Studie av blodplatehemostase

Brudd på denne lenken av hemostase kan fortsette med en tendens til blødninger eller trombose, avhengig av hvilke forskningsmetoder som velges. Foruten, alle metoder for forskning på blodplater hemostase er delt inn i hoved og tillegg, eller andre linjetester, som bare gjelder hvis, hvis testene avdekker brudd. Til det viktigste (grunnleggende) testene nedenfor gjelder.

Motstandstester (skjørhet) kapillærer - mansjett, hermetisert, angioresistometri

Av disse testene, den mest tilgjengelige og samtidig ganske informativ test Konchalovsky-Rumpel-Leede.

Vurderingen er basert på antall og størrelse på blødninger, dannet på den øvre delen av palmarflaten på underarmen (i en sirkeldiameter 5 cm) etter 5 minutter med å klemme på skulderen med en mansjett ved et trykk på 12-13,3 kPa (90-100 mm Hg. Art.). Resultatene registreres gjennom 5 min etter at mansjetten er fjernet. Antall petekkier er mer enn 10 indikerer økt skjørhet av mikrokar, som ofte er assosiert med trombocytopeni eller nedsatt blodplate-angiotrofisk funksjon. Forekomsten av blødninger under mansjetten tas også i betraktning..

Krukkeprøve utføres på de samme områdene av huden med en trinnaktig oppbygging av undertrykk - fra 20 kPa (150 mm Hg. Art.) og nedre. Ved evaluering av resultatene telles petekkier, dukket opp under banker.

Prøver for varigheten og mengden av kapillærblødning

Med klassikeren Hertugprøve den nedre ryggen på øreflippen, etter lett oppvarming, er gjennomboret til en dybde på 3,5-4 mm. Blødningstiden i en slik studie overstiger normalt ikke 4 m, og bloddråper på filterpapir er relativt små og begynner å avta raskt omtrent fra 1-1,5 minutter etter punktering. Med alvorlig trombocytopeni (mindre 20 T i 1 l) og alvorlig blodplatedysfunksjon, blødningstiden øker til 20-40 minutter, blodflekker blir mye større og reduseres ikke over lang tid, eller de reduseres i bølger, øk deretter igjen. Duke's test er ikke sensitiv nok, i 2/3 hos pasienter med trombocytopatier, gir det normale resultater.

Mer følsomme prøver, der blødningstiden blir undersøkt på bakgrunn av kunstig opprettet venøs stasis, hvor en mansjett fra en blodtrykksmåler er plassert på skulderen og trykket opprettholdes gjennom hele studien, lik 5,3 kPa (40 mm Hg. Art.). På bakgrunn av en slik stas i Borchgrevink-Vaaler-prøve på palmarflaten på den øvre tredjedelen av underarmen påføres tverrgående hakk med en dybde med en scarifier 1 mm og en lengde på 8-10 mm (blødningshastighet - opp til 10 m), og i prøven av Ivy et al.. i samme område av underarmen påføres en lansett for å ta blod fra en finger tre tverrgående punkteringer dypt 3 mm (blødningshastighet - opp til 7 m).

På bakgrunn av den samme venøse stasen, studere på A. FRA. Shitikova, der et stikk med en dybde påføres fingerens terminale falanks 3 mm, hvorpå fingerspissen er nedsenket i glasset 5 ml isotonisk natriumkloridoppløsning og blødningstiden i overført lys tas i betraktning (hvis løsningen er veldig intenst farget med blod, deretter for videre observasjon beveger fingeren seg til en annen slik kopp). Mengden blod som går tapt bestemmes av økningen i væskevolum i koppene (blødningshastighet - opp til 4 m, volumet av tapt blod - fra 0,01 til 0,4 ml).

I G-testen. N. Sushkevich mengden tapt blod bestemmes av ammoniakkoppløsningen (0,04 %) , der blodfargede papirer er nedsenket, ved kolorimetri på et medisinsk kolorimeter.

Indikasjoner på varighet av blødning, unormal, indikerer et uttalt brudd på blodplatevaskulær hemostase, med normale resultater av disse testene er imidlertid tilstedeværelsen av milde trombocytopatier ikke ekskludert.

Teller antall blodplater i blodet

Teller antall blodplater i blodet (i tellekammeret til Goryaev med fasekontrast eller med fargetone, eller ved bruk av partikkelteller) - den viktigste måten å diagnostisere trombocytopenier og trombocytopatier på, flyter med en konstant eller periodisk reduksjon i antallet av disse cellene (Bernard-Soulier anomalier, Maya - Hegglina et al.).

