Paroxismale nachtelijke hemoglobinurie – Ziekte Marchiafava Michele

Paroxismale nachtelijke hemoglobinurie - een relatief zeldzame verworven vorm van hemolytische anemie, in verband met de wijziging van de structuur van erytrocyten, Neutrofiele granulocyt en bloedplaatjes. Komt voor met tekenen van intravasculaire hemolyse, waarbij hemoglobinurie wordt waargenomen, gemosiderinuriya, toename van plasmavrij hemoglobine. De ziekte wordt vaak gecompliceerd door trombose van perifere aderen en vaten van inwendige organen..

Etiologie en pathogenese van paroxismale nachtelijke hemoglobinurie

De eerste beschrijving van de ziekte werd gegeven 1882 g. Het is in meer detail beschreven in 1928 g.

De algemene naam voor de ziekte is paroxismale nachtelijke hemoglobinurie (PNG), het komt echter niet overeen met de essentie van de ziekte, omdat daarmee geen echte paroxysmen zijn en hemoglobinurie niet altijd wordt waargenomen.

Intravasculaire hemolyse met hemosiderinurie wordt, naast PNH, ook waargenomen bij vele vormen van auto-immuun hemolytische anemie, beide met hitte, evenals met koude antistoffen, vooral in vormen met thermische hemolysinen, evenals bij sommige vormen van erfelijke hemolytische anemie, geassocieerd met een schending van de structuur van het erytrocytenmembraan.

De ziekte van Marchiafava-Micheli komt op verschillende leeftijden voor. De reden voor de verhoogde vernietiging van rode bloedcellen is een defect in de rode bloedcellen zelf..

Erytrocyten van patiënten met PNH, zoals hierboven vermeld, worden gemakkelijk vernietigd door complement bij het creëren van optimale omstandigheden voor zijn actie, of bij het aanzuren van whey, of met een toename van de concentratie van complement rond de erytrocyt door de vorming van een lage concentratie van ionen in het sucrosemedium. Erytrocyten van patiënten met PNH hebben een verhoogde gevoeligheid voor de effecten van antilichamen zoals agglutinines., en, vooral, Hemolysinen.

PNH beïnvloedt meer dan alleen rode bloedcellen., maar ook leukocyten en bloedplaatjes van de patiënt. Bloedplaatjes en leukocyten van patiënten met PNH hebben een verhoogde gevoeligheid voor complementeffecten zoals bij serumverzuring, en in een medium met sucrose met lage ionsterkte. Ze zijn vele malen gevoeliger voor de werking van isoagglutinines., dan donorbloedplaatjes en leukocyten. Dus, bloedplaatjes en leukocyten hebben hetzelfde membraandefect, wat zijn erytrocyten.

Detecteer immunoglobulinen op het oppervlak van rode bloedcellen, leukocyten en bloedplaatjes, en dus om te bewijzen dat PNH tot de groep van auto-agressieve ziekten behoort, is met de meest gevoelige methoden niet mogelijk..

Er is sterk bewijs voor de aanwezigheid van twee verschillende RBC-populaties in PNH.. De meest resistente cellen bij een gezond persoon - reticulocyten zijn de meest kwetsbare in PNH. Dit suggereert dat, dat de abnormale populatie erytrocyten simpelweg niet overleeft tot rijping, en oudere rijpe rode bloedcellen behoren tot een gezonde of bijna gezonde populatie.

IN 1970 bij de studie van erytrocyten van de mulat, lijdt aan PNH, kwam erachter, wat houden ze in, als gezonde mulatten, twee normale elektroforetische varianten van G-6-PD; optie A, gebruikelijk in Afrika, en optie B, Europese. Na hemolyse bleek het, dat pathologische erytrocyten slechts één variant van G-6-PD bevatten, en normale erytrocyten - beide elektroforetische varianten van G-6-PD. Vandaar, gehemolyseerde rode bloedcellen ontstaan ​​uit een enkele cel.

