Cytokemisk studie ejakulat

Cytokemisk reaktion, genomförts med ejakulera, ger insikter i den kemiska sammansättningen och funktionell aktivitet av dess celler.

Bestämning av surt fosfatasaktivitet ejakulat

Surt fosfatasaktivitet ejakulerar många gånger större än dess aktivitet i blodet. Syrafosfatas är en del av prostatasekret, sin produktion stimuleras av manliga gonadotropin. Använda cytokemiska reaktioner det detekteras i spermier och andra celler i ejakulat. Aktivitet bestäms av dess Förfarande Goldberg - Barka.

Reagens.

1. Formalin alkohol (en del av den färdiga 40 % formalin löst i nio delar 96% etylalkohol).

2. Pararozanilin: 1 g basisk fuchsin för Phuc- sinosernistoy syra löstes under upphettning i 25 ml 2 IN saltsyra; kyldes, filtrerades och lagrades i ett kylskåp. Reagens resistent.

3. En vattenhaltig lösning av natriumnitrat 4 %. 4. En lösning av metyl-grönt för acetatbuffert 2 % (pH - 5). Den resulterande lösningen tvättades med kloroform, blandades därefter i ungefär lika mängder av kloroform och 2 % metyl gröna lösningen. Tumlas under dagen, och sedan målade i lila färg, tillsattes kloroform avlägsnades med en separationstratt.

5. Inkubatsionnaya miljö, bestående av två komponenter.

• En komponent: 20 mg naftol-A5-fosfat löstes i 0,5 (0,3) ml dimetylformamid, lägga till 40 ml 0,1 N lösning av natriumacetat och filtrerades genom filterpapper; förbereder en studiedag.
• B-komponent: 8 droppar 4 % natriumnitratlösning blandades med 8 droppar pararozanilina; är ex tempore. För erhållande av båda komponenterna i inkubationsmediet är ansluten (pH 5,2-5,4). Om det behövs, korrigera pH 50 % ättiksyra, en lösning av kaustik alkali.

Metod. Färsk ejakulat centrifugeras, när ett stort antal spermier dispensecentrifugering. Från sediment förbereda polerad glas tunna streck, att, samt blodutstryk, lufttorkades. De torkade smetas fast genom nedsänkning dem i en bägare med formalin alkohol 30 från (inte mer) och tvättades med destillerat vatten. Därefter utstryk är nedsänkta i en bägare med inkubationsmediet och placerades i en inkubator vid en temperatur 37 ° C 2 Nej. Därefter tillsattes de sköljdes i destillerat vatten, nedsänktes under 10 min i ett glas med en lösning av metyl-grönt (motfärgades för kärnor), snabbt tvättas bort med vatten, torkades med filterpapper och undersöktes genom nedsänkning mikroskopsystem.

Surt fosfatas-aktivitet kan uttryckas med den genomsnittliga cytokemisk faktor (SCK) av polukolychestvennomu metod Astaldi-Verga. Enligt formeln

SCK =(3*a 2 * b a * 1)/100

där siffrorna i täljaren indikerar färgintensiteten (max - 3, måttlig - 2, fotspår - 1), och bokstäverna - av den procentandel av cellerna räknades en viss färgintensitet; figur 100 i nämnaren - det totala antalet celler räknade.

Till Exempel, räknade 100 cellen, därav med en maximal färgintensitet 20 cellen, måttlig - 20 och med följande - 60 cellen. Här:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6

Spermiema surt fosfatas som ligger i enheten foderbitarna röd-orange i den övre delen av huvudet.

Upptagen kromatin delen av huvudet är grön och innehåller inte surt fosfatas.

En mer diffus blek färg på surt fosfatas detekteras runt den nedre delen av huvudet, och ibland är det sträcker sig till halsen av spermier. USA cytokemisk koefficient surt fosfatas i normala spermier ejakulat är 2,0-2,4.

