Цитохимическое исследование эякулята

Цитохимические реакции, проводимые с эякулятом, позволяют судить о химическом составе и функциональной активности его клеток.

Определение активности кислой фосфатазы эякулята

Активность кислой фосфатазы в эякуляте во много раз превышает ее активность в крови. Кислая фосфатаза входит в состав секрета предстательной железы, продукция ее стимулируется мужскими гонадотропными гормонами. С помощью цитохимических реакций она выявляется в сперматозоидах и других клетках эякулята. Активность ее определяется методом Гольдберга — Барка.

Реактивы.

1. Формалиновый спирт (одну часть готового 40 % формалина растворяют в девяти частях 96% этилового спирта).

2. Парарозанилин: 1 г основного фуксина для фук- синосернистой кислоты растворяют при подогревании в 25 мл 2 н соляной кислоты; охлаждают, фильтруют и хранят в холодильнике. Реактив стойкий.

3. Водный раствор нитрата натрия 4 %. 4. Раствор метилового зеленого на ацетатном буфере 2 % (pH — 5). Полученный раствор промывают хлороформом, для чего смешивают приблизительно равные количества хлороформа и 2 % раствора метилового зеленого. Многократно взбалтывают в течение дня, а затем окрасившийся в фиолетовый цвет хлороформ Удаляют с помощью делительной воронки.

5. Инкубационная среда, состоящая из двух компонентов.

• А-компонент: 20 мг нафтол-А5-фосфата растворяют в 0,5 (0,3) мл диметилформамида, добавляют 40 мл 0,1 н раствора ацетата натрия и фильтруют через бумажный фильтр; готовят в день исследования.
• Б-компонент: 8 капель 4 % раствора нитрата натрия смешивают с 8 каплями парарозанилина; готовят ex tempore. Для получения инкубационной среды оба компонента соединяют (pH 5,2—5,4). При необходимости pH исправляют либо 50 % уксусной кислотой, либо раствором едкой щелочи.

Методика. Свежий эякулят центрифугируют, при большом количестве сперматозоидов обходятся без центрифугирования. Из осадка готовят шлифованным стеклом тонкие мазки, которые, как и мазки крови, высушивают на воздухе. Далее высушенные мазки фиксируют путем погружения их в стаканчик с формалиновым спиртом на 30 с (не более) и промывают дистиллированной водой. Затем мазки погружают в стаканчик с инкубационной средой и помещают в термостат при температуре 37 °С на 2 ч. После этого их ополаскивают в дистиллированной воде, погружают на 10 мин в стаканчик с раствором метилового зеленого (для докрашивания ядер), быстро смывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и исследуют с помощью иммерсионной системы микроскопа.

Активность кислой фосфатазы можно выразить с помощью среднего цитохимического коэффициента (СЦК) по полуколичественному методу Астальди—Верга. Согласно формуле

СЦК=(3*а+2*б+1*в)/100

где цифры в числителе указывают на интенсивность окраски (максимальная — 3, умеренная — 2, следы — 1), а буквы — на процентное содержание сосчитанных клеток определенной интенсивности окраски; цифра 100 в знаменателе — общее количество сосчитанных клеток.

Например, сосчитано 100 клеток, из них с максимальной интенсивностью окраски 20 клеток, с умеренной — 20 и со следами — 60 клеток. Отсюда:

СЦК=(3*20+2*20+1*60)/100=1,6

В сперматозоидах кислая фосфатаза располагается в виде единичных крупных гранул красно-оранжевого цвета в верхнем отделе головки.

Занятая хроматином часть головки окрашена в зеленый цвет и не содержит кислой фосфатазы.

Более бледная диффузная окраска на кислую фосфатазу выявляется вокруг нижней части головки, а иногда распространяется и на шейку сперматозоида. Средний цитохимический коэффициент кислой фосфатазы сперматозоидов в нормальном эякуляте составляет 2,0—2,4.

