Zytochemische Untersuchung des Ejakulats

Zytochemische Reaktions, mit dem Ejakulat durchgeführt, liefert Erkenntnisse über die chemische Zusammensetzung und die funktionelle Aktivität der Zellen.

Bestimmung der Aktivität der sauren Phosphatase von Ejakulat

Die Aktivität der sauren Phosphatase in einem Ejakulat ist ein Vielfaches größer ist als seine Aktivität im Blut. Saure Phosphatase ist Teil der Prostatasekreten, seine Produktion von männlichen Hormonen stimuliert Gonadotropin. Unter Verwendung der zytochemischen Reaktionen ist es in Spermatozoen nachgewiesen und anderen Zellen Ejakulat. seine Aktivität bestimmt von Goldberg - Barca.

Reagenzien.

1. Formalin Alkohol (Ein Teil des fertigen 40 % Formalin in neun Teile gelöst, 96% Ethylalkohol).

2. Pararozanilin: 1 g basisches Fuchsin zu Huff- sinosernistoy Säure wird während der Erwärmung gelöst in 25 ml 2 N Salzsäure; gekühlt, gefiltert und in einem Kühlschrank aufbewahrt. Reagenz beständig.

3. Eine wässrige Lösung von Natriumnitrat 4 %. 4. Eine Lösung von Methylgrün für Acetatpuffer 2 % (pH - 5). Die resultierende Lösung wurde mit Chloroform gewaschen, dann etwa gleiche Mengen an Chloroform vermischt und 2 % Methyl grüne Lösung. den ganzen Tag getrommelt, und dann in der purpurroten Farbe gefärbt wurde Chloroform entfernt, um einen Scheidetrichter unter Verwendung von.

5. Inkubatsionnaya Umwelt, bestehend aus zwei Komponenten.

• Eine Komponente: 20 mg Naphthol-A5-phosphat wurde gelöst in 0,5 (0,3) ml Dimethylformamid, hinzufügen 40 ml 0,1 N Natriumacetatlösung und durch Filterpapier filtriert,; in der Studie Tag vorbereitet.
• Die Komponente B: 8 Tropfen 4 % Natriumnitrat-Lösung wurde gemischt mit 8 Tropfen pararozanilina; hotovyat ex tempore. Für Inkubationsmedium beiden Komponenten in Kombination (pH-Wert 5,2-5,4). Falls erforderlich, pH-Wert korrekt oder 50 % Essigsäure, oder eine Ätzalkalilösung.

Verfahren. Frische Ejakulat zentrifugiert, wenn eine große Anzahl von Spermien tun, ohne Zentrifugation. Vom Niederschlag hergestellt poliertes Glas dünne Ausstrichen, dass, wie Blutflecken, an der Luft getrocknet. Weiterer festen getrockneter Abstrich, indem sie in einem Becherglas mit Formalin in Alkohol eingetaucht 30 von (nicht mehr) und mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann werden die Abstriche in einem Becherglas mit Inkubationsmedium eingetaucht und in einem Thermostat bei einer Temperatur platziert 37 ° C 2 Nein. Danach wurden sie in destilliertem Wasser gespült, in der eingetaucht 10 min in einem Becherglas mit einer Lösung aus Methylgrün (für die Kerne counterstained), schnell mit Wasser abgewaschen, mit Filterpapier getrocknet und durch Eintauchen Mikroskopsystem untersucht.

saure Phosphatase-Aktivität kann durch die durchschnittliche Koeffizient zytochemischen ausgedrückt werden (SCK) auf semi-quantitativer Astaldi-Verga. nach der Formel

SCK =(3*a + b + 2 * 1 * in)/100

wobei die Zahlen im Zähler bezieht sich auf die Farbintensität (Maximum - 3, mäßig - 2, Next - 1), und die Buchstaben - für den Prozentsatz der gezählten Zellen spezifische Farbintensität; Abbildung 100 der Nenner - die Gesamtzahl der Zellen gezählt.