I cytoplasman hos celler av spermatogenes avslöjade ackumulering av granuler, ljust målade i ett visst (röd-orange) färg. I de stödjande cellerna i veckade sädeskanalerna, ofta kraftigt positivt färgades för syrafosfatas, genomskinligt ofärgat huvud (xromatin) sperma. Histiocyter och makrofager innehåller några granuler, positivt färgas för surt fosfatas. I enstaka lymfocyter, och ibland neutrofiler är individuella pellets, med en aktivitet av surt fosfatas.

Bestämning av succinat dehydrogenasaktivitet (SDG) i ejakulatet

Sukcinatdegidrogenaza - Enzym, som deltar i redox-reaktioner, som finns i celler i ett betydande antal ejakulat. Emellertid, beskaffenheten av förändringen av dess aktivitet i olika patologiska processer är fortfarande inte klarlagd. Succinatdehydrogenas aktivitet i celler bestämmes genom en modifierad metod av Nartsissova.

Reagens.

1. Aceton-Trilon (aceton - 60 ml, distillirovannaya vatten - 40 ml, Trilon B - 250 mg).

2. En lösning av metyl-grönt 2 % (samma färgämne, vilken används för surt fosfatas).

3. Inkubatsionnaya miljö, består av följande komponenter:

och) fosfatbuffert (pH 7,2-7,4) - 10 ml;

till) 5,4 % lösning av natriumsuccinat - 10 ml;

i) complexone III (13 mg utspätt i 5 ml destillerat vatten);

g) destillerat vatten - 5 ml;

d) nitrotetrazolium lila (10 mg utspätt i 10 ml vatten).

Alla komponenter blandas i ett paket och lagrades i ett kylskåp. Beredd mediet kan återanvändas - för 10 dagar eller mer.

Metod. Utstryk, framställd från ejakulatet, fixerades i aceton under Trilon- 30 från, tvättades med destillerat vatten och torkades i luft. Därefter utstryk är nedsänkta i inkubationsmediet och placerades i en inkubator vid en temperatur 37 ° C 1 Nej, varefter de tvättas med destillerat vatten och dokrashivayut metylgrönt för 10 m. Då igen snabbt tvättas med vatten, torkades med filterpapper och undersöktes genom nedsänkning mikroskopsystem.

Normala spermier har hög aktivitet av succinatdehydrogenas, representeras av stora blå-lila granulat, att, sammanslagningen, bilda en tät massa, fyllning hals spermier, vissa spermier enskilda pellets finns runt huvudet.

Beräkna sammansmälta granuler är inte möjligt, Därför, för att bestämma aktiviteten hos succinatdehydrogenas färgade delen spermier mäts i mikrometer. Utmed längden av den målade specifikt för succinatdehydrogenas av spermierna bedöms på graden av aktivitet hos enzymet i spermier. Med okulär mikrometer och objekt mikrometer längd mäts i specifik färgade delen 100 spermatozoidax. Lägga längd räknat i färgade sektioner av spermier, och dividera med 100, erhålla en genomsnittlig längd, uttrycka suktsinatdegidrogenaznuyu aktivitet för en enda spermie. Normalt är det 4,3 ± 0,7 m. Denna beräkning LDH-aktivitet är den mest informativa och rekommenderas därför att använda för forskningsändamål.

För en bred tillämpning i praktiken, är denna metod ganska komplicerat, är föredraget att uttrycka mängden av succinatdehydrogenas Astaldi-metoden Verga. USA cytokemisk koefficient LDH av spermier i ejakulatet är normalt 2,7 ± 0,3.

I cellerna av spermatogenes LDH-aktiviteten detekteras i form av kluster av stora blå-violett granulat, ofta samman i stora klumpar, belägna i olika områden i cytoplasman. USA cytokemisk faktor i cellerna i spermatogenes når 2,0. Med mognaden av celler i ejakulatet och ökar aktiviteten hos LDH i mogna spermier överstiger 2,0. I cytoplasman hos vissa lymfocyter funna kibble SDG.

Bestämning av peroxidasaktiviteten i ejakulatet

Spermierna, spermatogenes celler och stödjande celler av invecklade sädeskanalerna peroxidas saknas.