В цитоплазме клеток сперматогенеза обнаруживаются скопления гранул, ярко окрашивающихся в специфический (красно-оранжевый) цвет. В поддерживающих клетках извитых семенных канальцев, часто резко положительно окрашенных на кислую фосфатазу, просвечиваются неокрашенные головки (хроматин) сперматозоидов. Гистиоциты и макрофаги содержат немногочисленные гранулы, положительно окрашенные на кислую фосфатазу. В единичных лимфоцитах, а иногда и в нейтрофильных гранулоцитах встречаются отдельные гранулы, обладающие активностью кислой фосфатазы.

Определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в эякуляте

Сукцинатдегидрогеназа — фермент, участвующий в окислительно-восстановительных реакциях, содержится в клетках эякулята в значительном количестве. Однако характер изменения ее активности при различных патологических процессах еще недостаточно хорошо изучен. Активность сукцинатдегидрогеназы в клетках определяется модифицированным методом Нарциссова.

Реактивы.

1. Ацетон-трилон (ацетон — 60 мл, дистиллированная вода — 40 мл, трилон Б — 250 мг).

2. Раствор метилового зеленого 2 % (тот же краситель, который используется для кислой фосфатазы).

3. Инкубационная среда, состоящая из следующих компонентов:

а) фосфатного буфера (pH 7,2—7,4) — 10 мл;

б) 5,4 % раствора сукцината натрия – 10 мл;

в) трилона Б (13 мг разводят в 5 мл дистиллированной воды);

г) воды дистиллированной — 5 мл;

д) нитротетразолия фиолетового (10 мг разводят в 10 мл воды).

Все компоненты смешивают в одном флаконе и хранят в холодильнике. Готовая среда может использоваться многократно — в течение 10 дней и более.

Методика. Мазки, приготовленные из эякулята, фиксируют в ацетон-трилоне в течение 30 с, промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Затем мазки погружают в инкубационную среду и помещают в термостат при температуре 37 °С на 1 ч, после чего их промывают дистиллированной водой и докрашивают метиловым зеленым в течение 10 мин. Далее снова быстро промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и исследуют с помощью иммерсионной системы микроскопа.

Нормальные сперматозоиды обладают высокой активностью сукцинатдегидрогеназы, представленной крупными сине-фиолетовыми гранулами, которые, сливаясь между собой, образуют плотную массу, заполняющую шейку сперматозоида, у некоторых сперматозоидов отдельные гранулы встречаются и вокруг головки.

Подсчитать слившиеся друг с другом гранулы не представляется возможным, поэтому для определения активности сукцинатдегидрогеназы окрашенную часть сперматозоидов измеряют в микрометрах. По длине специфически окрашенной на сукцинатдегидрогеназу части сперматозоида судят о степени активности фермента в этом сперматозоиде. С помощью окуляр-микрометра и объект-микрометра измеряется длина специфически окрашенной части в 100 сперматозоидах. Сложив длину окрашенных участков в подсчитанных сперматозоидах и разделив полученную цифру на 100, получают среднюю длину, выражающую сукцинатдегидрогеназную активность для одного сперматозоида. В норме она составляет 4,3±0,7 мкм. Такой подсчет активности СДГ наиболее информативен и поэтому рекомендуется для использования в научных целях.

Для широкого применения в практике этот метод довольно сложен, предпочтительнее выражать количество сукцинатдегидрогеназы по методу Астальди—Верга. Средний цитохимический коэффициент СДГ сперматозоидов в нормальном эякуляте составляет 2,7 ±0,3.

В клетках сперматогенеза активность СДГ выявляется в виде скоплений крупных сине-фиолетовых гранул, часто сливающихся в крупные глыбки, располагающиеся в различных участках цитоплазмы. Средний цитохимический коэффициент в клетках сперматогенеза не достигает 2,0. По мере созревания клеток эякулята активность СДГ нарастает и в зрелых сперматозоидах превышает 2,0. В цитоплазме отдельных лимфоцитов обнаруживаются крупные гранулы СДГ.