Dit feit wijst met grote zekerheid op de aanwezigheid van twee populaties erytrocyten., niet alleen functioneel anders, als, bv, bij microsferocytose, maar ook naar afkomst: met andere woorden, het bevestigt de aanwezigheid van een pathologische kloon van cellen, t. het is. somatische mutatie. Identiteit van erytrocytmembraanlaesie, neutrofielen en bloedplaatjes geeft dat aan, dat pathologische informatie hoogstwaarschijnlijk door de cel wordt ontvangen, naast de stengel, t. het is. myelopoëse voorlopercel. Blastomagroei is niet typerend voor PNH. Er zijn alleen geïsoleerde gevallen beschreven van de ontwikkeling van snelle leukemie tegen de achtergrond van PNH.. Niettemin, We kunnen aannemen, dat PNH een variant is van een goedaardige tumor van het bloedsysteem, lange tijd zonder tumorproliferatie, kenmerk van andere vormen van leukemie.

Het mechanisme van de ontwikkeling van complementgevoeligheid bij PNH is nog onduidelijk..

Er zijn geen significante veranderingen in de activiteit van glycolyse-enzymen en de pentose-fosfaatcyclus.

PNH vermindert de activiteit van erytrocyt acetylcholinesterase, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van een schending van de structuur van het erytrocytenmembraan, omdat het enzym zich op het oppervlak van het membraan bevindt en gemakkelijk wordt verstoord wanneer het beschadigd is. Bekend, dat het gebruik van acetylcholinesteraseremmers geen effect heeft op de overleving van erytrocyten. Een afname van de acetylcholinesterase-activiteit wordt echter ook waargenomen bij andere vormen van hemolytische anemie., kan daarom niet dienen als verklaring voor het fenomeen van verhoogde complementgevoeligheid- Geldigheid.

Er zijn aanwijzingen, wat wijst op een toename van de hoeveelheid onverzadigde vetzuren, zit in fosfolipiden, erytrocyten membranen. De mogelijkheid is niet uitgesloten, dat veranderingen in lipiden slechts een weerspiegeling zijn van enkele andere veranderingen in de structuur van het erytrocytenmembraan. In de studie van het eiwit van het erytrocytenmembraan van patiënten met PNH door elektroforese in polyacrylamidegel in aanwezigheid van natriumdodecylsulfaat, werd gevonden, dat in een aantal fracties het eiwitgehalte significant afweek van de controle.

De hoofdrol in de pathogenese van trombotische complicaties bij PNH wordt toegewezen aan de intravasculaire afbraak van erytrocyten en stimulatie van stolling door factoren, vrijkomen uit erytrocyten tijdens hun afbraak. PNH vernietigt voornamelijk reticulocyten., misschien, dit zou de frequentie van trombotische complicaties bij deze ziekte moeten verklaren, in tegenstelling tot andere vormen van hemolytische anemie, vergezeld van ernstige intravasculaire hemolyse.

Klinische manifestaties van paroxismale nachtelijke hemoglobinurie

De ziekte begint meestal sluipend. Patiënten klagen van zwakte, malaise, duizeligheid. Soms is er een subicterische sclera. Hoofdpijn is vaak de eerste klacht., pijn in de buik van verschillende lokalisatie. De neiging tot verhoogde trombose dwingt de patiënt om een ​​arts te raadplegen. Hemoglobinurie is vrij zelden het eerste symptoom van de ziekte en bij sommige patiënten kan PNH helemaal afwezig zijn.. In sommige gevallen verschijnt het voor het eerst na 2-3 jaar en zelfs daarna 10 jaar na het begin van de ziekte.

Een van de kenmerkende symptomen van PNH zijn aanvallen van buikpijn.. De lokalisatie kan heel verschillend zijn.. Buiten de crisisperiode buikpijn, doorgaans, niet waargenomen. Vaak gepaard met braken. Hoogstwaarschijnlijk, buikpijn bij patiënten met PNH wordt geassocieerd met trombose van de mesenteriale vaten.

Trombose van perifere vaten (meestal - aderen van de bovenste en onderste ledematen, minder vaak - niervaten) ook een kenmerkend symptoom van paroxismale nachtelijke hemoglobinurie. In 12 % bij patiënten met PNH wordt tromboflebitis waargenomen. Trombotische complicaties zijn de meest voorkomende doodsoorzaak bij deze ziekte..