Blodplateantallet antyder også, er det mulig å utføre deres videre funksjonelle forskning og på hvilken måte den skal utføres (med eller uten foreløpig konsentrasjon av blodplater, fotometrisk eller mikroskopisk, etc.. d.).

Studie av størrelsen på blodplater i et smøre – trombotsitometriya

Studie av størrelsen på blodplater i et smøre (trombotsitometriya) lar deg gjøre en foreløpig dom om de forskjellige populasjonene av disse cellene i individets blod og få informasjon om en rekke av deres avvik., samt metning av blodplater med granuler.

For noen trombocytopatier (Wiskott-Aldrich syndrom) veldig små blodplater råder i blodet (til 2 μm i diameter), med andre - gigantiske former (Bernard-Soulier anomalier, Maya - Hegglina) - Å 8 m eller mer. I en rekke trombocytopatier er disse cellene fattige i granulat. (cm. nedenfor), i andre forstyrres sentraliseringen av granulat når blodplater spres på glasset, som indikerer et brudd på frigjøringsreaksjonen av granuler og stoffer som er inneholdt i dem, nødvendig for hemostase. Alle disse egenskapene, samt blodplatens evne til å spre seg og danne prosesser, vurdering av strukturen til disse cellene kan studeres ved bruk av konvensjonell og skanning elektronmikroskopi, og også ved hjelp av interferensoptikk ifølge Nomarski.

Tilbakeslag av blodpropp naturlig krenket med alvorlig trombocytopeni (mindre enn 30-40 G c 1 l) og med noen former for kvalitativ mindreverdighet, oftest - med Glanzmann trombocytosthenia, uremisk trombocytopati, etc..

Studie av klebeaggregasjonsfunksjonen til blodplater (AAFT)

Studie av klebeaggregasjonsfunksjonen til blodplater (AAFT) - den viktigste koblingen i laboratoriediagnose for de fleste trombocytopatier. Det er utviklet en rekke lett gjennomførbare og allment tilgjengelige forskningsmetoder., inkludert visuelt, mikroskopisk og maskinvare (aggregometre, mikrofilter, etc.) registrering av denne funksjonen, kan følgende metoder klassifiseres som omtrentlige.

Metoder for blodplateoppbevaring på glass (eller filtre)

Plater telles i venøst ​​blod før og etter å ha ført det med en forutbestemt hastighet gjennom en standard kolonne med glassperler eller gjennom en glassfiberhale; ved tap av blodplater fra blodet, vurderes graden av adhesivitet.

Mer tilgjengelig, men noe mindre nøyaktig, metode for å bestemme antall blodplater i blodet før og etter at det i en viss periode har vært i kontakt med den indre overflaten av kolben, roterer med en viss hastighet. Mer nøyaktige metoder for å bestemme blodplateoppbevaring på millipore filtre (porediameter - 15-20 mikron). I disse testene kan vurderingen utføres ved å øke trykkgradienten over og under filteret. (tilstopping av porene med blodplater og deres aggregater fører til en økning i denne indikatoren).

Metoder for å studere blodplateaggregeringsfunksjonen

Aggregasjonstest for hemolysat basert på evnen til hemolysatet av vasket erytrocytter, undersøkt i avl 10^-2 og 10^-6, forårsake, under omrøring, aggregering i sitt eget plasma, høyt på blodplater (forholdet mellom volumene av sitrert plasma og hemolysat - 1,0:0,2). Tidspunkt for forekomst av aggregering tas i betraktning (normen ved en høy konsentrasjon av hemolysat - 11-17 s, ved lave - 40-54 s) og dens alvorlighetsgrad. Dynamikken i prosessen og dens intensitet kan også vurderes fotometrisk. (medisinsk kolorimeter, grønt filter, omrøring) og på en aggregator av ethvert design.

For grafisk registrering av prosessen, bruk av høy fortynning av hemolysat (10^-6) lar deg få et to-bølgeaggregatogram, hvor den andre bølgen er assosiert med frigjøring av endogene aggregeringsstimulerende midler fra blodplater - ADP, katekolaminer, tromboksan osv.. Denne andre bølgen karakteriserer frigjøringsreaksjonen, det blir ikke observert i fravær av tette granulater i blodplater (lagringsbasseng sykdommer) eller i strid med frigjøringsreaksjonen (aspirinlignende syndrom, etc.).

