Cytochemische studie van ejaculaat

Cytochemische reactie, uitgevoerd met ejaculaat, geeft inzicht in de chemische samenstelling en de functionele activiteit van de cellen.

Bepaling van zuurfosfataseactiviteit ejaculaat

Zuurfosfataseactiviteit ejaculeren vele malen groter dan de activiteit in het bloed. Zuurfosfatase deel van de prostaat afscheidingen, de productie wordt bevorderd door mannelijke gonadotropine. Met cytochemische reacties wordt gedetecteerd in sperma en andere cellen van het ejaculaat. De activiteit wordt bepaald door de methode Goldberg - Barka.

Reagentia.

1. Formaline alcohol (een deel van het klaar 40 % formaline opgelost in negen delen 96% ethylalcohol).

2. Pararozanilin: 1 g elementaire fuchsine voor Phuc- sinosernistoy zuur opgelost tijdens verhitting in 25 ml 2 N chloorwaterstofzuur; gekoeld, gefiltreerd en bewaard in een koelkast. Reagens resistente.

3. Een waterige oplossing van natriumnitraat 4 %. 4. Een oplossing van methyl groen voor acetaatbuffer 2 % (pH - 5). De verkregen oplossing werd gewassen met chloroform, vervolgens gemengd gedurende ongeveer gelijke hoeveelheden chloroform en 2 % methyl groene oplossing. Tuimelde gedurende de dag, en vervolgens geschilderd in paarse kleur, werd chloroform verwijderd met een scheitrechter.

5. Inkubatsionnaya milieu, bestaande uit twee componenten.

• Component: 20 mg naftol-A5-fosfaat werd opgelost in 0,5 (0,3) ml dimethylformamide, toevoegen 40 ml 0,1 N oplossing van natriumacetaat en gefiltreerd door filtreerpapier; de voorbereiding van een studiedag.
• B-component: 8 druppels 4 % natriumnitraat oplossing werd gemengd met 8 daalt pararozanilina; zijn ex tempore. Voor het verkrijgen van beide componenten van het incubatiemedium wordt aangesloten (pH 5,2-5,4). Eventueel corrigeren pH 50 % azijnzuur, Een oplossing van caustische alkali.

Methode. Verse ejaculaat wordt gecentrifugeerd, wanneer een groot aantal zaadcellen afzien centrifugeren. Van sediment bereiden gepolijst glas dunne slagen, dat, en bloed uitstrijkjes, luchtgedroogde. De gedroogde uitstrijkjes door ze onder te dompelen in een bekerglas met formaline gefixeerd alcohol 30 van (niet meer) en gewassen met gedestilleerd water. Dan uitstrijkjes worden ondergedompeld in een bekerglas met incubatiemedium en geplaatst in een incubator bij een temperatuur 37 ° C 2 Nee. Daarna werden ze gewassen in gedestilleerd water, ondergedompeld 10 min in een glas met een oplossing van methylgroen (tegengekleurd voor kernen), snel afgewassen met water, gedroogd met filterpapier en door onderdompeling microscoop systeem onderzocht.

Zuurfosfataseactiviteit kan door de gemiddelde cytochemische factor uitgedrukt (SCK) door polukolychestvennomu methode Astaldi-Verga. Volgens de formule

SCK =(3*2 * a b a * 1)/100

waarbij de getallen in de teller geeft de kleurintensiteit (maximaal - 3, gematigde - 2, voetafdrukken - 1), en de letters - het percentage cellen geteld bepaalde kleurintensiteit; figuur 100 in de noemer - het totale aantal getelde cellen.

Bijvoorbeeld, geteld 100 cel, waarvan een maximum kleurintensiteit 20 cel, gematigde - 20 en met de volgende - 60 cel. Hier:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6

De spermatozoa zuurfosfatase in unit brokjes rood-oranje in het bovenste gedeelte van de kop.

Busy chromatine deel van de kop is groen en geen zure fosfatase bevat.

Een diffuse bleke kleur op zure fosfatase gedetecteerd rond het onderste gedeelte van de kop, en soms uitstrekt tot de hals van het sperma. Midden cytochemische coëfficiënt van zure fosfatase in normale sperma ejaculaat is 2,0-2,4.