Zum Beispiel, angesehen 100 Zelle, von denen eine maximale Farbintensität 20 Zelle, mäßig - 20 und mit dem folgenden - 60 Zelle. hier:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6

Die Spermatozoen saure Phosphatase ist ein einziges großes Pellet der rot-orange Farbe auf der Oberseite des Kopfes Abteilung.

Chromatin besetzten Teil des Kopfes ist grün und enthält keine saure Phosphatase.

Diffuse blasse Farbe auf saure Phosphatase ist um den unteren Teil des Kopfes detektiert, und erstreckt sich manchmal auf den Hals des Spermiums. Mittel cytochemischer Faktor saure Phosphatase Spermien im Ejakulat ist normalerweise 2,0-2,4.

Im Zytoplasma der Zellen in der Spermatogenese ergab Cluster von Granulaten, hell in einem bestimmten gemalt (rot-orange) Farbe. Die Stützzellen Hodenkanälchen gewunden, oft stark für saure Phosphatase positiv gefärbt, transluzenten nicht gefärbter Kopf (xromatin) Sperma. Histiozyten und Makrophagen enthalten einige Körner, positiv auf saure Phosphatase gemalt. In wenigen Lymphozyten, und manchmal in neutrophilen Granulozyten sind einzelne Pellets, mit der Aktivität von saurer Phosphatase.

Definition Aktivitäten suktsinatdegidrogenazы (SDG) in einem Ejakulat

Suktsinatdegidrogenaza - Enzyme, Teilnahme an Redox-Reaktionen, Es wird in den Samenzellen in großer Zahl enthält. Allerdings hat sich die Natur zu verändern ihre Aktivität in verschiedenen pathologischen Prozessen nicht ausreichend untersucht worden. Succinat-Dehydrogenase-Aktivität in den Zellen wird durch einen modifizierten Methode bestimmt Nartsissova.

Reagenzien.

1. Aceton-Trilon (Aceton - 60 ml, destilliertem Wasser - 40 ml, Trilon B - 250 mg).

2. Eine Lösung von Methylgrün 2 % (die gleiche Farbstoff, die für die saure Phosphatase verwendet).

3. Inkubatsionnaya Umwelt, bestehend aus den folgenden Komponenten:

und) Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2-7,4) - 10 ml;

bis) 5,4 % Natriumsuccinat - 10 ml;

in) Complexon III (13 mg, verdünnt in 5 ml destilliertem Wasser);

g) destilliertem Wasser - 5 ml;

d) Nitrotetrazolium lila (10 mg, verdünnt in 10 ml Wasser).

Alle Komponenten sind in einem Paket gemischt und in einem Kühlschrank aufbewahrt. Vorbereitet Medium kann wiederverwendet werden - für 10 Tage oder mehr.

Verfahren. Abstriche, aus einem Ejakulat zubereitet, in Aceton fixiert for-Trilon 30 von, mit destilliertem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Dann werden die Abstriche in Inkubationsmedium eingetaucht und in einem Thermostat bei einer Temperatur platziert 37 ° C 1 Nein, wonach sie mit destilliertem Wasser und dokrashivayut Methylgrün gewaschen 10 m. Dann wieder schnell mit Wasser gewaschen, mit Filterpapier getrocknet und durch Eintauchen Mikroskopsystem untersucht.

normale Spermien besitzen eine hohe Aktivität der Succinat-Dehydrogenase, durch große blau-lila Körnchen vertreten, dass, zusammen~~POS=TRUNC, bildet eine feste Masse, Füllstutzen des Spermiums, einige Spermien einzelne Perlen werden um den Kopf gefunden.