Den neutrofila granulocyter ejakulat peroxidas aktivitet uttrycks i betydande utsträckning och kan variera beroende på naturen hos den patologiska processen, liksom i perifert blod. Nivån av peroxidasaktiviteten i neutrofiler är viktigt att bedöma deras funktionella status och verksamhet av den inflammatoriska processen i de manliga könsorganen. Utstryksprover av sperma Graham-Knoll och redovisning aktiviteten hos enzymet av Astaldi-Verga är analoga blodutstryk.

Peroxidas-aktivitet i cellerna i ejakulatet bestäms av metod för Graham-Knoll.

Reagens.

1. Formalin alkohol (samma, och att syrafosfatas).

2. Peroksidaznыy reagens: ʙenzidin (på spetsen av en skalpell) löst i 6 ml 96 % etylalkohol, lägga till 4 ml destillerat vatten 0,02 ml 3 % väteperoxid. Reagens som kan användas för 5-6 dagar.

3. Romanovsky Dye vid en utspädning av 1-2 droppar på 1 ml destillerat vatten.

Metod. Färsk sperma smutsfläckar har fastställts för 30 formalin med alkohol, tvättades med rinnande vatten och torkades. Häll sedan stroke peroxidas reagens för 5-7 minuter, tvättades noggrant i rinnande vatten och torkades. Efter att de dokrashivayut 15 20 min färgämne Romanovsky, tvättades med rinnande vatten, torkades och mikroskopiruyut använda nedsänkning mikroskopsystem.

När ett positivt svar på peroxidas i neutrofila granulocyter avslöjar stora gyllenbruna granulat i ett stort antal. Med ett stort antal vita blodkroppar som behövs för att beräkna Genomsnittlig cytokemisk faktor (SCK). Den cytoplasma histiocyter enskilda peroxidas är närvarande som små kluster såsom granuler.

Bestämning av glykogen i ejakulatet

Förändringar i glykogeninnehåll i olika celler påverkar deras funktion eller tecken på utveckling av patologiska process. Bestämning av glykogen i cellerna genomföres av McManus.

Reagens.

1. En vattenlösning av perjodsyra 1 % (förbereder sig för att använda).

2. Sernistaya vatten: 5 ml 10 % kalium- eller natriummetabisulfit, 5 ml 1 IN saltsyra, vatten till 100 ml (förbereder sig för att använda).

3. Reagens Shiffa: 1 g basisk fuchsin för fuksinosernistoy syra, förväg krossats i en porslinsmortel, löses under konstant skakning för 5 min 200 ml kokande destillerat vatten, passera genom ett pappersfilter och sattes under kylning till 50 ° C 20 ml 1 IN saltsyra, och vid kylning till 25 ° C - 1 g kalium- eller natriummetabisulfit. Den beredda reagens förvaras i kylskåp för 24 h varefter han upplyst och blir olämpliga för konsumtion vitsya

4.Den vattenhaltiga lösningen av metylgrönt 2 %, tvättades med kloroform

5.Kemiskt ren metylalkohol.

Metod.

Tunna orkade smetar utlösning fast kemiskt ren metylalkohol för 3 m, sköljdes med destillerat vatten och nedsänkt i en bägare med 1 % vattenhaltig jodsyra 5 m. Därefter utstryk tvättades med destillerat vatten, torkades, svavel sköljs i vatten igen och torkades.

Ytterligare kompresser doppas i en kopp med Schiffs reagens till 15 m, Skölj dem i tre omgångar på svavelhaltiga vatten (av 3 min vardera), tvättades 10 min i vatten och cellkärnor dokrashivayut 3 min metylgrönt. Då igen sköljdes med vatten kompresser, filterpapper och torkades mikroskopiruyut använder nedsänkning systemet mikroskop.

I mogna spermier glykogen saknas. I cytoplasman hos den unga spermier, särskilt med "krage", avslöjade spår av glykogen (±), ibland i form av individuella pelletar i den övre delen av huvudet eller i "kragen".