In het cytoplasma van cellen van spermatogenese toonde accumulatie van granules, helder geschilderd in een specifieke (rood-oranje) kleur. In de steuncellen van het gekronkelde tubuli tubuli, vaak fors positief gekleurd voor zure fosfatase, doorzichtig niet-gekleurde kop (xromatin) sperma. Histiocyten en macrofagen bevatten enkele granules, kleurden positief voor zure fosfatase. In geïsoleerde lymfocyten, en soms neutrofielen individuele pellets, met een activiteit van zuurfosfatase.

Bepaling van de succinaat dehydrogenase activiteit (SDG) in het ejaculaat

Sukcinatdegidrogenaza - Enzyme, deelnemen redoxreacties, in cellen in een significant aantal ejaculaat. De aard van de verandering van de activiteit in verschillende pathologische processen nog niet goed begrepen. Succinaat dehydrogenase-activiteit in cellen wordt bepaald met een gemodificeerde werkwijze Nartsissova.

Reagentia.

1. Aceton-Trilon (aceton - 60 ml, distillirovannaya water - 40 ml, Trilon B - 250 mg).

2. Een oplossing van methyl green 2 % (dezelfde kleurstof, die gebruikt wordt voor het zuur fosfatase).

3. Inkubatsionnaya milieu, bestaande uit de volgende componenten:

en) fosfaatbuffer (pH 7,2-7,4) - 10 ml;

naar) 5,4 % natrium- succinaat - 10 ml;

in) complexone III (13 mg verdund in 5 ml gedestilleerd water);

g) gedistilleerd water - 5 ml;

d) nitrotetrazolium paars (10 mg verdund in 10 ml water).

Alle bestanddelen worden gemengd in een pakket en bewaard in een koelkast. Voorbereid medium kan worden hergebruikt - voor 10 dagen of meer.

Methode. Smears, bereid uit het ejaculaat, in aceton voor Trilon- vast 30 van, gewassen met gedestilleerd water en gedroogd aan de lucht. Dan uitstrijkjes worden ondergedompeld in incubatiemedium en geplaatst in een incubator bij een temperatuur 37 ° C 1 Nee, waarna ze worden gewassen met gedestilleerd water en dokrashivayut methylgroen voor 10 m. Dan weer snel gewassen met water, gedroogd met filterpapier en door onderdompeling microscoop systeem onderzocht.

Normaal sperma hoge activiteit van succinate dehydrogenase, vertegenwoordigd door grote blauw-paarse korrels, dat, samen samenvoegen, vormen een dichte massa, vullen nek sperma, sommige zaadcellen individuele pellets zijn te vinden rond het hoofd.

Bereken gesmolten samen korrels is niet mogelijk, Daarom, om de activiteit van succinaatdehydrogenase gekleurde gedeelte sperma gemeten in micrometers bepalen. Langs de lengte van het specifiek geschilderd voor succinaat dehydrogenase van de zaadcellen worden beoordeeld op de mate van activiteit van het enzym in het sperma. Met oculaire micrometer en object-micrometer lengte wordt gemeten in specifieke gekleurde deel 100 spermatozoidax. Het toevoegen van de lengte geteld in gebrandschilderd delen van spermatozoa, en het verdelen van de resulterende figuur door 100, ontvangt een gemiddelde lengte, uitdrukken suktsinatdegidrogenaznuyu activiteit voor een enkele zaadcel. Gewoonlijk is 4,3 ± 0,7 m. Deze berekening LDH activiteit is de meest informatieve en wordt daarom aanbevolen om te gebruiken voor onderzoeksdoeleinden.

Voor een ruime toepassing in de praktijk, deze methode is vrij ingewikkeld, de voorkeur de hoeveelheid succinaat dehydrogenase tot expressie Astaldi-methode Verga. Midden cytochemische coëfficiënt LDH van zaadcellen in het ejaculaat is normaal 2,7 ± 0,3.

In de cellen van spermatogenese LDH activiteit wordt waargenomen in de vorm van clusters van grote blue-violet granules, vaak opgaan in grote klonten, in verschillende gebieden van het cytoplasma. Midden cytochemische factor in de cellen van spermatogenese bereikt 2,0. Met de rijping van cellen van het ejaculaat en verhoogt de activiteit van LDH in mature spermatozoa overschrijdt 2,0. In het cytoplasma van bepaalde lymfocyten gevonden brokken SDG.

Bepaling van peroxidase activiteit in het ejaculaat

Het sperma, spermatogenese cellen en steuncellen van het gekronkelde tubuli tubuli peroxidase ontbreekt.