Bij een objectief onderzoek van de patiënt trekt bleekheid met een lichte icterische tint meestal de aandacht.. Vaak is er wallen in het gezicht, soms te vol. Mogelijk lichte vergroting van de milt en lever, hoewel dit niet typisch is voor PNG.

Paroxysmale nachtelijke hemoglobinurie wordt gekenmerkt door tekenen van intravasculaire hemolyse., de belangrijkste daarvan is een toename van vrij plasmahemoglobine. Dit symptoom wordt periodiek waargenomen bij bijna alle patiënten met PNH.. De mate van toename van plasmavrij hemoglobine varieert echter en is afhankelijk van, tijdens welke periode van de ziekte het onderzoek werd uitgevoerd. Tijdens een crisis stijgt dit cijfer aanzienlijk, er is ook een toename van de hoeveelheid plasmametalbumine.

Het niveau van vrij hemoglobine in plasma hangt af van de mate van hemolyse op dit moment., haptoglobine inhoud, de mate van filtratie van hemoglobine in de urine en de snelheid van vernietiging van het hemoglobine-haptoglobinecomplex. In het geval van een lichte mate van hemolyse zal het niveau van vrij plasmahemoglobine onvoldoende zijn om het door het nierfilter te filteren.. Daarom is hemoglobinurie geen verplicht symptoom van de ziekte.. Bij het passeren van de tubuli van nefronen wordt het uitgescheiden hemoglobine gedeeltelijk vernietigd en afgezet in het epitheel van de tubuli.. Hierdoor wordt hemosiderine uitgescheiden in de urine..

Hemosiderine wordt uitgescheiden in de urine bij de overgrote meerderheid van de patiënten met paroxismale nachtelijke hemoglobinurie.. Soms verschijnt hemosiderinurie niet onmiddellijk. Dit is belangrijk, maar geen PNH-specifiek teken van de ziekte.

Laboratoriumindicatoren voor paroxismale nachtelijke hemoglobinurie

Het gehalte aan hemoglobine bij patiënten met PNH varieert van 1,86- 3,1 mmol / l (30-50 g/l) en zelfs lager tot normaal tijdens remissies.

Het aantal erytrocyten bij patiënten met PNH neemt af volgens het niveau van afname van hemoglobine. De kleurindex blijft lange tijd dicht bij de eenheid. Waarin, als de patiënt een aanzienlijke hoeveelheid ijzer in de urine verliest in de vorm van hemosiderine en hemoglobine, het ijzergehalte neemt geleidelijk af. Bij ongeveer de helft van de patiënten wordt een lage kleurindex waargenomen. Sommigen van hen hebben verhoogde niveaus van hemoglobine P, vooral tijdens een exacerbatie.

Bij een aanzienlijk deel van de patiënten verhoogde niveaus van reticulocyten, maar relatief laag (2- 4 %). Het aantal leukocyten in PNH is in de meeste gevallen verminderd. Bij veel patiënten is het 1,5-3 G per 1 l, maar neemt soms af tot 0,7-0,8 G in 1 l. Leukopenie, doorgaans, waargenomen als gevolg van een afname van het aantal neutrofiele granulocyten. Soms is het gehalte aan leukocyten in PNH normaal of verhoogd - tot 10-11 G per dag. 1 l.

Met PNH neemt de fagocytische activiteit van neutrofiele granulocyten af..

Trombocytopenie ook vaak gezien in PNH, de functionele toestand van de bloedplaatjes is echter normaal. Waarschijnlijk, dit verklaart de zeldzaamheid van hemorragische complicaties bij deze ziekte, hoewel het aantal bloedplaatjes soms in grote mate afneemt - tot 10-20 G per 1 l. Gewoonlijk is bij de meeste patiënten het aantal bloedplaatjes 50-100 G per 1 l. Een normaal aantal bloedplaatjes sluit de diagnose van paroxismale nachtelijke hemoglobinurie niet uit..