Hemolysataggregeringstest er tilgjengelig for utføring i ethvert laboratorium, krever ingen spesielle reagenser.

Visuell mikrometode for bestemmelse av blodplateaggregering

Sin essens ligger i det faktum, at venøst ​​blod oppnådd under silikoniserende forhold stabiliseres med et dobbelt volum 3,8 % natriumsitrat (forhold 2,4:0,6 ml), den sentrifugeres 6 minutter ved 100 rpm, hvorpå det resulterende blodplaterike plasmaet påføres 0,02 ml på glassplater og blandet med samme volum aggregeringsmidler - ADP, trombin, kollagen, noradrenalin eller ristomycin. Den endelige konsentrasjonen av aggregerende midler i det studerte blodplasmaet bør være:

• ADF 0,5*10^-4 mmol / l;
• noradrenalin - 0,015%;
• trombin - 0,125 enheter / ml (kollagenkonsentrasjon er valgt empirisk).

Det er mulig å teste som lavere, og høyere konsentrasjoner av aggregeringsmidler. Valget av konsentrasjon kan variere avhengig av ulik aktivitet av legemidler av forskjellig produksjon og med ulik aktivitet av prøvene., derfor er det nødvendig med en foreløpig justering av konsentrasjonen av hvert middel på normalt plasma.

En blanding av blodplateaktig blodplasma av aggregeringsmidlet omrøres ved å riste lysbildet, mot en mørk bakgrunn, ved hjelp av et forstørrelsesglass, registreres tidspunktet for utseende av aggregater i form av en "snøstorm". Ved evaluering av resultatene tas antall blodplater i plasma i betraktning. Så, ADP-aggregeringstid, øker fra 27-37 s kl 400 T i 1 l blodplater opp til 62-75 s ved 50 T i 1 l, og trombinaggregering - henholdsvis fra 40-52 til 79- 106 fra.

Grafisk registrering av aggregeringsprosessen

Grafisk registrering av aggregeringsprosessen under påvirkning av de samme aggregeringsmidlene er en veldig informativ metode for den funksjonelle studien av blodplater. Utført på aggregatorer eller.

Med grafisk registrering bestemmes ikke bare tidspunktet for aggregering, men også dens intensitet (ved avvik fra kurven og arealet til aggregatogrammet), tilstedeværelsen av den første og andre aggregeringsbølgen - når du bruker lave konsentrasjoner av adrenalin og ADP (den andre bølgen karakteriserer frigjøringsreaksjonen), så vel som patologisk oppdeling.

Visuell eller grafisk undersøkelse av blodplateaggregering under påvirkning av ristomycin

Veldig visuell eller grafisk undersøkelse av blodplateaggregering under påvirkning av ristomycin er viktig. Denne typen aggregering er brutt (sluttkonsentrasjon av ristomycin 0,8-1,0 mg / ml) med en av de vanligste hemorragiske diateseene - angiohemofili (von Willebrands sykdom), og også med anomalier av Bernard-Soulier-blodplater og med noen ervervede typer hemming av syntesen av von Willebrand-faktor (uremia, immunhemming av det, etc.. d.).

Kvantifisering av von Willebrand-faktor i blodplasma

Den kvantitative bestemmelsen av von Willebrand-faktoren i blodplasma utføres ved ristomycinagglutinering av en suspensjon av normale formaliserte blodplater i forskjellige fortynninger av det studerte blodplatefrie plasmaet..

Metoden er viktig både for diagnosen angiohemofili og den sekundære hemming av syntesen av denne faktoren., og å vurdere alvorlighetsgraden av endotelskader (vaskulitt, aterosklerose, etc.) og en tendens til trombose, der innholdet av von Willebrand-faktor i blodet ofte økes betydelig.

Von Willebrand faktor nivå indikerer endotelens evne til å syntetisere det (redusert ved aigiohemofili) og graden av endotelskade i vaskulitt, aterosklerose og andre sykdommer, oppstår med skader på indre fôr i blodkarene.

For å oppnå faste normale blodplater tilsettes det blodplaterike blodplasmaet til friske individer sekvensielt 0,2 % EDTA-løsning (0,5 ml av 5 ml plasma) og etter 2 min - fikseringsløsning (20 ml 40 % formalin i 1000 ml fosfatbuffer med 0,2 g EDTA, pH 6,4).