De neutrofiele granulocyten ejaculaat peroxidase activiteit wordt uitgedrukt in aanzienlijke mate en kan variëren afhankelijk van de aard van het ziekteproces, alsmede in perifeer bloed. Het niveau van de peroxidase activiteit in neutrofielen is belangrijk om de functionele status en activiteit van het ontstekingsproces in de mannelijke geslachtsorganen beoordelen. Stained uitstrijkjes van sperma Graham-Knoll en boekhoudkundige activiteit van het enzym door Astaldi-Verga zijn analoog bloeduitstrijkje.

Peroxidase-activiteit in de cellen van het ejaculaat wordt bepaald door Werkwijze Graham-Knoll.

Reagentia.

1. Formaline alcohol (zelfde, en dat het zuurfosfatase).

2. Peroksidaznыy reagens: ʙenzidin (op het uiteinde van een scalpel) opgelost in 6 ml 96 % ethylalcohol, toevoegen 4 ml gedestilleerd water 0,02 ml 3 % waterstof peroxide. Reagens bruikbaar voor 5-6 dagen.

3. Romanovsky Dye bij een verdunning van 1-2 druppels op 1 ml gedestilleerd water.

Methode. Vers sperma uitstrijkjes werden vastgesteld voor 30 formaline met alcohol, gewassen met stromend water en gedroogd. Dan giet slagen peroxidase reagens voor 5-7 minuten, grondig gewassen onder stromend water en gedroogd. Daarna zij dokrashivayut 15 20 min dye Romanovsky, gewassen met stromend water, gedroogd en mikroskopiruyut met behulp van de onderdompeling microscoop systeem.

Bij een positieve reactie op peroxidase in neutrofiele granulocyten onthult grote goudbruin korrels in grote aantallen. Met een groot aantal witte bloedcellen nodig zijn om het te berekenen Gemiddeld cytochemische factor (SCK). Het cytoplasma van histiocyten individuele peroxidase aanwezig als kleine clusters zoals granules.

Bepaling van glycogeen in het ejaculaat

Veranderingen in glycogeen gehalte in verschillende cellen van invloed op hun functie of het bewijs van de ontwikkeling van pathologisch proces. Bepaling van glycogeen in de cellen wordt uitgevoerd door McManus.

Reagentia.

1. Een waterige oplossing van perjoodzuur 1 % (voorbereiding te gebruiken).

2. Sernistaya water: 5 ml 10 % kalium of natriummetabisulfiet, 5 ml 1 N chloorwaterstofzuur, water 100 ml (voorbereiding te gebruiken).

3. Reagens Shiffa: 1 g elementaire fuchsine voor fuksinosernistoy zuur, pre-gemalen in een porseleinen vijzel, worden opgelost onder constant schudden gedurende 5 min 200 ml kokend gedestilleerd water, door een papieren filter en toegevoegd onder koeling tot 50 ° C 20 ml 1 N chloorwaterstofzuur, en wanneer afgekoeld tot 25 ° C - 1 g kalium of natriummetabisulfiet. De bereide reagens wordt in de koelkast bewaard 24 h waarna hij verlicht en ongeschikt voor consumptie vitsya geworden

4.De waterige oplossing van methylgroen 2 %, gewassen met chloroform

5.Chemisch zuivere methylalcohol.

Methode.

Thin-gedroogde uitstrijkjes ejaculaat vast chemisch zuivere methylalcohol voor 3 m, gespoeld met gedestilleerd water en ondergedompeld in een bekerglas met 1 % waterig joodzuur 5 m. Vervolgens werden de vlekken gewassen met gedestilleerd water, droog, zwavelhoudende gespoeld in water opnieuw en gedroogd.

Verdere swabs ondergedompeld in een beker met Schiffs reagens 15 m, spoel ze in drie porties van zwavelhoudend water (door 3 min elk), gewassen 10 min in water en celkernen dokrashivayut 3 min methyl groen. Dan weer gespoeld met water swabs, filterpapier en gedroogd mikroskopiruyut met onderdompeling systeem microscoop.

In volwassen spermatozoa ontbreekt glycogeen. In het cytoplasma van de jonge sperma, vooral met de "kraag", bleek sporen van glycogeen (±), soms in de vorm van afzonderlijke pellets in het bovenste deel van het hoofd of de "kraag".

