, его сродству к субстратам — глюкозо-6-фосфату и никотинамидадениндинуклеотидфосфату (НАДф) Следствием пониженного сродства является недостаточная активность фермента в условиях, когда концентрация субстратов строго лимитируется скоростью их образования в предшествующих реакциях. Отсутствие активности не означает в большинстве случаев выпадения фермента как такового хотя могут наблюдаться и такие случаи. Чаще всего отсутствие или снижение активности фермента — результат наличия его у больного в патологической малоактивной форме.

Структурный ген и ген-регулятор, обусловливающие синтез Г-6-ФД, располагаются на X-хромосоме, поэтому наследование дефицита активности этого фермента в эритроцитах всегда сцеплено с X-хромосомой.

Существуют две основные мутантные формы, в которых замещения аминокислот не касаются активных центров, и поэтому обе эти широко распространенные мутации являются нормальными. Они отличаются друг от друга электрофоретической подвижностью, однако сродство к субстрату у них одинаково. По современной номенклатуре, одна из этих форм, распространенная в Европе, называется формой BB, และอื่น ๆ ที่, наблюдающаяся в Африке — формой A. В настоящее время описаны и другие мутантные формы, которые также не отличаются друг от друга по кинематическим показателям, но имеют различную электрофоретическую подвижность.

Сцепленность фермента с полом дает значительное преобладание мужчин среди лиц с клиническими проявлениями патологии. Она наблюдается у гомозиготных мужчин, унаследовавших данную патологию от матери с ее X-хромосомой, у гомозиготных женщин (унаследовавших болезнь от обоих родителей) и у части гетерозиготных женщин, наследовавших заболевание от одного из родителей с выраженным мутантным фенотипом.

Наиболее часто дефицит активности Г-6-ФД встречается в странах Европы, находящихся на побережье Средиземного моря, Греции, อิตาลี, а также в некоторых странах Латинской Америки, Африки и др.

อาจจะ, что чрезвычайно высокому накоплению аномального гена в ряде населенных пунктов способствует сохранившийся обычай родственных браков, что приводит к накоплению в популяции гомозиготных женщин, дающих тяжелые клинические проявления болезни чаще, чем гетерозиготные носители, и увеличивающих вероятность рождения гомозиготных мужчин, а также широкое распространение в прошлом в этих местах тропической малярии.

Согласно существующей гипотезе, คน, имеющие дефицит Г-6-ФД, легче переносят тропическую малярию и реже погибают от этого заболевания. В пользу данной гипотезы говорит факт неодинакового распространения паразита среди эритроцитов гетерозиготной женщины. มันถูกพบแล้ว, что в нормальных клетках содержится намного большее количество паразита, чем в дефицитных. Имеется два предположительных объяснения этого факта. Первое из них: эритроцит с дефицитом Г-6-ФД не в состоянии противостоять воздействию паразита и сразу распадается в системе фагоцитирующих макрофагов, где и погибает плазмодий. Другая точка зрения предполагает необходмость для развития паразита восстановленного глутатиона, количество которого снижается в эритроцитах с дефицитом Г-6-ФД.

สาเหตุการเกิดโรคและ

Первый этап воздействия лекарственного средства — его превращение в организме, переход в активную форму, которая может вызвать изменения в структуре мембраны эритроцита. Активная форма лекарственных средств вступает во взаимодействие с оксигемоглобином. При этом образуется некоторое количество перекиси водорода.

Восстановленный глутатион с помощью системы пероксидазы обезвреживает какую-то часть перекиси, в процессе реакции восстановленный глутатион окисляется.

У здоровых людей острый гемолитический криз развивается при введении значительного количества лекарственного средства (токсическая доза). Криз может возникнуть тогда, когда системы восстановления глутатиона не в состоянии справиться с избытком образовавшихся комплексов и окисленного глутатиона. При дефиците активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и нарушенном восстановлении НАДФ, несмотря на нормальную активность редуктазы глутатиона, нарушено его восстановление, так как отсутствует нормальный источник водорода. Восстановленный глутатион не может противостоять окислительному действию обычных лечебных доз лекарственных средств. Это приводит к окислению гемоглобина, потере гема из молекулы гемоглобина, выпадению в осадок цепей глобина. Селезенка освобождает эритроциты от телец Гейнца. При этом теряется часть поверхности эритроцитов, что приводит к их гибели.