Blandingen holdes ved en temperatur på + 4 ° C i det minste 1 Nei, hvorpå den sentrifugeres, supernatanten fjernes, og blodplatesedimentet vaskes to ganger med en suspensjonsoppløsning (ett bind 3,8 % natriumcitratløsning og fem volumer isotonisk natriumkloridoppløsning; pH justeres til 7,4). Den tilberedte suspensjonen av normale formaliserte blodplater er pakket iht 1 ml og oppbevares ved -20 ° C. En kalibrering fortynningskurve er konstruert ved bruk av blodplatefritt normalt plasma, med prøver som formaliserte blodplater blandes med. Videre bestemmes ristomycinagglutinasjon i blandingen. Kalibreringskurven brukes til å bestemme mengden von Willebrand-faktor i det analyserte blodplasmaet. Faste blodplater er bedre bevart når en liten mengde natriumazid tilsettes konserveringsløsningen.

Tester, som reflekterer spontan blodplateaggregering

Ved undersøkelse av pasienter med tromboembolisme eller med økt tendens til trombose og iskemi, er tester inkludert blant hovedmetodene, som reflekterer spontan blodplateaggregering, t. Det er. oppstår i fullblod eller i blodplasma uten tilsetning av aggregerende midler.

For å identifisere dette fenomenet med blodutstrykningsmikroskopi, blir oppmerksomheten rettet mot forholdet mellom antall blodplater som ligger separat og deres aggregater, bestående av 3-5 blodplater eller mer. Dette fenomenet oppdages bedre når man ser på sedimentet., oppnådd med intensiv ceitrif- blodplaterik plasma (20—30 min kl 6000 / Min), stabilisert med sitrat eller EDTA citratløsning. Imidlertid oppnås mer stabile resultater ved hjelp av følgende metoder for å bestemme spontan aggregering.

Wu - Hoak Method

Wu-Hoak-metoden er basert på, at blod fra en blodåre trekkes inn i to prøverør, den ene inneholder EDTA-løsning, og i den andre - en blanding av den samme EDTA-løsningen med 4 % formalinløsning. Etter blanding blir innholdet i rørene avgjort 30 min ved romtemperatur.

Under avregning legger aggregatene seg, og individuelle blodplater forblir i supernatanten. Etter avsetning telles antall blodplater i supernatantlaget i hvert av rørene. Normalt overstiger ikke forskjellen i antall blodplater i innholdet i begge rør 10-15 %, med økt spontan aggregering øker den.

Metode H. OG. Tarasova

I følge metoden til H. OG. Tarasova (1984) tapet av blodplater fra hele sitrert blod til aggregater tas i betraktning etter 3-minutters risting på en AVU-1 shaker med en hastighet på 90-100 ganger pr. 1 m.

I et prøverør med 0,5 ml blod, rystet, introdusert 1 ml 1 % formalinoppløsning i isotonisk natriumkloridoppløsning. Det andre kontrollrøret ristes ikke, og inn i blodet inneholdt i det av samme subjekt gjennom 3 min injiserte også formalinoppløsning.

Blodet i begge rør er avgjort 30 m, hvoretter antall blodplater i supernatanten telles. Normalt overstiger ikke forskjellen i antall blodplater 20 %, med økt tilbøyelighet til aggregering øker den.

I tilfeller av oppdagelse av brudd når du bruker de grunnleggende testene, karakteriserer blodplatehemostase, utføre etter behov for å gjennomføre ytterligere forskning. Av disse er de viktigste.

Ytterligere studier for å bestemme blodplatehemostase

Studie av antall megakaryocytter i myelogrammet og trepanat i benmargen med studiet av morfologien til disse cellene

Betydelig økning i antall megakaryocytter i benmargseksjoner, vanligvis kombinert med en mer eller mindre uttalt økning i antall blodplater i blodet, observert med erytremi, hemorragisk og essensiell trombocytose og andre myeloproliferative sykdommer. Moderat megakaryocytose, kombinert med trombocytopeni, karakteristisk for trombocytopen purpura (Werlhof sykdom).

Med aplasi og hypoplasi i benmargen fra en hvilken som helst genese, reduseres det som innholdet av megakaryocytter i benmargseksjoner, og antall blodplater i perifert blod.

Delvis amegakaryocytose oppstår med trombocytopoietinmangel (en sjelden form for medfødt trombocytopeni), utseendet i blodet av antimegakaryocytiske antistoffer, essensiell delvis aplasi av megakaryocytter (kan gå foran utviklingen av leukemi).

