Ejakulat sitokimyasal çalışma

Sitokimyasal tepki, Menide yapılan, hücrelerin kendi kimyasal bileşimi ve fonksiyonel aktivite içgörüler sunar.

Asit fosfataz aktivitesi ejakülat Belirlenmesi

Asit fosfataz aktivitesi Kandaki kendi etkinliğinden daha büyük birçok kez boşalmak. Asit fosfataz prostat salgılarında parçasıdır, Üretim erkek gonadotropin tarafından uyarılır. Sitokimyasal reaksiyonları kullanarak, sperm ve Menide diğer hücrelerde tespit edilir. Etkinliği şu şekilde belirlenir onun yöntem Goldberg - Barka.

Reaktifler.

1. Formalin alkol (Hazır bir parçası 40 % Formalin dokuz parça içinde çözüldü 96% etilalkol).

2. Pararozanilin: 1 Phuc g bazik fuksin- ısıtma esnasında çözünen sinosernistoy asit 25 ml 2 N hidroklorik asit ile; soğutmalı, filtre edilmiş ve bir buzdolabı içinde depolanmıştır. Reaktif dayanıklı.

3. Sodyum nitrat sulu çözeltisi 4 %. 4. Asetat tamponu metil yeşil bir çözelti, 2 % (pH - 5). Elde edilen çözelti kloroform ile yıkanmıştır, daha sonra kloroform içinde, yaklaşık olarak eşit miktarlarda karıştırıldı ve 2 % metil yeşil çözelti. Gün boyunca Eskitme, ve daha sonra mor renkte boyanmış, kloroform bir ayırma hunisi ile ayrılmıştır.

5. Inkubatsionnaya ortamı, iki bileşenden oluşan.

• Bir bileşen,: 20 mg naftol-A5-fosfat içinde çözüldü 0,5 (0,3) mi dimetilformamid, eklemek 40 ml 0,1 N sodyum asetat solüsyonu ve bir filtre kağıdından süzülür; Bir çalışma günü hazırlanıyor.
• B-bileşeni: 8 damla 4 % Sodyum nitrat çözeltisi ile karıştırılmıştır 8 pararozanilina damla; ex tempore vardır. Kuluçka ortamı her iki bileşenini elde etmek için bağlanmıştır (pH 5,2-5,4). Gerekirse, herhangi bir pH'ı düzeltmek 50 % asetik asit, Kostik alkali bir çözelti,.

Yöntem. Taze ejakülat santrifüj edilir, olduğunda, sperm dağıtma santrifüj çok sayıda. Sedimentten parlatılmış cam ince vuruş hazırlamak, o, yanı sıra kan yayma, havada kurutulmuş. formalin alkol de bir beher onları daldırarak sabit kurutulmuş smear 30 itibaren (daha fazla yok) ve damıtılmış su ile yıkandı,. Daha sonra lekeler kuluçka ortamı ile bir çanak içinde daldırılır ve bir sıcaklıkta bir kuluçka makinesi içinde yerleştirilir 37 ° C 2 hayır. Daha sonra, damıtılmış su içinde durulanmış, daldırılan 10 metil yeşili bir solüsyonu ile bir cam dakika (çekirdekleri için zıt), hızla suyla yıkanır, filtre kağıdı ile kurutulmuş ve daldırma mikroskop sistemi ile incelenmiştir.

Asit fosfataz aktivitesi ortalama sitokimyasal faktörü ile ifade edilebilir (SCK) tarafından polukolychestvennomu yöntemi Astaldi-Verga. Formülüne göre

SCK =(3*a 2 * b a * 1)/100

Pay numaralar renk yoğunluğunu gösterir nerede (Maksimum - 3, orta - 2, Ayak izleri - 1), ve harfler - hücrelerin yüzdesi belli bir renk yoğunluğunu sayılır; şekil 100 payda - hücrelerin toplam sayısı sayılır.

Örneğin, sayılır 100 hücre, hangi bir maksimum renk yoğunluğuna sahip 20 hücre, orta - 20 ve aşağıdaki - 60 hücre. İşte:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6

ünitesinde yer alan sperm asit fosfataz kafasının üst kısmında kırmızı-turuncu tanecikleri.

Başın Meşgul kromatin kısmı yeşil ve asit fosfataz içermiyor.

Asit fosfataz üzerinde daha yaygın soluk renk kafasının alt kısmında etrafında algılandı, ve bazen sperm boynuna kadar uzanır. Normal sperm Menide asit fosfataz Orta sitokimyasal katsayısı 2.0-2.4 olduğunu.