Bij onderzoek van het beenmerg symptomen worden gevonden, meestal kenmerkend voor hemolytische anemie - irritatie van de rode hematopoietische kiem met een normaal aantal myelokaryocyten. Sommige patiënten hebben een lichte afname van het aantal megakaryocyten..

Serum ijzergehalte in PNH Het hangt af van het stadium van de ziekte, mate van intravasculaire hemolyse en hematopoëtische activiteit. Waarin, als patiënten aanhoudende of frequente hemoglobinurie hebben, evenals aanhoudende hemosiderinurie, ijzergehalte in het lichaam, en dus, en dalingen in serum, soms heel ingrijpend. Soms begint PNH met tekenen van hypoplasie. IJzervoorraden in het lichaam van een patiënt met PNH zijn afhankelijk van, een kant, door verlies van ijzer in de urine, en anderzijds op de intensiteit van erytropoëse. Daarom kan ijzertekort niet worden beschouwd als een diagnostisch teken van paroxismale nachtelijke hemoglobinurie..

Serumbilirubineniveau in PNH in de meeste gevallen licht verhoogd of normaal, voornamelijk indirect. Het gemiddelde gehalte aan bilirubine is 22-28 µmol/l. Er moet rekening worden gehouden, dat tijdens de intravasculaire afbraak van hemoglobine een hemoglobine-haptoglobinecomplex wordt gevormd, die uiteindelijk ook afbreekt om bilirubine te vormen.

Bij sommige patiënten met PNH begint de ziekte met een beeld van aplastische anemie..

Diagnose van paroxismale nachtelijke hemoglobinurie

Bij paroxismale nachtelijke hemoglobinurie is de structuur van het erytrocytenmembraan verstoord, wat tot uiting komt in zijn verhoogde gevoeligheid voor de effecten van complement. Dergelijke overgevoeligheid wordt gedetecteerd met behulp van de Hem-test, of een meer gevoelige sucrosetest. In sommige gevallen echter, vooral in de hemolysinevorm van auto-immune hemolytische anemie, sucrose-test kan een vals positief resultaat geven. Hemolysinen worden gefixeerd op het oppervlak van hun eigen erytrocyten en vernietigen ze in aanwezigheid van complement in een sucrosemedium., terwijl PNH wordt gekenmerkt door de vernietiging van cellen door complement zonder blootstelling aan antilichamen.

Om de hemolysinevorm van auto-immuun hemolytische anemie uit te sluiten, wordt aanbevolen om hemolysines te bestuderen met behulp van de hierboven beschreven methode en met behulp van een cross-sucrose-test met het serum van de patiënt en erytrocyten van een donor uit één groep, en niet andersom, hoe het wordt geaccepteerd. Bij PNH is een directe test positief, en het kruis is negatief. In de hemolysinevorm kan AIHA als positief worden waargenomen, en negatieve kruistest. In deze gevallen is het raadzaam om de derde variant van de sucrosetest te gebruiken - met beide serums, en erytrocyten van de patiënt. De mate van hemolyse in deze variant is minimaal in PNH en maximaal in de hemolysinevorm van AIHA.. Dit resultaat kan alleen worden verklaard door de hoge specificiteit van antilichamen in het serum van een patiënt met een hemolysinevorm van auto-immune hemolytische anemie tegen het antigeen, in grotere hoeveelheden aanwezig in de erytrocyten van de patiënt, dan in donorerytrocyten. Een direct positieve sucrosetest bij deze patiënten is geassocieerd, waarschijnlijk, met gefixeerde antilichamen op erytrocyten.

Detectie van hemolysinen door de methode van geaggregeerde hemagglutinatie en anderen helpt om de juiste diagnose te stellen. Kan niet worden gebruikt als donorserum van patiënten, want als het hemolysine bevat, kan het resultaat vals-positief zijn. Er kunnen negatieve resultaten optreden, als het serum van de patiënt met PNH of het serum van een patiënt met levercirrose als complementbron wordt gebruikt, Reumatoïde artritis, systemische lupus erythematosus en andere ziekten, waarin het complementniveau afneemt. Sucrose-test en Hem-test worden minder uitgesproken, als heparine wordt gebruikt als antistollingsmiddel bij bloedafname van de patiënt, geen natriumcitraat. Na een hemolytische crisis neemt de intensiteit van de Hem-test en de sucrosetest af, maar ze worden niet negatief..