I cellerna av spermatogenes Glykogen återfinns i stora mängder i form av ett körsbärsröda granulat, fyller hela cytoplasman. Med mognaden av celler förlorar glykogen till hans försvinnande i mogna spermier. Spermatocitы glykogen innehåller inte endast i cytoplasman, utan även i kärnan. I de stödjande cellerna i invecklade sädeskanalerna, är glykogen ett körsbärsröda granulat och diffus. Mogna neutrofila granulocyter i ejakulatet, liksom i perifera blodutstryk, innehålla en betydande mängd glykogen. Vid kronisk prostatit i neutrofila granulocyter ejakulat ökar betydligt mängden glykogen och ökar aktiviteten av peroxidas. I enstaka lymfocyter ibland hittas i normala glykogen granulat.

Makrofager innehålla spår av glykogen Bakgrund sperma utstryk färgade i körsbärsröd färg, vilket indikerar närvaron i plasma hos ejakulatet stora mängder glykosaminoglykaner (mukopolisaxaridov).

Definition av ribonukleinsyra (RNA) i ejakulatet

Förhöjda nivåer av RNA i celler Den visar hög aktivitet mot deras tillväxt, sekretornoй, syntetiska och andra aktiviteter. Minskning av mängden RNA i unga celler ofta förknippas med minskad förmåga hos dessa celler att regenerera. RNA-halt i cellerna bestämmes metoden enligt Chicken Coop.

Reagens.

1. Reagens hönshuset: ställdes separat 2 % metylgrönt lösningar och pyronine, metyl gröna lösningen tvättades noggrant med kloroform; färgämne arbetslösning framställs genom att blanda 2 % lösning pyronine (12,5 ml) och 2 % metyl gröna lösningen (7,5 ml) med tillsats 30 ml destillerat vatten. Färgämnet beständiga, förvaras i kylskåp.

2. Lås - kemiskt ren metylalkohol.

Metod. Utstryk fixeras med metanol för 3 m, färgämne arbetslösning pyronine-metylgrönt 15 m, snabbt sköljdes med vatten och torkades med filterpapper. Mikroskopiruyut använder nedsänkning mikroskopsystem. RNA pyronine målade i klarröd färg, cellkärnor - metyl grön grön.

Äldre spermier inte innehåller RNA. Cellerna är rika på RNA spermatogenes, vilket minskar antalet celler som de mognar. I spermatohonyy Cytoplasma rika rosa färg, i spermatotsytov vad fädning, och i spermatider ljusrosa. I unga spermier "krage" rosa målade främst "krage".

Spermier, beläget i det sista skedet av sin utveckling, i de stödjande cellerna i invecklade sädeskanalerna förlora resterna av en rosa ämne (RNA) och bli mogna spermier.

I cellerna hos spermatogenes innehåller en stor mängd av glykogen, RNA betydligt uttryckt LDH-aktivitet och CF. Men, vanligen, dessa isolerade celler i ejakulatet, därför räkna CBFV opraktisk. I sådana fall begränsas till den berättande form av ingående.

Cytokemisk karakterisering av leukocyter Det är en viktig indikator på deras funktionella aktivitet. Räkning av antalet leukocyter i ejakulatet ämnet transporteras i samma, Som i andra celler i ejakulatet och perifert blod.

I utstryk färgade med de vanliga metoderna för ejakulat (azurozinovymi blandningar, Hematoxylin-eosin och andra.), liksom inhemska preparat är inte alltid lätt att skilja leukocyter, celler av spermatogenes, prostatisk epitel, histiocyter och andra element.

Cytokemisk tekniker i samband med morfologiska hjälper ofta upprätta ett slags celler. Så, uttryckt peroxidasaktivitet, som stora guldbruna pärlor, fyller hela cellcytoplasman, karakteristiska för mogna neutrofiler, i andra celler sådan reaktion observeras. Allvarlig reaktion på glykogen är typiskt för neutrofiler och celler av spermatogenes, men dessa inte har peroxidasaktivitet. RNA som finns i cellerna och spermatogenes inga mogna granulocyter. Cellerna i spermatogenes har uttalad reaktion på syrafosfatas, och neutrofila granulocyter, uttryckte hon mycket dåligt, och så vidare. d.