Morfologiske og cytokjemiske endringer i megakaryocytter observeres i mange trombocytopatier.

Elektronmikroskopisk studie av ultralett av blodplater

Elektronmikroskopisk studie av ultralyd av blodplater er viktig for diagnosen av en rekke trombocytopatier, hvor antallet ikke-protein med høy optisk tetthetskorn er fraværende eller reduseres kraftig (inneholder ADP, serotonin, katekolaminer, kalsium, etc.), eller protein a-granuler, som er typisk for en rekke trombocytopatier, grupperte sykdommer i lagringsbassenget, eller sykdommer med mangel på granulat.

Feil i kontraktilapparatet kan også oppdages (mikrotubuli-system) og blodplatelyososomer.

Skannelektronmikroskopi eller studiet av blodplater ved bruk av interferensoptikk i henhold til Nomarski kan også oppdage feil i blodplatefiksering på en fremmed overflate., deres spredning på det, spiondannelse, sentralisering og sekresjon av granuler, som er typisk for mange typer trombocytopatier.

Bestemmelse av antistoffer mot blodplater ved immunfluorescerende- studie i en suspensjon av blodplater immunglobulin, assosiert med disse cellene – Dixon-metoden

Denne sofistikerte metoden tillater differensiering av immun og ikke-immun trombocytopenier.

Imidlertid er det uakseptabelt i de mest alvorlige sykdomsformene med alvorlig trombocytopeni, siden bestemmelse av bundet immunglobulin krever tilstrekkelig stor (mer enn 40-50 G in 1 l) platetall.

Bestemmelse av levetiden til merkede autologe blodplater

Bestemmelse av levetiden til merkede autologe blodplater gjør det mulig å skille mellom trombocytopeni og normal levetid for blodplater i omløp (omtrent 9 Nights) og sykdomsformer med kortere levetid for disse cellene.

Førstnevnte er oftest assosiert med en reduksjon i blodplateproduksjon i benmargen., den andre - med sin akselererte død, eller med virkningen av antistoffer mot blodplater (med autoimmune trombocytopenier reduseres blodplatens levetid til flere timer), eller med et intensivt tap av disse cellene i aggregater og tromber i tilfelle disseminert intravaskulær blodkoagulasjon eller massiv trombose (trombocytopeni forbruk).

Kvantifisering av blodplasmanivåer før og etter aggregering av blodplatefaktorer

Kvantitativ bestemmelse av innholdet i blodplasma før og etter aggregering av en rekke blodplatefaktorer - membranfosfolipidfaktor 3, innhold av α-granuler (antiheparinfaktor 4, β-tromboglobulin, mitogen faktor av blodplater) og ikke-proteinkorn med høy elektron-optisk tetthet (Serotonin, katekolaminer, ADF), samt syrehydrolaser.

Disse studiene gir en ide om innholdet i de tilsvarende strukturer og deres komponenter i blodplater., ved frigjøring i plasmaet under aggregering, så vel som om intraso- vaskulær blodplateaktivering, ledsaget av frigjøring av blodplater i blodplasmaet med en økning i konsentrasjonen i sistnevnte av komponenter i tett og α-granulat (antiheparinfaktor 4, β-tromboglobulin og andre.).

Metoder for kvantitativ studie av blodplatefaktorer er viktige for identifisering av en rekke trombocytopatier (brudd på sikkerheten til granuler og deres komponenter, parese av reaksjonen ved frigjøring av disse komponentene, økning i innholdet i blodplasma på grunn av intens innside- vaskulær vedheft og blodplateaggregering, etc.). Et antall trombocytopatier er preget av en reduksjon i faktorinnholdet i blodplatemembraner 3 eller et brudd på tilgjengeligheten for deltakelse i blodkoagulasjonsprosessen.

Undersøkelse av de biokjemiske egenskapene til blodplater og deres individuelle strukturer

Undersøkelse av biokjemiske egenskaper til blodplater og deres individuelle strukturer - stroma, granulater, mitokondrier, etc.. d. tillate å dokumentere forholdet mellom forskjellige typer patologi og dysfunksjon av blodplater med visse typer enzymmangel (cyklooksygenase mangel, tromboksansyntetase, etc.), med et brudd på sammensetningen av membranlipoproteiner, kreves for interaksjon med aggregeringsmidler, og t. d.

Slike studier er bare tilgjengelige for velutstyrte forskningslaboratorier og brukes derfor ikke i allmennpraksis..