В патогенезе гемолитической анемии, связанной с употреблением в пищу конских бобов, еще много неясного. Примахиновая анемия (фавизм) развивается лишь у некоторых лиц с дефицитом активности Г-6-ФД. อาจ, для проявления этой анемии требуется сочетание двух ферментативных дефектов. อาจจะ, что речь идет о недостаточном обезвреживании у некоторых лиц токсического вещества, содержащегося в конских бобах, или об образовании какого-то метаболита, вызывающего нарушения в сульфгидрильных группах эритроцитов. У здоровых лиц прием небольшого количества конских бобов не вызывает выраженной гемолитической анемии, так как при наличии восстановленного глутатиона эритроциты в состоянии противодействовать токсическому эффекту метаболита. Наследование этого дефицита, เด่นชัด, аутосомное доминантное. При сочетании необычного превращения в организме токсического вещества, содержащегося в конских бобах, с дефицитом активности Г-6-ФД проявляются клинические признаки примахиновой анемии.

อาการทางคลินิก

Эксперты ВОЗ подразделяют варианты Г-6-ФД в соответствии с клиническими проявлениями у гомозиготных больных и уровнем активности в эритроцитах на четыре класса.

Первый класс — варианты, которые сопровождаются хронической гемолитической анемией.

Второй класс — варианты с уровнем активности Г-6-ФД в эритроцитах 0— 10 % จากบรรทัดฐาน, носительство которых обусловливает отсутствие гемолитической анемии вне криза, и кризы, связанные с приемом лекарственных средств или употреблением конских бобов.

Третий класс — варианты с уровнем активности в эритроцитах 10—60 % จากบรรทัดฐาน, при которых могут наблюдаться легкие клинические проявления, связанные с приемом лекарственных средств.

Четвертый класс — варианты с нормальным или близким к норме уровнем активности, не сопровождающиеся клинической патологией.

При рождении ребенка наблюдается гемолитическая анемия, относящаяся как к первому, так и ко второму классу дефицита Г-6-ФД.

Уровень активности Г-6-ФД в эритроцитах не всегда коррелирует с тяжестью клинических проявлений. При многих вариантах первого класса определяется 20—30 % уровень активности фермента. ในทางกลับกัน, при нулевом уровне активности у некоторых больных не наблюдается никакой клинической симптоматики. Это связано, ในตอนแรก, со свойствами лутантных ферментов, ในประการที่สอง, ส่วนใหญ่มีแนวโน้ม, со скоростью обезвреживания лекарственных средств цитохромным аппаратом печени больного.

Наиболее часто дефицит активности Г-6-ФД не дает клинических проявлений без специальной провокации гемолитического криза. В большинстве случаев гемолитический криз начинается после приема сульфаниламидных препаратов (норсульфазола, стрептоцида, сульфадиметоксина, сульфацил-натрия, этазола, бисептола), противомалярийных средств (примахина, xinina, акрихина), нитрофурановых препаратов (furazolidona, furadonina, фурагина, 5-НОК, невиграмона), препаратов изоникотиновой кислоты (тубазида, фтивазида), ПАСК-натрия, а также нитроглицерина.

Из противомалярийных препаратов при дефиците активности Г-6-ФД может быть назначен делагил, из сульфаниламидных — фталазол. Ряд препаратов, вызывающих в больших дозах гемолитические кризы, в малых дозах может быть использован при дефиците активности Г-6-ФД. К ним относятся ацетилсалициловая кислота, amidopirin, фенацитин, levomicetin, streptomycin, противодиабетические сульфаниламидные препараты.