Bepaling van vrij hemoglobine in bloedplasma met de Bing-methode, gemodificeerd door Derviz en Bialko bij paroxismale nachtelijke hemoglobinurie

De methode is gebaseerd op het vermogen van hemoglobine om te reageren met benzidine in een zure omgeving in aanwezigheid van waterstofperoxide om een ​​groene kleur te vormen., eerst blauw worden, en dan naar roodachtig paars. De kleurintensiteit is evenredig met de hoeveelheid hemoglobine.

Reagentia.

1. Acetaatbuffer 0,1 M, pH 4,6: 27,22 g natriumacetaat wordt opgelost 1 l water (0,2 M oplossing van); bereid in een andere maatkolf 1 l 0,2 M oplossing van azijnzuur; gemengd 480 ml oplossing nr 1 en 520 ml oplossing nr 2.
2. Waterstof peroxide 0,3 % oplossing (bereid voor gebruik door perhydrol erin te verdunnen 100 tijd).
3. Benzidine zoutzuur 0,1 % oplossing: 50 mg zoutzuurbenzidine wordt opgelost in 35-40 ml acetaatbuffer, verwarm de oplossing tot 80 °C in een waterbad en breng na afkoeling met acetaatbuffer aan 50 ml.

Filter in een donkere fles en bewaar bij kamertemperatuur niet langer dan 7 dagen. Een vergeeld reagens is onbruikbaar, bij snel donker worden is het noodzakelijk om benzidine uit alcohol te herkristalliseren.

Methode.

Bloed voor onderzoek wordt met een droge naald uit een ader genomen in een gesiliconiseerde reageerbuis., die een antistollingsmiddel bevatten. Bloed met antistollingsmiddel wordt niet meer dan gecentrifugeerd 10 minuten bij 1500 / Min. Na afscheiding van het plasma wordt het nogmaals gecentrifugeerd 10 minuten bij 8000 rpm voor leukocytsedimentatie.

Giet in een reageerbuis 4 ml acetaatbuffer, 2 ml waterstofperoxide, 2 ml benzidine i 0,04 ml te testen bloedserum wordt gemengd en men laat het staan 3 m, vervolgens in een cuvet gegoten met een optische weglengte 1 cm en fotogemeten tegen de compensatieoplossing met een groenlichtfilter. De intensiteit van de blauwe kleur neemt binnen 4-5 minuten toe, daarom wordt de meting 3-5 keer achter elkaar herhaald en worden de maximale meetwaarden geregistreerd. Na 5-6 minuten krijgt de kleur van het serum een ​​lila-bruine tint., en de waarde van de optische dichtheid begint af te nemen. Van de twee gevonden maximale optische dichtheidsresultaten wordt het gemiddelde genomen.

Compensatie oplossing, bestaande uit 6 ml acetaatbuffer, 8 ml waterstofperoxide, 3 ml benzidine-oplossing i 0,06 ml isotone natriumchlorideoplossing, tegelijk met het monster bereid.

De kalibratiecurve is afgeleid van de hemoglobine-oplossing. In het bloed, genomen om een ​​hemoglobineoplossing te bereiden, meet de inhoud ervan. (op een medische colorimeter of een medische refractometer). Bereid een hemoglobineoplossing met een concentratie voor 1 g / l, waaruit oplossingen met een lagere concentratie worden bereid: 0,005,0,025, 0,05, 0,1 en 0,2 g / l. Voeg van elke resulterende oplossing toe 0,04 ml tot mengsel 4 ml acetaatbuffer, 2 ml benzidine-oplossing i 2 ml waterstofperoxide.

Stamoplossing van hemolysaat (1 g / l) voor de ijkkromme moet koud worden gehouden, en werkoplossingen met een lagere concentratie moeten onmiddellijk vóór het onderzoek worden bereid.