miteinander verschmolzen Granulat berechnen ist nicht möglich, Daher ist für die Aktivität von Succinat-Dehydrogenase gefärbten Teil des Spermas Bestimmung in Mikrometern gemessen. Gemäß einer spezifischen Länge des farbigen Bereichs auf Succinatdehydrogenase Spermien beurteilen den Grad der Enzymaktivität in den Spermien. eine Okularmikrometer verwenden und eine objektMikroMeter Länge ist speziell in dem gefärbten Teil gemessen 100 Spermatozoen. Faltlänge in gefärbten Schnitten von Spermatozoen gezählt, und Dividieren des resultierenden Abbildung durch 100, erhaltene Durchschnittslänge, exprimierenden suktsinatdegidrogenaznuyu Aktivität für ein Spermium. Normalerweise ist es 4,3 ± 0,7 mm. Eine solche Zählung LDH-Aktivität ist sehr informativ und ist daher für den Einsatz in Forschungszwecke empfohlen.

Für einen breiten Einsatz in der Praxis dieser Methode ist ziemlich kompliziert, bevorzugt, die Menge von Succinat-Dehydrogenase auszudrücken Astaldi-Methode Verga. Mitte cytochemischer LDH Spermien-Verhältnis in einem normalen Ejakulat 2,7 ± 0,3.

Die Zellen der Spermatogenese LDH-Aktivität in der Form von großen Clustern von blau-violetter Granula detektiert, verschmelzenden oft in großen Klumpen, die in verschiedenen Teilen des Cytoplasmas befinden. Mittel cytochemischer Faktor in der Spermatogenese erreicht Zellen 2,0. Als Reifung der Samenzellen und erhöht die Aktivität von LDH in reifen Spermatozoen überschreitet 2,0. Im Zytoplasma einzelner Lymphozyten Kroketten SDG gefunden.

Bestimmung der Peroxidase-Aktivität im Ejakulat

die Spermatozoen, Spermatogenese und Stützzellen gewundenen Hodenkanälchen Peroxidase offline.

Die neutrophilen Granulozyten Ejakulat Peroxidase-Aktivität wird in signifikantem Ausmaß exprimiert und kann variieren von der Art des pathologischen Prozesses in Abhängigkeit, sowie im peripheren Blut. Die Höhe der Peroxidase-Aktivität in neutrophilen Granulozyten wichtig, ihren funktionellen Status und Aktivität der Entzündung in den männlichen Fortpflanzungsorganen zu beurteilen. Färbende Ausstriche Ejakulat von Graham-Knoll und Abrechnungs Aktivität des Enzyms durch Astaldi-Verga sind ähnlich Blutausstrichen.

Die Peroxidase-Aktivität in Samenzellen wird bestimmt durch Verfahren von Graham-Knoll.

Reagenzien.

1. Formalin Alkohol (gleich, und dass die saure Phosphatase).

2. Peroksidaznыy Reagenz: ʙenzidin (an der Spitze einer Skalpell) gelöst in 6 ml 96 % Ethylalkohol, hinzufügen 4 ml destilliertem Wasser 0,02 ml 3 % Wasserstoffperoxid. Das Reagenz ist verwendbar innerhalb von 5-6 Tagen.

3. Romanovsky Farbstoff in 1-2 verdünnt Tropfen auf 1 ml destilliertem Wasser.

Verfahren. Frischsamenabstrichen fixiert wurden 30 Formalin mit Alkohol, mit fließendem Wasser gewaschen und getrocknet, wobei. Dann goss die Abstrichen Peroxidase-Reagenz bei 5-7 Minuten, sorgfältig gewaschen mit fließendem Wasser und trocknete. Danach wird dokrashivayut sie 15- 20 min Farbstoff Romanowskij, mit fließendem Wasser gewaschen, getrocknet und das Tauch mikroskopiruyut Mikroskopsystem unter Verwendung von.

Als positive Reaktion neutrophilen Granulozyten an Peroxidase wird in den großen goldbraun Körnchen in großer Zahl nachgewiesen. Mit einer großen Anzahl von Zellen müssen zählen Durchschnittskoeffizient zytochemischen (SCK). Im Cytoplasma von Histiozyten einzelne Peroxidase in Form von kleinen Aggregaten wie Pellets enthaltenen.