Все лекарственные средства, способные вызывать гемолитические кризы, катализируют окислительную денатурацию гемоглобина молекулярным кислородом.

Клинические проявления заболевания могут возникать на вторые-третьи сутки от начала приема лекарственных средств. Вначале появляются легкая желтушность склер, ปัสสาวะสีเข้ม. При прекращении приема препарата в этот период тяжелый гемолитический криз не развивается. Если лечение продолжается, на 4—5-е сутки может возникнуть гемолитический криз с выделением мочи черного или иногда бурого цвета, что связано с внутрисосудистым распадом эритроцитов. Содержание гемоглобина может снизиться на 2—3 %.

При тяжелом течении заболевания повышается температура тела, появляются резкая головная боль, อาการปวดขา, อาเจียน, иногда — понос. Возникает одышка, снижается артериальное давление. Часто увеличивается селезенка, иногда — печень.

В редких случаях развивается недостаточность почек, связанная с резким снижением почечной фильтраций и закупоркой почечных канальцев кровяными сгустками.

ผลการวิจัยในห้องปฏิบัติการ

При исследовании крови выявляется анемия с повышением количества ретикулоцитов. Наблюдается увеличение числа лейкоцитов со сдвигом до миелоцитов. ในผู้ป่วยบางราย, โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเด็ก, количество лейкоцитов иногда может повыситься до значительных цифр (100 T ใน 1 ลิตรและอื่น ๆ). Число тромбоцитов не изменяется. При окраске эритроцитов кристаллическим фиолетовым в период тяжелых гемолитических кризов обнаруживается большое количество телец Гейнца.

Выявляется резкое раздражение красного ростка костного мозга. Повышается содержание свободного гемоглобина сыворотки, часто повышен уровень билирубина за счет непрямого. С помощью бензидиновой пробы выявляется присутствие в моче гемоглобина без эритроцитов, иногда обнаруживается гемосидерин.

При некоторых формах недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы наблюдается самоограничение гемолиза, เสื้อ. มันคือ. гемолитический криз обрывается, แม้จะมี, что больной продолжает принимать лекарственное средство, которое вызвало гемолитический криз. Способность к самоограничению гемолиза обусловлена повышением почти до нормальных цифр уровня активности фермента в ретикулоцитах. При большинстве форм он значительно снижен.

У детей тяжелые гемолитические кризы наблюдаются чаще, กว่าในผู้ใหญ่. При выраженном дефиците активности Г-6-ФД они возникают иногда сразу после рождения. Это гемолитическая болезнь новорожденных, не связанная с иммунологическим конфликтом. Она может протекать так же тяжело, как и гемолитическая анемия, обусловленная резуснесовместимостью матери и плода. Возможно наличие ядерной желтухи с тяжелейшей неврологической симптоматикой.

Патогенез этих кризов изучен недостаточно. Пока не выяснено, наступают ли эти кризы спонтанно в связи с физиологической недостаточностью активности фермента пероксидазы глутатиона при рождении или причиной их является употребление определенных антисептических средств при обработке пуповины ребенка. อาจจะ, что иногда кризы связаны с приемом матерью некоторых лекарственных средств.

ในบางกรณี гемолитические кризы при дефиците активности Г-6-ФД возникают на фоне инфекционных заболеваний: ไข้หวัดใหญ่, сальмонеллеза, вирусного гепатита. Кризы могут быть спровоцированы также ацидозом при сахарном диабете или недостаточности почек.

У небольшой части больных с дефицитом активности Г-6-ФД наблюдается постоянная гемолитическая анемия, ที่เกี่ยวข้องกับยา. В этих случаях отмечаются небольшое увеличение селезенки, умеренная нормохромная анемия с повышением содержания ретикулоцитов, эритрокариоцитов в костном мозге и уровня билирубина. Обострение заболевания возможно либо после приема указанных выше лекарственных средств, либо на фоне инфекций.

การวินิจฉัย

Основой для диагностики этой недостаточности ферментом эритроцитов является определение активности Г-6-ФД у пробанда и его родственников. Из качественных методов, применяемых для этой цели, следует рекомендовать два наиболее простых метода.