Gewoonlijk, in het 1 l bloedplasma bevat 0,0005 mmol / l (0,01-0.04 G) Hemoglobine.

Bepaling van urinair hemosiderine bij paroxismale nachtelijke hemoglobinurie

Tijdens de afbraak van hemoglobine wordt ijzer geadsorbeerd door het epitheel van de niertubuli en maakt het deel uit van hemosiderine.. De afgeschilferde epitheelcellen van de niertubuli bevatten in deze gevallen korrels hemosiderine.

Bij zorgvuldig onderzoek van het urinesediment na centrifugeren zijn hemosiderinekorrels zichtbaar, zelfs zonder speciale kleuring.. Ze vallen echter duidelijker op als ze worden bevlekt de Perls-methode.

Methode.

Na centrifugeren van de urine wordt de bovenste laag afgezogen, vers bereide oplossing wordt aan het neerslag toegevoegd 1 % geel bloedzout en 1 % zoutzuur oplossing (meng gelijke hoeveelheden 2 % zoutzuuroplossing en geel bloedzout). Na 10 minuten na het mengen wordt het mengsel gecentrifugeerd en wordt het neerslag onderzocht. Hemosiderin-korrels worden blauw.

Bepaling van plasma methemalbumine door middel van spectrofotometrische methode

Reagentia.

1. Fosfaat isoosmotische buffer (pH 7,4): gemengd 18 ml 0.15 M oplossing van natriumdiwaterstoffosfaat (24,4 g YaN2R04 op 1 l water) en 82 ml 0,15 M oplossing van natriumwaterstoffosfaat (21,3 г NaH₂NA₄ op 1 l water).
2. natrium hydrosulfiet.
3. Bijtende soda-oplossing 1 M.
4. Humaan serumalbumine-oplossing (40 g / l).
5. Gemin-oplossing (5 mg / 100ml); onmiddellijk bereid door hemine op te lossen in een kleine hoeveelheid natronloog, en dan: breng het op het vereiste volume met een oplossing van serumalbumine.

Methode.

K 2 ml serum of plasma wordt toegevoegd 1 ml gebufferde iso-osmotische oplossing, pH 7,4. Het mengsel wordt gecentrifugeerd 30 min bij 1200-1500 tpm. Bepaal de optische dichtheid bij 569 nm. Het verdunde plasma wordt vervolgens in een reageerbuis geplaatst en ca 5 mg droog natriumwaterstofsulfaat. Door 5 min meet de optische dichtheid opnieuw bij dezelfde golflengte. Het verschil tussen de twee optische dichtheidswaarden komt overeen met de optische dichtheid van methhemalbumine. De concentratie methemalbumine wordt bepaald door de kalibratiecurve.

De kalibratiegrafiek wordt als volgt uitgevoerd. Een oplossing van hemine met albumine wordt overgebracht in reageerbuizen in een hoeveelheid van 0,01 naar 0,1 g / l (van 0,2 naar 2 ml). In die reageerbuizen, waarbij de hoeveelheid oplossing kleiner is 2 ml, optellen tot 2 ml albumine-oplossing. Voeg dan toe 1 ml fosfaat iso-osmotische buffer. Het mengsel wordt gecentrifugeerd bij 1500 / Min, en meet vervolgens de optische dichtheid. Het verschil tussen metingen wordt uitgezet volgens de hoeveelheid hemine..

Normaal gesproken is er geen hemalbumine in het bloedplasma.. Het verschijnt in het geval van intravasculaire hemolyse, bv, met paroxismale nachtelijke hemoglobinurie of hemolysine-vorm van auto-immune hemolytische anemie, en ook bij afwezigheid van haptoglobine, wanneer heem bindt aan albumine.

Ham-test voor paroxysmale nachtelijke hemoglobinurie

De Hema-test is gebaseerd op een afname van de weerstand van erytrocyten van PNH-patiënten tegen een afname van de pH van het medium in aanwezigheid van vers serumcomplement..

Reagentia.

1. Een oplossing van chloorwaterstofzuur 0,2 n.
2. Ammoniak oplossing 0,04 %.

Methode.