Spermatogenez hücrelerin sitoplazması içinde tanelerin birikmesi göstermiştir, parlak, belirli bir boyalı (kırmızı-turuncu) renk. Kıvrık seminifer tübüllerin destek hücrelerde, genellikle sert bir pozitif asit fosfataz için boyandı, saydam olmayan renkli kafa (xromatin) sperm. Histiyositler ve makrofajlar birkaç granüller içerirler, pozitif asit fosfataz için boyandı. İzole edilen lenfositlerin olarak, bazen nötrofiller, bireysel peletler olan, asit fosfataz için bir aktivitesi olan.

Suksinat dehidrojenaz aktivitesinin tayini (SDG) Menide

Sukcinatdegidrogenaza - Enzim, Redoks reaksiyonları katılan, ejakülat önemli sayıda hücre içinde ihtiva. Bununla birlikte, çeşitli patolojik süreçlerde aktivitesi değişikliği doğası halen iyi anlaşılmamıştır. Hücrelerde Süksinat dehidrojenaz aktivitesi Nartsissova değiştirilmiş bir yöntemine göre tespit edilmiştir.

Reaktifler.

1. Aseton-Trilon (aseton - 60 ml, distillirovannaya su - 40 ml, Trilon B - 250 mg).

2. Metil yeşili bir çözeltisi 2 % (Aynı boya, asit fosfataz için kullanılan).

3. Inkubatsionnaya ortamı, Aşağıdaki bileşenlerden oluşan:

ve) fosfat tamponu (pH 7,2-7,4) - 10 ml;

için) 5,4 % sodyum süksinat çözümü - 10 ml;

içinde) komplekson III (13 mg seyreltildi 5 ml distile su);

g) arıtılmış su - 5 ml;

d) mor nitrotetrazolium (10 mg seyreltildi 10 ml su).

Tüm bileşenler bir paket içinde karıştırılmış ve bir buzdolabında saklanır. Hazırlanan ortam yeniden kullanılabilir - için 10 gün ya da daha fazla.

Yöntem. Smear, Menide hazırlanan, Trilon- boyunca aseton içinde bekletilir 30 itibaren, damıtılmış su ile yıkandı ve hava içinde kurutuldu,. Sonra leke kuluçka ortamına daldırılmış ve bir sıcaklıkta bir kuluçka makinesi içinde yerleştirilir 37 ° C 1 hayır, bundan sonra damıtılmış su ile ve metil yeşil dokrashivayut yıkanır 10 m. Sonra tekrar hızlı bir şekilde su ile yıkanır, filtre kağıdı ile kurutulmuş ve daldırma mikroskop sistemi ile incelenmiştir.

Normal sperm suksinat dehidrojenaz, yüksek aktiviteye sahip olan, Büyük mavi-mor granüller tarafından temsil, o, Birlikte birleştirilmesi, yoğun bir kütle oluşturmak, Boyun sperm dolum, Bazı sperm bireysel pelet başının etrafında bulunan.

Kaynaşmış bir araya granül hesaplayın mümkün değildir, Bu nedenle, mikrometre olarak ölçülen sukinat dehidrogenaz renkli kısım sperm aktivitesini belirlemek için. Sperm sukinat dehidrogenaz için özel olarak boyalı uzunluğu boyunca sperm enzim aktivitesi derecesine değerlendirilecektir. Oküler mikrometre ve nesne mikrometre uzunluğu ile özel renkli kısmında ölçülür 100 spermatozoidax. Spermatozoonların lekeli bölümlerinde sayılan uzunluğu ekleme ve sonuçta elde edilen rakam bölünmesi 100, Ortalama uzunluğu almak, tek bir sperm için suktsinatdegidrogenaznuyu faaliyeti eksprese. Normalde, 4,3 ± 0,7 m. Bu hesaplama LDH aktivitesi en bilgilendirici ve bu nedenle araştırma amaçlı kullanılması tavsiye edilir.

Uygulamada geniş bir uygulama için, bu yöntem oldukça karmaşıktır, suksinat dehidrojenaz miktarını ifade etmek için tercih edilir Astaldi metodu Verga. Ejakülatta sperm Orta sitokimyasal katsayısı LDH normal 2,7 0,3 ±.

Spermatogenez hücrelerde LDH aktivitesi, büyük mavi-mor granül kümeleri şeklinde algılanır, genellikle büyük topaklar halinde birleştirme, sitoplazma farklı alanlarda bulunan. Spermatogenez ulaşır hücrelerinde Orta sitokimyasal faktör 2,0. Ejakülat hücrelerinin olgunlaşması ve olgun sperm LDH aktivitesi aşıyor artırır 2,0. Bazı lenfositlerin sitoplazmasında mamalara SDG Bulunan.