Bestimmung von Glykogen im Ejakulat

Änderungen in Glykogen in verschiedenen Zellen beziehen sich auf deren Funktion oder Beweise für die Entwicklung des pathologischen Prozesses. Bestimmung von Glykogen in den Zellen erfolgt Verfahren Mak-Manus.

Reagenzien.

1. Eine wässrige Lösung von Periodsäure 1 % (Vorbereitung zu verwenden).

2. Sernistaya Wasser: 5 ml 10 % Kaliummetabisulfit oder Natrium, 5 ml 1 N Salzsäure, Wasser 100 ml (Vorbereitung zu verwenden).

3. Reagenz Shiffa: 1 g basisches Fuchsin für fuksinosernistoy Säure, in einem Porzellanmörser vorzerkleinert, unter konstantem Rühren gelöst für 5 Minuten in 200 ml kochendem destilliertem Wasser, durch einen Papierfilter filtriert und wurde unter Kühlen zugegeben, um 50 ° C 20 ml 1 N Salzsäure, und bei Abkühlung auf 25 ° C - 1 g Kaliummetabisulfit oder Natrium. Vorbereitete Reagenz wird im Kühlschrank aufbewahrt 24 h, wonach sie gebleicht wird und für den Verzehr ungeeignet geworden vitsya

4.Eine wässrige Lösung von Methylgrün 2 %, mit Chloroform ausgewaschen

5.Chemisch reiner Methylalkohol.

Verfahren.

Dünn getrocknet Spermium Ausstriche für chemisch reinen Methylalkohol festen 3 m, mit destilliertem Wasser abgespült und in einem Becherglas eingetaucht 1 % wässrige Jodsäure 5 m. Dann wurden die Ausstriche mit destilliertem Wasser gewaschen, getrocknet, schweflige in Wasser gespült und getrocknet wieder.

Ferner in einer Tasse mit Schiffs-Reagenz getaucht Tupfer zu 15 m, spülen sie in drei Portionen Wasser schweflige (auf 3 min je), gewaschen 10 min in Wasser und dokrashivayut Zellkern 3 min Methylgrün. Dann wieder mit Wasser gespült Abstrichen, mit Filterpapier getrocknet und durch Eintauchen Mikroskopsystem mikroskopiruyut.

In reifen Spermatozoen Glykogen offline. Im Zytoplasma der jungen Spermien, vor allem mit dem „Kragen“, ergab Spuren von Glykogen (±), manchmal in Form von einzelnen Pellets in dem oberen Teil des Kopfes oder die „Kragen“ -Region.

Die Zellen der Spermatogenese Glykogen wird in großen Mengen in Form einer kirschroten Körnchen gefunden, zapolnyayuschyh gesamte Zytoplasma. Als Zellreifung Glykogen verlieren in reifen Spermatozoen zu seinem Verschwinden auf. Spermatozyten soderzhat Glykogen nicht nur im Zytoplasma, sondern auch im Kern. Die Stützzellen Hodenkanälchen in Form von Glykogen gewunden sind kirschrote Körnchen und diffus. Ältere neutrophilen Granulozyten im Ejakulat, sowie in peripheren Blutausstrichen, enthalten eine erhebliche Menge an Glykogen. Bei der chronischen Prostatitis in Ejakulat neutrophilen Granulozyten erhöht signifikant die Menge an Glykogen und erhöht die Aktivität von Peroxidase. In isolierten Lymphozyten normalerweise manchmal gibt es Glykogengranula.

Makrophagen Spuren von Glykogen Hintergrund schmiert Sperma in kirschroter Farbe gefärbt, daß das Vorhandensein von Plasma, Ejakulat eine große Menge an Glykosaminoglykanen (mukopolisaxaridov).