Neem uit een ader 5 - 6 ml bloed. Natriumoxalaat of natriumcitraat wordt gebruikt als antistollingsmiddel. Neem tegelijkertijd 15-20 ml bloed af van een donor van dezelfde groep. Scheid erytrocyten van plasma in het bloed van de patiënt en de donor.

Het bloedserum van de donor wordt ingeschonken 0,5 ml in zes reageerbuizen, twee ervan zijn geplaatst 20 min. in een waterbad op temperatuur 56 °C voor inactivatie van serumcomplement, de resterende vier reageerbuizen worden op kamertemperatuur gelaten. De erytrocyten van de patiënt worden tweemaal gewassen met isotone natriumchlorideoplossing., vervolgens gesuspendeerd in dezelfde oplossing in de verhouding 1:1.

Het studieschema wordt gepresenteerd in de tabel.

Meng de inhoud van elke tube, geplaatst op 1 h in een thermostaat op een temperatuur 37 ° C, en daarna gecentrifugeerd.

Voor een blanco test 0,05 m erytrocyten van de patiënt en de donor worden afzonderlijk toegevoegd 0,55 ml isotone natriumchlorideoplossing.

Na centrifugeren kan de mate van hemolyse met het oog worden beoordeeld. Om de mate van hemolyse in elke buis te kwantificeren 4,7 ml 0,04 % ammoniakoplossing wordt toegevoegd 0,3 ml oppervlaktelaag, en in een reageerbuis met een blanco monster - 0,3 ml aanvankelijk bloedserum.

Te identificeren 100 % hemolyse k 4,7 ml ammoniakoplossing wordt toegevoegd 0,3 ml erytrocytensuspensie (0,05 ml erytrocyten van de patiënt 0,55 ml isotone natriumchlorideoplossing).

De optische dichtheid van de oplossing wordt gemeten op een medische colorimeter en de aflezingen worden vergeleken met de optische dichtheid van de ammoniakoplossing zonder erytrocyten.:

% hemolyse=((IS₁-IS₂)/IS₃)*100;

waar E₁ - optische dichtheid van het testmonster; IS₂— blanco optische densiteit; IS₃- optische dichtheid 100 % hemolysaat.

Normaal hemolyseert niet meer dan 5 % erytrocyten.

Hem's test wordt als positief beschouwd als, indien meer gehemolyseerd dan 6 % erytrocyten.

Met paroxismale nachtelijke hemoglobinurie en hemolysinevorm van auto-immune hemolytische anemie, hemolyseert soms tot 50-80 % erytrocyten. Deze ziekten worden alleen gekenmerkt door hemolyse in aanwezigheid van niet-geïnactiveerd bloedserum. (buis nr. 2). Als seruminactivatie hemolyse niet voorkomt (buis nr. 3), het is mogelijk om de aanwezigheid van een andere vorm van hemolytische anemie aan te nemen of een fout in de formulering van het onderzoek.

Voor de vernietiging van erytrocyten bij patiënten met paroxismale nachtelijke hemoglobinurie bij pH 6,5 vereist de aanwezigheid van complement, aanwezig in vers bloedserum.

Sucrose-test voor paroxismale nachtelijke hemoglobinurie

De sucrosetest is gebaseerd op, dat erytrocyten van patiënten met paroxismale nachtelijke hemoglobinurie en hemolysine-vorm van auto-immune hemolytische anemie worden vernietigd in oplossingen met lage ionensterkte in aanwezigheid van complement.

Reagentia.

1. Sucrose-oplossing: 9,42 sucrose wordt opgelost 0,005 M fosfaatbuffer; pH 6,2 (91 ml 0,005 МNaH₂NA₄ en 9 ml 0,005 М Na₂HPO₄).
2. Reagens voor het bepalen van de concentratie van hemoglobine: 200 mg rood bloedzout opgelost in 1 Ik gedestilleerd water, voeg daar toe 0,5 ml acetoncyaanhydrine.

Methode.