Menide peroksidaz aktivitesinin belirlenmesi

sperm, spermatogenez hücreleri ve kıvrık seminifer tübüllerde destekleyici hücrelerin eksik peroksidaz.

nötrofilik granülositler ejakülat peroksidaz aktivitesi önemli ölçüde ifade edilir ve patolojik işlemin doğasına bağlı olarak değişebilir, ayrıca periferik kan gibi. nötrofiller peroksidaz aktivitesinin düzeyi erkek genital organlarda inflamatuvar sürecin fonksiyonel durumunu ve etkinliğini değerlendirmek için önemlidir. Semen Graham-Knoll ve Astaldi-Verga tarafından enzimin muhasebe aktivitesinin Vitray smear benzer kan yayması vardır.

Ejakülat hücrelerinde Peroksidaz etkinliği şu şekilde belirlenir Graham Knoll yöntem.

Reaktifler.

1. Formalin alkol (aynı, ve asit fosfataz bu).

2. Peroksidaznыy reajanı: ʙenzidin (Bir neşter ucunda) içinde çözüldü 6 ml 96 % etilalkol, eklemek 4 damıtılmış su mi 0,02 ml 3 % hidrojen peroksit. 5-6 gün için kullanılabilen reaktif.

3. 1-2 dilusyondaki Romanovský Boya damlaları 1 ml distile su.

Yöntem. Smear fikse edildi Taze semen 30 alkol ile, formalin, su ile yıkandı ve kurutuldu. Sonra 5-7 dakika vuruşları peroksidaz ayıracı dökmek, İyice akan suda yıkandı ve kurutuldu. Bundan sonra 15 dokrashivayut 20 dk boya Romanovský, çalışan, su ile yıkandı,, kurutuldu ve mikroskopiruyut immersiyon sistemi kullanılarak.

Nötrofilik granülositlerde peroksidaz pozitif tepki çok sayıda önemli altın-kahverengi granüller ortaya zaman. Hesaplamak için gerekli olan beyaz kan hücresi sayısı ile büyük bir Ortalama sitokimyasal faktör (SCK). histiyositler bireysel peroksidaz sitoplazma gibi granül gibi küçük kümeler halinde mevcut olduğu.

Menide glikojen Belirlenmesi

Çeşitli hücre glikojen içerik değişiklikler işlevini ya da patolojik sürecin gelişiminin kanıtı etkileyen. Hücrelerde glikojen tayini gerçekleştirilir McManus tarafından.

Reaktifler.

1. Periyodik asit sulu çözeltisi 1 % (kullanmak için hazırlanıyor).

2. Sernistaya su: 5 ml 10 % potasyum ya da sodyum metabisülfit, 5 ml 1 N hidroklorik asit ile, su 100 ml (kullanmak için hazırlanıyor).

3. Reaktif Shiffa: 1 fuksinosernistoy asit g bazik fuksin, porselen bir havanda önceden ezilmiş, sabit çalkalama altında eritilir 5 dk 200 kaynamakta olan damıtık suya mi, bir kağıt filtre içinden geçirilmiş ve soğutma ile ilave edildi 50 ° C 20 ml 1 N hidroklorik asit ile, ve soğutulduğunda 25 ° C - 1 g potasyum ya da sodyum metabisülfit. Hazırlanan reaktif boyunca buzdolabında tutulur 24 h sonra o aydınlanmış ve tüketim vitsya için elverişsiz hale

4.metil yeşili sulu çözeltisi 2 %, kloroform ile yıkandı

5.Kimyasal olarak saf metil alkol.

Yöntem.

İnce kurutulmuş smear için kimyasal olarak saf metil alkol tespit ejakülat 3 m, damıtılmış su ile durulanmış ve bir beher içinde daldırılmış 1 % sulu iyodik asit 5 m. Daha sonra lekeler, distile su ile yıkandı,, kurutulmuş, sülfürlü yeniden su içinde durulanmış ve kurutulmuştur.

Için Schiff reaktifi ile bir fincan batırılmış Ek bezlerden 15 m, Kükürtlü üç kısım su ile durulayın (tarafından 3 dk her), yıkanmış 10 Su ve hücre çekirdekleri dokrashivayut dak 3 dk metil yeşil. Sonra tekrar su bezlerden ile durulanır, Kağıt filtre ve daldırma sistemi mikroskop kullanılarak mikroskopiruyut kurutulmuş.

Olgun sperm glikojen eksik. Genç sperm sitoplazmasında, özellikle "yaka" ile, glikojen ortaya izleri (±), Bazen kafa üst kısmında ya da "yaka" bireysel peletler şeklinde.