Определение активности пероксидазы в эякуляте

В сперматозоидах, клетках сперматогенеза и поддерживающих клетках извитых семенных канальцев пероксидаза отсутствует.

В нейтрофильных гранулоцитах эякулята активность пероксидазы выражена в значительной степени и может изменяться в зависимости от характера патологического процесса, так же как и в периферической крови. Уровень активности пероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах важен для оценки их функционального состояния и активности воспалительного процесса в мужских половых органах. Окраска мазков эякулята по Грэму—Кноллю и учет активности фермента по Астальди—Вергу проводятся аналогично мазкам крови.

Активность пероксидазы в клетках эякулята определяется по методу Грэма—Кнолля.

Реактивы.

1. Формалиновый спирт (тот же, что и для кислой фосфатазы).

2. Пероксидазный реактив: бензидин (на кончике скальпеля) растворяют в 6 мл 96 % этилового спирта, добавляют 4 мл дистиллированной воды и 0,02 мл 3 % перекиси водорода. Реактив годен к употреблению в течение 5—6 дней.

3. Краситель Романовского в разведении 1—2 капли на 1 мл дистиллированной воды.

Методика. Свежие мазки эякулята фиксируют в течение 30 с формалиновым спиртом, промывают проточной водой и высушивают. Затем мазки заливают пероксидазным реактивом на 5—7 мин, тщательно промывают в проточной воде и высушивают. После этого их докрашивают 15— 20 мин красителем Романовского, промывают проточной водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа.

При положительной реакции на пероксидазу в нейтрофильных гранулоцитах обнаруживаются крупные золотисто-коричневые гранулы в значительном количестве. При большом количестве лейкоцитов необходимо подсчитывать средний цитохимический коэффициент (СЦК). В цитоплазме отдельных гистиоцитов пероксидаза содержится в виде небольших скоплений таких же гранул.

Определение гликогена в эякуляте

Изменения содержания гликогена в различных клетках отражаются на их функции или свидетельствуют о развитии патологического процесса. Определение гликогена в клетках проводится методом Мак-Мануса.

Реактивы.

1. Водный раствор йодной кислоты 1 % (готовится перед употреблением).

2. Сернистая вода: 5 мл 10 % метабисульфита калия или натрия, 5 мл 1 н соляной кислоты, вода до 100 мл (готовится перед употреблением).

3. Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина для фуксиносернистой кислоты, предварительно растертого в фарфоровой ступке, растворяют при постоянном встряхивании в течение 5 мин в 200 мл кипящей дистиллированной воды, пропускают через бумажный фильтр и добавляют при охлаждении до 50 °С 20 мл 1 н соляной кислоты, а при охлаждении до 25 °С — 1 г метабисульфита калия или натрия. Приготовленный реактив выдерживают в холодильнике в течение 24 ч после чего он просветляется и стано вится пригодным для употребления

4.Водный раствор метилового зеленого 2 %, промытый хлороформом

5.Химически чистый метиловый спирт.

Методика.

Тонкие высушенные мазки эякулята фиксируют химически чистым метиловым спиртом в течение 3 мин, ополаскивают дистиллированной водой и опускают в стаканчик с 1 % водным раствором йодной кислоты на 5 мин. Затем мазки промывают дистиллированной водой, высушивают, ополаскивают в сернистой воде и снова высушивают.

Далее опускают мазки в стаканчик с реактивом Шиффа на 15 мин, ополаскивают их в трех порциях сернистой воды (по 3 мин в каждой), промывают 10 мин в воде и докрашивают ядра клеток 3 мин метиловым зеленым. После этого снова ополаскивают мазки водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с помощью иммерсионной системы микроскопа.

В зрелых сперматозоидах гликоген отсутствует. В цитоплазме молодых сперматозоидов, особенно с «воротничком», выявляются следы гликогена (±), иногда в виде единичных гранул в верхней части головки или в области «воротничка».