Het bloed van de patiënt wordt uit een ader in twee reageerbuizen genomen - droog (8- 10ml) en met antistollingsmiddel (2- 3 ml). Natriumcitraat wordt gebruikt als antistollingsmiddel. Erytrocyten uit een reageerbuis met een antistollingsmiddel worden tweemaal gewassen met isotone natriumchloride-oplossing.. Na het wassen en opzuigen van het supernatant naar 0,4 ml erytrocyten worden toegevoegd 0,25 ml isotone natriumchlorideoplossing.

Tegelijkertijd wordt bloed afgenomen van een donor van dezelfde bloedgroep in twee buisjes - met een antistollingsmiddel (2-3ml), het wordt op dezelfde manier verwerkt, zoals het bloed van de zieken, en droog (8- 10 ml) serum te krijgen. Na scheiding van donorserum 0,5 ml wordt op een temperatuur in een waterbad geplaatst 56 ° C 30 min voor complement-inactivatie. Donorserum moet op de dag van het experiment worden ingenomen en gekoeld worden bewaard.. Het studieschema staat in de tabel.

De buizen worden in een thermostaat geplaatst voor 30 minuten bij 37 ° C, en vervolgens gecentrifugeerd voor 10 minuten bij 2000 rpm en beoordeel de mate van hemolyse.

Hiervoor worden reageerbuisjes gevuld met 3,4 ml reagens voor het bepalen van de concentratie van hemoglobine en 0,6 ml hierboven- sedimentlaag uit elke buis. Door 10 min meet de optische dichtheid van de oplossing in reageerbuizen bij 540 nm op een medische refractometer (spectrofotometer) of medische colorimeter (fotocolorimeter FEK-M) met groenfilter, het vergelijken van de verkregen gegevens met de optische dichtheid van de oplossing voor het bepalen van hemoglobine. Het gemiddelde van de twee aflezingen van elk experiment wordt genomen.. De berekening wordt gemaakt volgens de formule:

% hemolyse in vitro =((IS₁-IS₅)/(IS₈-IS₅))*100

waar E₁ is de optische dichtheid van de oplossing in reageerbuis nr. 1; IS₅ is de optische dichtheid van de oplossing in reageerbuis nr. 5, nodig om de kleur van het serum zelf te verwijderen; IS₈ is de optische dichtheid van de oplossing in reageerbuis nr. 8, waar 100% hemolyse optrad.

Voor cross-sucrosetest (buis nr. 2) 100%-en hemolyse wordt onderzocht in reageerbuis nr. 7.

Evaluatie van de resultaten.

Normaal in reageerbuis nr. 1, met erytrocyten van de bestudeerde patiënt, hemolyse niet meer dan 2-3 %.

Met paroxysmale nachtelijke hemoglobinurie en hemolysinevorm van auto-immune hemolytische anemie (AIGA) in deze buis overschrijdt hemolyse 6 % In controlebuizen - Nr. 4, met erytrocyten van de patiënt en geïnactiveerd bloedserum van de donor, flacon nr. 5, met erytrocyten en bloedserum van een donor, en nummer 6, met isotone natriumchloride-oplossing in plaats van serum - hemolyse mag niet hoger zijn dan 1-2 %.

Kruis sucrose-test (buis nr. 2) met hemolysinevorm van AIHA meestal positief (in aanwezigheid van hemolysinen in het bloedserum), maar het kan ook negatief zijn.. In vitro Nee. 3 (erytrocyten en serum van de patiënt) hemolyse treedt op zoals bij PNH, en in de hemolysinevorm van AIHA. Bij paroxismale nachtelijke hemoglobinurie wordt maximale hemolyse gevonden in een routinematig sucrosemonster. (buis nr. 1), minder uitgesproken - in het monster met de eigen erytrocyten van de patiënt (buis nr. 3); geen hemolyse in de cross-sucrosetest (buis nr. 2).

Met hemolysinevorm van AIHA de meest uitgesproken hemolyse wordt gedetecteerd in een monster met het eigen bloedserum en erytrocyten van de patiënt (buis nr. 3), iets minder uitgesproken - in reageerbuis nr. 1. In vitro Nee. 2 hemolyse komt vaak voor, maar de afwezigheid ervan sluit de hemolysinevorm van AIHA niet uit.