วิธี Bernstein дает возможность не только диагностировать дефицит активности Г-6-ФД у всех гемизиготных мужчин, гомозиготных женщин, но и приблизительно оценивать степень дефицита этого фермента у гетерозиготных женщин. Этим методом удается выявить около 50 % гетерозиготных женщин. Преимуществом этого метода является пригодность его для использования при массовом обследовании населения в экспедиционных условиях.

Метод основан на обесцвечивании красителя 2,6-дихлорфенолиндофенол а при его восстановлении. В присутствии Г-6-ФД происходит окисление глюкозо-6 фосфата и восстановление НАДФ с образованием НАДФ-Н. Это вещество восстанавливает феназинметасульфат, которой в свою очередь восстанавливает 2,6-дихлорфенолиндофенол. Феназинметасульфат действует в этой реакции как очень активный переносчик электронов от НАДФ-Н к красителю. Без феназинметасульфата реакция идет несколько часов, а в присутствии феназинметасульфата обесцвечивание происходит за 15— 30 ม..

รีเอเจนต์.

1. Раствор НАДФ: 23 мг НАДФ растворяют в 10 ml ของน้ำ.
2. Раствор глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф): 152 мг натриевой соли глюкозо-6-фосфата растворяют в 10 ml ของน้ำ. Бариевая соль глюкозо-6-фосфата должна быть предварительно переведена в натриевую соль. Для этого взвешивают 265 мг бариевой соли глюкозо-6-фосфата, ละลายใน 5 ml ของน้ำ, เพิ่ม 0,5 มล. 0,01 М раствора соляной кислоты и 1 мг сухого сульфата натрия. Осадок центрифугируют. Надосадочный слой нейтрализуют 0,01 М раствором едкого натра и доводят дистиллированной водой до 10 มล..
3. Раствор феназинметасульфата: 2 мг феназинметасульфата растворяют в 100 мл трис-буфера 0,74 M; พีเอช 8,0.
4. Раствор красителя 2,6-дихлорфенолиндофенола (натриевой соли): 14,5 мг красителя растворяют в 100 мл буферного раствора трис-соляной кислоты (0,74 M; พีเอช 8,0). Буферный раствор готовят из 1,48 М раствора трис-гидроксиметиламинометана (42,27 d ของ 250 ml ของน้ำ) และ 1,43 วิธีการแก้ปัญหา M ของกรดไฮโดรคลอ (2 ампулы фиксанала, ประกอบด้วย 0,1 г-экв, доводят водой до 135 มล.). K 230 мл раствора трис-гидроксиметиламинометала добавляют 110 มล. ของกรดไฮโดรคลอ, доводят рН до 8,0 и добавляют воду до 460 มล..

Перед применением готовят смесь реактивов: 1 ไม่. раствора НАДФ (1), 1 ไม่. раствора Г-6-Ф (2), 2 ไม่. раствора феназинметасульфата (3) และ 16 ไม่. раствора 2,6-дихлорфенолинодофенола (4).

วิธี.

В пробирку, ประกอบด้วย 1 มล. น้ำกลั่น, มีส่วนร่วม 0,02 มิลลิลิตรของเลือด.

После наступления гемолиза добавляют 0,5 мл смеси реактивов. Результаты учитывают через 30 ม.. Реакцию расценивают как нормальную при полном обесцвечивании красителя. สถานที่, когда обесцвечивание красителя не происходит (остается интенсивно сине-зеленый I цвет), реакцию оценивают как резко-положительную. Если интенсивность окраски уменьшается, но сине-зеленый цвет остается, реакцию считают поло-жительной. สถานที่, когда происходит явное обесцвечивание, но при сравнении с контролем остается зеленоватый оттенок, реакцию расценивают как плюс-минусовую.