In de cellen van spermatogenese Glycogeen wordt in grote hoeveelheden in de vorm van een kersenrode granules, vult het hele cytoplasma. Met de rijping van cellen te verliezen glycogeen tot zijn verdwijning in mature spermatozoa. Spermatocitы glycogeen bevatten niet alleen in het cytoplasma, maar ook in de nucleus. In de ondersteunende cellen van het ingewikkelde testes, glycogeen is een kersenrode korrels en diffuse. Rijpe neutrofiele granulocyten in het ejaculaat, en in perifeer bloed uitstrijkjes, bevatten een aanzienlijke hoeveelheid glycogeen. Bij chronische prostatitis in neutrofiele granulocyten ejaculaat verhoogt aanzienlijk de hoeveelheid glycogeen en verhoogt de activiteit van peroxidase. In geïsoleerde lymfocyten worden soms gevonden in de normale glycogeen korrels.

Macrofagen sporen van glycogeen Achtergrond sperma uitstrijkjes gekleurd in kersen-rode kleur bevatten, waarvan de aanwezigheid in het plasma van het ejaculaat grote hoeveelheden glycosaminoglycanen (mukopolisaxaridov).

Definitie van ribonucleïnezuur (RNA) in het ejaculaat

Verhoogde niveaus van RNA in cellen Het toont sterk anti hun groei, sekretornoй, synthetische en andere activiteiten. Het verminderen van de hoeveelheid RNA in jonge cellen vaak geassocieerd met verminderd vermogen van deze cellen om te regenereren. RNA-gehalte van de cellen wordt bepaald de werkwijze van het kippenhok.

Reagentia.

1. Reagens Chicken Coop: afzonderlijk bereid 2 % methyl groene oplossingen en pyronine, methyl groene oplossing werd zorgvuldig gewassen met chloroform; kleurstof werkoplossing wordt bereid door 2 % oplossing pyronine (12,5 ml) en 2 % methyl groene oplossing (7,5 ml) onder toevoegen 30 ml gedestilleerd water. De kleurstof-resistente, in de koelkast bewaard.

2. Lock - chemisch zuivere methylalcohol.

Methode. Uitstrijkjes gefixeerd met methanol 3 m, kleurstof werkende oplossing pyronine-methyl groen 15 m, snel gespoeld met water en gedroogd met filterpapier. Mikroskopiruyut met behulp van de onderdompeling microscoop systeem. RNA pyronine geschilderd in heldere rode kleur, celkernen - methyl groen groen.

Rijpe zaad niet-RNA. De cellen zijn rijk aan RNA spermatogenese, waarbij het aantal cellen als ze volwassen afneemt. In spermatohonyy cytoplasma rijke roze kleur, in spermatotsytov wat fading, en in spermatiden lichtroze. Bij jonge sperma "collar" roze geschilderde overwegend "collar".

Sperma, in de laatste fase van zijn ontwikkeling, in de ondersteunende cellen van de ingewikkelde testes verliest de resten van een roze stof (RNA) en word volwassen sperma.

In de cellen van spermatogenese bevat een grote hoeveelheid glycogeen, RNA werd significant tot expressie LDH activiteit en CF. Maar, doorgaans, deze geïsoleerde cellen in het ejaculaat, Daarom tellen CBFV onpraktisch. In dat geval beperkt tot het verhaal vorm totstandkoming.

Cytochemische karakterisering van leukocyten Het is een belangrijke indicator voor de functionele activiteit. Tellen van het aantal leukocyten in het ejaculaat stof die in dezelfde, Zoals in andere cellen in het ejaculaat en perifeer bloed.

In de uitstrijkjes gekleurd met gebruikelijke werkwijzen ejaculaat (azurozinovymi mengsels, Hematoxyline-eosine en anderen.), evenals inheemse voorbereidingen zijn niet altijd gemakkelijk te onderscheiden van leukocyten, cellen van spermatogenese, prostaat epitheel, histiocyten en andere elementen.

Cytochemische technieken in combinatie met morfologische vaak helpen opzetten van een soort cellen. Dus, uitgedrukt peroxidaseactiviteit, mits grote gouden-bruine kralen, vult het gehele cytoplasma van cellen, kenmerk van volwassen neutrofielen, in andere cellen zoals reactie meer optreedt. Ernstige reactie op glycogeen is typisch neutrofielen en cellen van spermatogenese, maar deze niet peroxidase activiteit. RNA in de cellen en spermatogenese geen mature granulocyten. De cellen van spermatogenese zijn reactie op zuurfosfatase uitgesproken, en neutrofiele granulocyten, ze nemen zeer slecht, enzovoort. d.