Estudo citoquímico de ejaculação

Reação citoquímica, realizado com ejaculado, fornece insights sobre a composição química e atividade funcional das suas células.

Determinação do ácido ejaculado atividade da fosfatase

A actividade da fosfatase ácida ejacular muitas vezes maior do que a sua actividade no sangue. Fosfatase ácida é parte das secreções prostáticas, a sua produção é estimulada por gonadotropina macho. Usando reacções citoquímicas ela é detectada em espermatozóides e outras células do ejaculado. A actividade é determinada pela sua método Goldberg - Barka.

Reagentes.

1. Álcool formalina (uma parte do pronto 40 % formalina dissolvido em nove partes 96% Álcool etílico).

2. Pararozanilin: 1 g fucsina básica para Phuc- ácido sinosernistoy dissolvido durante o aquecimento em 25 ml 2 Ácido clorídrico N; arrefecido, filtrada e armazenada num frigorífico. Reagente resistente.

3. Uma solução aquosa de nitrato de sódio 4 %. 4. Uma solução de verde metilo para tampão de acetato 2 % (pH - 5). A solução resultante foi lavada com clorofórmio, em seguida, misturada durante aproximadamente quantidades iguais de clorofórmio e 2 % solução de metil verde. Tombado durante o dia, e, em seguida, pintado de cor púrpura, o clorofórmio foi removido com uma ampola de decantação.

5. Ambiente Inkubatsionnaya, que consiste de dois componentes.

• Um componente: 20 mg naftol-A5-fosfato foi dissolvido em 0,5 (0,3) ml de dimetilformamida, adicionar 40 ml 0,1 Solução N de acetato de sódio e filtrada através de papel de filtro; a preparação de um dia de estudo.
• Componente B: 8 gotas 4 % solução de nitrato de sódio foi misturado com 8 Gotas pararozanilina; são ex tempore. Para obter ambos os componentes do meio de incubação está ligado (pH 5,2-5,4). Se necessário, corrigir qualquer pH 50 % ácido acético, uma solução de um álcali cáustico.

Método. Ejaculado fresca é centrifugado, quando um grande número de esperma de distribuição centrifugação. A partir de sedimentos preparar vidro polido traços finos, este, assim como manchas de sangue, secou-se ao ar. As manchas secas fixos por imersão em um copo com álcool em formalina 30 de (não mais) e lavou-se com água destilada. Em seguida, os esfregaços são imersos num copo com meio de incubação e colocado numa incubadora a uma temperatura 37 ° C 2 não. Depois disso, eles foram lavados em água destilada, imersa durante 10 min num vidro com uma solução de metil verde (contrastadas para núcleos), rapidamente lavado com água, secou-se com papel de filtro e examinadas por microscópio sistema de imersão.

A actividade da fosfatase ácida pode ser expressa pelo factor citoquímica médio (SCK) de método polukolychestvennomu Astaldi-Verga. De acordo com a fórmula

SCK =(3*a b 2 * a * 1)/100

em que os números no numerador indica a intensidade da cor (máximo - 3, moderada - 2, pegadas - 1), e as letras - da percentagem de células contadas uma certa intensidade de cor; figura 100 no denominador - o número total de células contadas.

Por Exemplo, contados 100 célula, dos quais têm uma intensidade máxima de cor 20 célula, moderada - 20 e com as seguintes - 60 célula. Aqui:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6

A fosfatase ácida de espermatozóides localizado na unidade croquetes vermelho-alaranjado na parte superior da cabeça.

Cromatina parte movimentada da cabeça é verde e não contém fosfatase ácida.

Uma cor pálida mais difusa sobre a fosfatase ácida é detectada em torno da parte inferior da cabeça, e, por vezes, que se estende para o gargalo do esperma. Coeficiente cytochemical meio da fosfatase ácida no ejaculado de esperma normal é 2,0-2,4.

No citoplasma das células da espermatogénese revelou acumulação de grânulos, pintados em um específico (vermelho-laranja) cor. Nas células de suporte dos túbulos seminíferos complicadas, muitas vezes fortemente coradas positivamente para a fosfatase ácida, cabeça incolor translúcido (xromatin) esperma. Histiócitos e macrófagos conter alguns grânulos, coradas positivamente para a fosfatase ácida. Em linfócitos isolados, e, por vezes, os neutrófilos são aglomerados individuais, possuindo uma actividade de fosfatase ácida.

Determinação da actividade da desidrogenase succinato (SDG) no ejaculado

Sukcinatdegidrogenaza - Enzima, participar em reacções redox, contido nas células em um número significativo de ejaculado. No entanto, a natureza da alteração da sua actividade em vários processos patológicos ainda não é bem compreendido. Actividade de desidrogenase succinato em células é determinada por um método modificado de Nartsissova.

Reagentes.