Резкоположительные и положительные реакции наблюдаются у гемизиготных мужчин и гомозиготных женщин. Иногда гетерозиготные женщины дают положительную реакцию, но чаще плюс-минусовую. นอกเหนือจาก, плюс-минусовая реакция иногда наблюдается у совершенно здоровых людей при некотором снижении активности фермента на фоне заболевания или приема лекарственных средств. Плюс-минусовые реакции следует принимать во внимание и проверять активность фермента количественным методом лишь при подозрении на наличие у женщины гемолитической анемии, обусловленной дефицитом активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Не следует принимать во внимание плюс-минусовые реакции при массовом обследовани.

Ошибочная положительная реакция может быть у лиц с выраженной анемией в связи с тем, อะไร 0,02 มิลลิลิตรของเลือด, внесенной в пробирку, содержат малое количество эритроцитов и, ดังนั้น, малое количество фермента. В этом случае в пробирку с дистиллированной водой следует добавить две или три пипетки (โดย 0,02 มล.) เลือด, чтобы по цвету эти пробирки до прибавления красителя не отличались от контрольных.

Метод флюоресцирующих пятен Beutler и Mitchell основан на специфической флюоресценции восстановленного НАДФ в длинноволновом ультрафиолетовом свете (440- 470 นาโนเมตร), оцениваемой визуально в фиксированные сроки.

รีเอเจนต์.

1. Трис-HCl буфер 0,5 M; พีเอช 8,0: 60,55 триса растворяют в 800 มล. น้ำกลั่น, เพิ่ม 20 мл концентрированной HCl, доводят pH до 8,0 с помощью 2 М раствора HCl и доливают водой до 1 มล.; раствор хранят до 36 суток при температуре 4°С.
2. Раствор глюкозо-6-фосфата 20 M: 6 мг динатриевой соли глюкозо-6-фосфата растворяют в 1 มล. น้ำกลั่น; хранят до 2 суток при температуре 4°С.
3. Раствор НАДФ 10 M: 8 мг НАДФ растворяют в 1 มล. น้ำกลั่น; хранят до 10 суток при температуре 4 ° C.
4. Водный раствор сапонина 1 % хранят до 20 суток при температуре 4 ° C.
5. Раствор окисленного глутатиона (10 มล.): 2,4 мг глутатиона растворяют в 1 มล. น้ำกลั่น; хранят до 10 суток при температуре 4°С.

วิธี.

Перед определением готовят инкубационную смесь, смешивая 1 ไม่. раствора глюкозо-6-фосфата, 1 ไม่. раствора НАД-Ф, 2 ไม่. раствора сапонина, 5 ไม่. буфера и 1 ไม่. раствора глутатиона. เลือด (0,01 มล.) вносят в пробирки или ячейки гемагглютинационной доски и добавляют 0,2 мл инкубационной смеси. ตลอด 15 мин микропипеткой отбирают одну каплю инкубационной смеси (0,02 มล.) из каждой пробы и наносят их на хроматографическую бумагу в виде пятна диаметром 10—12 мм. Пятна высушивают на воздухе при комнатной температуре и просматривают в ультрафиолетовом свете для оценки флюоресценции. Контролем являются образцы с заведомо нормальной кровью. Контроль на качество реактивов не содержит крови.

การประเมินผลการ.

Отсутствие флюоресценции соответствует отсутствию активности, наличие флюоресценции (интенсивное голубое свечение) — наличию активности, а слабое свечение — промежуточной реакции. При соблюдении условий эксперимента метод не дает ложноотрицательных результатов. Источником ложноположительного диагноза может быть выраженная анемия у обследованного, но в гораздо меньшей степени, чем для метода Berstein. Даже при выраженной анемии наблюдается промежуточная реакция, а не отсутствие флюоресценции.

Использование количественного метода определения активности Г-6-ФД дает возможность выявлять снижение активности не только у гемизиготных и гомозиготных больных, но и у женщин-гетерозигот. เพราะ, что количество ретикулоцитов и цветовой показатель влияют на уровень активности фермента, рекомендуется вносить поправку результатов с учетом этих показателей.