Bestimmung von Ribonukleinsäure (RNA) in einem Ejakulat

Das erhöhte RNA-Gehalt der Zellen Es zeigt eine hohe Aktivität in Bezug auf ihr Wachstum, sekretorischen, synthetische und andere Aktivitäten. Reduzierte RNA-Gehalt in den jungen Zellen sind oft mit einer reduzierten Fähigkeit dieser Zellen assoziiert zu regenerieren. RNA-Gehalt in den Zellen bestimmt das Verfahren der Chicken Coop.

Reagenzien.

1. Reagenz Chicken Coop: separat hergestellt 2 % Lösungen von Methylgrün und pironin, Methyl grüne Lösung wurde gründlich mit Chloroform gewaschen; Farbstoff-Arbeitslösung wird hergestellt durch Mischen von 2 % Lösung pironin (12,5 ml) und 2 % Methyl grüne Lösung (7,5 ml) mit dem Zusatz von 30 ml destilliertem Wasser. Die farbstoffbeständig, im Kühlschrank gelagert.

2. Latch - chemisch reinen Methylalkohol.

Verfahren. Ausstriche mit Methanol fixiert für 3 m, Farbstoff-Arbeitslösung Pyronin-methyl grün 15 m, schnell mit Wasser gespült und mit Filterpapier getrocknet. Mikroskopiruyut unter Verwendung des Eintauchens Mikroskopsystem. RNA pironin gemalt in leuchtend roter Farbe, Zellkerne - Methyl grün zu grün.

Reifes Sperma enthalten keine RNA. Die Zellen der Spermatogenese reiche RNA, deren Höhe verringert sich in den Zellen, wie sie reifen. in spermatohonyy Zytoplasma reiche rosa Farbe, in spermatotsytov sie ist bleich, und in Spermatiden blassrosa. Bei jungen Spermien mit dem „Kragen“ rosa lackiert überwiegend «Kragen».

Sperma, sind in der Endphase seiner Entwicklung, in den Stützzellen der gewundenen Hodenkanälchen verlieren die Reste einer rosafarbenen Substanz (RNA) und zu reifen Spermien.

In spermatogenic Zellen enthält große Mengen von Glykogen, RNA und LDH-Aktivität deutlich ausgedrückt und CF. Aber, meistens, diese Zellen werden im Ejakulat isoliert, deshalb unpraktisch Zählung LZC. In diesen Fällen beschränkt sich auf die Erzählform des Abschlusses.

Zytochemische Charakterisierung von Leukozyten Es ist ein wichtiger Indikator für ihre funktionelle Aktivität. Zählen der Anzahl der Leukozyten im Ejakulat Substanz in derselben gehalten, Wie auch in anderen Zellen, Sperma und im peripheren Blut.

Bei herkömmlichen Verfahren gefärbten Ausstrichen Ejakulat (azurozinovymi Mischungen, Hämatoxylin-Eosin und andere.), sowie in nativen Präparate sind nicht immer leicht Leukozyten zu unterscheiden, Zellen der Spermatogenese, Epithel der Prostata, Histiozyten und andere Elemente.

Zytochemischen Verfahren in Verbindung mit morphologischen helfen oft die Art von Zellen herzustellen. Also, ausgedrückt Peroxidase-Aktivität, sofern große goldbraune Granula, zapolnyayuschymy Zytoplasma aller Zellen, charakteristisch für reife Neutrophilen, in anderen Zellen solche Reaktion nicht beobachtet wird,. Schwere Reaktion auf Glykogen ist typisch für neutrophile Granulozyten und unreifen Keimzellen, aber diese nicht Peroxidase-Aktivität haben. RNA in den Zellen und die Spermatogenese keine reifen Granulozyten enthalten. spermatogenic Zellen haben eine ausgeprägte Reaktion auf die saure Phosphatase, und neutrophilen Granulozyten, äußerte sie sehr schlecht, und so weiter. d.