Spermatogenez hücrelerde Glikojen kiraz kırmızısı bir granül formunda büyük miktarlarda bulunur, tüm sitoplazma doldurur. Hücrelerin olgunlaşması ile olgun sperm onun kaybolana kadar glikojen kaybetmek. Spermatocitы Glikojen sitoplazmada da içermektedir, aynı zamanda çekirdekte. Kıvrık seminifer tübüllerin destek hücrelerde, glikojen kiraz kırmızısı granüller ve yaygın olduğunu. Menide Olgun nötrofilik granülositler, yanı sıra periferik kan yayması gibi, glikojen önemli bir miktarını ihtiva. Nötrofil granülositler ejakülat önemli ölçüde artar glikojen miktarı ve kronik prostatit peroksidaz aktivitesini artırır. İzole lenfositler bazen normal glikojen granülleri bulunur.

Makrofajlar kiraz kırmızısı renkte boyanmış glikojen Arkaplan meni smear izlerini içeriyor, bu glikozaminoglikan ejakülat büyük miktarlarda plazmasında varlığını belirtir (mukopolisaxaridov).

Ribonükleik asit Tanımı (RNA) Menide

Hücrelerin RNA yüksek seviyeleri Bu onların büyümesine karşı yüksek aktivite gösterir, sekretornoй, Sentetik ve diğer etkinlikler. Genç hücrelerin RNA miktarının azaltılması çoğunlukla yeniden üretmek için bu hücrelerin azalan yetenek ile ilişkili. Hücrelerin RNA içeriği belirlenir Tavuk Coop gibi bir yöntem.

Reaktifler.

1. Reaktif Chicken Coop: ayrı ayrı hazırlanmış 2 % metil, yeşil çözeltiler ve pyronine, metil yeşil çözelti dikkatli bir şekilde kloroform ile yıkanmıştır; Boya çalışma çözeltisi karıştırılarak hazırlanır 2 % Çözelti pyronine (12,5 ml) ve 2 % metil yeşil çözelti (7,5 ml) eklenmesiyle 30 ml distile su. Boya dayanıklı, buzdolabında saklanır.

2. Kilit - kimyasal olarak saf metil alkol.

Yöntem. Lekeler metanol ile sabitlenir 3 m, boya çalışma çözeltisi pyronine-metil yeşil 15 m, hızlı bir şekilde su ile yıkanır ve filtre kağıdı ile kurutulur. Mikroskopiruyut immersiyon sistemi kullanılarak. RNA pyronine parlak kırmızı renkte boyalı, Hücre çekirdekleri - metil yeşil yeşil.

Olgun sperm RNA içermeyen. Hücreler RNA spermatogenezde zengin, olgun hücrelerin sayısını azaltır hangi. Spermatohonyy olarak Zengin pembe renk sitoplazmalı, spermatotsytov içinde Ne solma, ve spermatidler içinde açık pembe. Genç sperm "yaka" pembe ağırlıklı olarak "yaka" boyalı.

Sperm, gelişiminin son aşamasında bulunan, kıvrık seminifer tübüllerin destek hücrelerde pembe maddenin kalıntılarını kaybetmek (RNA) ve olgun sperm haline.

Spermatogenez hücrelerde glikojen büyük miktarda içerir, RNA, önemli ölçüde LDH aktivitesi ve CF ifade edildi. Ancak, genellikle, Menide bu izole hücreler, Bu nedenle CBFV pratik sayısı. Bu gibi durumlarda, sonuç anlatımı form ile sınırlı.

Lökositlerin Sitokimyasal karakterizasyonu Bu fonksiyonel aktivitenin önemli bir göstergesidir. Ejakülat madde lökositlerin sayısının sayma aynı taşınır, Menide ve periferik kanda diğer hücrelerde olduğu gibi.

Ejakülat olağan yöntemlerle boyanmış sürüntülerinde (azurozinovymi karışımlarından, Hematoksilen-eosin ve diğerleri.), yanı sıra yerli hazırlıkları her zaman lökosit ayırt etmek kolay değil gibi, Spermatogenezisin hücreleri, prostatik epitel, histiositler ve diğer elementler.

Morfolojik birlikte sitokimyasal teknikler genellikle hücrelerin bir tür kurulmasına yardım. Yani, ifade peroksidaz aktivitesi, sağlanan büyük altın-kahverengi boncuklar, hücrelerin tüm sitoplazma doldurur, olgun nötrofiller karakteristik, diğer hücrelere bu reaksiyon gözlenmiştir. Glikojen Şiddetli reaksiyon nötrofiller ve spermatogenez hücrelerin tipik, ancak bu peroksidaz aktivitesi yok. Hücre ve spermatogenez hiçbir olgun granülositler bulunan RNA. spermatogenez hücrelerin asit fosfataz tepki telaffuz var, ve nötrofilik granülositler, o kadar çok kötü ifade ve. d.