В клетках сперматогенеза гликоген обнаруживается в большом количестве в виде вишнево-красных гранул, заполняющих всю цитоплазму. По мере созревания клетки теряют гликоген вплоть до исчезновения его в зрелых сперматозоидах. Сперматоциты содержат гликоген не только в цитоплазме, но и в ядре. В поддерживающих клетках извитых семенных канальцев гликоген располагается в виде вишнево-красных гранул и диффузно. Зрелые нейтрофильные гранулоциты в эякуляте, как и в мазках периферической крови, содержат значительное количество гликогена. При хроническом простатите в нейтрофильных гранулоцитах эякулята значительно возрастает количество гликогена и повышается активность пероксидазы. В единичных лимфоцитах в норме иногда встречаются гранулы гликогена.

Макрофаги содержат следы гликогена Фон мазков эякулята окрашивается в вишнево-красный цвет, что свидетельствует о наличии в плазме эякулята большого количества гликозаминогликанов (мукополисахаридов).

Определение рибонуклеиновой кислоты (РНК) в эякуляте

Повышенное содержание РНК в клетках свидетельствует о высокой активности их в отношении роста, секреторной, синтетической и другой деятельности. Снижение содержания РНК в молодых клетках часто сопряжено с пониженной способностью этих клеток к регенерации. Содержание РНК в клетках определяется методом Курника.

Реактивы.

1. Реактив Курника: готовят отдельно 2 % растворы метилового зеленого и пиронина, раствор метилового зеленого тщательно промывают хлороформом; рабочий раствор красителя приготавливают путем смешивания 2 % раствора пиронина (12,5 мл) и 2 % раствора метилового зеленого (7,5 мл) с добавлением 30 мл дистиллированной воды. Краситель стойкий, хранится в холодильнике.

2. Фиксатор — химически чистый метиловый спирт.

Методика. Мазки фиксируют метиловым спиртом в течение 3 мин, окрашивают рабочим раствором пиронин-метилового зеленого 15 мин, быстро ополаскивают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа. РНК окрашивается пиронином в ярко-красный цвет, ядра клеток — метиловым зеленым в зеленый.

Зрелые сперматозоиды не содержат РНК. Клетки сперматогенеза богаты РНК, количество которой убывает в клетках по мере их созревания. У сперматогоний цитоплазма насыщенно-розового цвета, у сперматоцитов она бледнее, а у сперматид бледно-розовая. У юных сперматозоидов с «воротничком» в розовый цвет окрашивается преимущественно «воротничок».

Сперматозоиды, находящиеся на последней стадии своего развития, в поддерживающих клетках извитых семенных канальцев теряют остатки розовой субстанции (РНК) и превращаются в зрелые сперматозоиды.

В клетках сперматогенеза содержится большое количество гликогена, РНК и значительно выражена активность СДГ и КФ. Однако, как правило, эти клетки единичные в эякуляте, поэтому подсчет СЦК нецелесообразен. В таких случаях ограничиваются описательной формой заключения.

Цитохимическая характеристика лейкоцитов является важным показателем их функциональной активности. Учет количества вещества в лейкоцитах эякулята проводится так же, как и в других клетках эякулята и в периферической крови.

В окрашенных обычными методами мазках эякулята (азурозиновыми смесями, гематоксилин-эозином и пр.), а также в нативных препаратах не всегда легко различить лейкоциты, клетки сперматогенеза, эпителий предстательной железы, гистиоциты и другие элементы.

Цитохимические методы в сочетании с морфологическими нередко помогают установить вид клеток. Так, выраженная активность пероксидазы, представленной крупными золотисто-коричневыми гранулами, заполняющими всю цитоплазму клетки, характерна для зрелых нейтрофильных гранулоцитов, у других клеток такая реакция не наблюдается. Выраженная реакция на гликоген типична для нейтрофильных гранулоцитов и клеток сперматогенеза, но последние не обладают пероксидазной активностью. РНК содержится в клетках сперматогенеза и отсутствует в зрелых гранулоцитах. Клетки сперматогенеза обладают выраженной реакцией на кислую фосфатазу, а в нейтрофильных гранулоцитах она выражена очень слабо и т. д.