1. Acetona-Trilon (acetona - 60 ml, água distillirovannaya - 40 ml, Trilon B - 250 mg).

2. Uma solução de verde metilo 2 % (o mesmo corante, o qual é utilizado para a fosfatase ácida).

3. Ambiente Inkubatsionnaya, que consiste nos seguintes componentes:

e) tampão fosfato (pH 7,2-7,4) - 10 ml;

para) 5,4 % solução de succinato de sódio - 10 ml;

em) complexone III (13 mg diluída em 5 ml de água destilada);

g) água destilada - 5 ml;

d) nitrotetrazolium roxo (10 mg diluída em 10 ml de água).

Todos os componentes são misturados em um pacote e armazenada num frigorífico. Preparado de forma pode ser reutilizado - para 10 dias ou mais.

Método. Manchas, preparado a partir do ejaculado, fixadas em acetona durante Trilon- 30 de, lavou-se com água destilada e seco ao ar. Em seguida, os esfregaços são imersos no meio de incubação e colocado numa incubadora a uma temperatura 37 ° C 1 não, após o que são lavadas com água destilada e com verde de metilo para dokrashivayut 10 m. Então, novamente rapidamente lavado com água, secou-se com papel de filtro e examinadas por microscópio sistema de imersão.

Espermatozóides normais têm alta atividade da succinato desidrogenase, representado por grandes grânulos azuis-violeta, este, fundindo juntos, formar uma massa densa, enchendo de esperma pescoço, algumas pastilhas individuais espermatozóides são encontrados ao redor da cabeça.

Calcule fundidos grânulos não é possível, portanto, para determinar a actividade de succinato desidrogenase porção colorida de esperma medido em micrómetros. Ao longo do comprimento da pintado especificamente para succinato desidrogenase dos espermatozóides são julgados de acordo com o grau de actividade da enzima no esperma. Com micrômetro ocular e comprimento objeto-micrômetro é medido em parte colorida específico 100 spermatozoidax. Adicionando comprimento contados em secções coradas de espermatozóides, e dividindo o valor resultante por 100, receber um comprimento médio, expressando atividade suktsinatdegidrogenaznuyu por um único espermatozóide. Normalmente, é de 4,3 ± 0,7 m. Esta atividade LDH cálculo é o mais informativo e, portanto, é recomendado o uso para fins de investigação.

Para uma ampla aplicação na prática, este método é bastante complicado, É preferível expressar a quantidade de succinato desidrogenase Astaldi-método Verga. Médio coeficiente LDH cytochemical de espermatozóides no ejaculado é normal 2,7 ± 0,3.

Nas células da espermatogénese A actividade de LDH é detectada sob a forma de aglomerados de grânulos grandes azul-violeta, muitas vezes se fundem em grandes aglomerações, localizados em diferentes áreas do citoplasma. Fator cytochemical Médio nas células atinge espermatogênese 2,0. Com a maturação de células do esperma e aumenta a actividade de LDH em espermatozóides maduros excede 2,0. No citoplasma de certos linfócitos encontrados ração SDG.

Determinação da atividade da peroxidase no ejaculado

O esperma, células da espermatogênese e células de suporte dos túbulos seminíferos complicadas peroxidase em falta.

O ejaculado granulócitos actividade de peroxidase neutrofílica é expressa de forma significativa e pode variar dependendo da natureza do processo patológico, bem como no sangue periférico. O nível de actividade da peroxidase dos neutrófilos é importante para avaliar o seu estado funcional e a actividade do processo inflamatório nos órgãos genitais masculinos. Esfregaços corados de sémen Graham-Knoll e atividade contábil da enzima por Astaldi-Verga são esfregaço de sangue análoga.

A atividade da peroxidase nas células do ejaculado é determinada pela método de Graham-Knoll.

Reagentes.

1. Álcool formalina (mesmo, e que a fosfatase ácida).

2. Reagente Peroksidaznыy: ʙenzidin (na ponta de um bisturi) dissolvido em 6 ml 96 % Álcool etílico, adicionar 4 ml de água destilada 0,02 ml 3 % peróxido de hidrogênio. Reagente utilizável para 5-6 dias.

3. Romanovsky Dye a uma diluição de 1-2 gotas em 1 ml de água destilada.

Método. Sêmen fresco esfregaços foram fixados para 30 formalina com álcool, lavou-se com água corrente e seco. Em seguida, despeje cursos reagente peroxidase por 5-7 minutos, cuidadosamente lavados em água corrente e seco. Depois disso, eles dokrashivayut 15 20 min corante Romanovsky, lavado com água corrente, secou-se e mikroskopiruyut usando o sistema de microscópio de imersão.

Quando uma resposta positiva à peroxidase em granulócitos neutrófilos revela grandes grânulos dourado-marrons em grandes números. Com um grande número de células brancas do sangue necessário para calcular a Fator cytochemical média (SCK). O citoplasma de histiócitos peroxidase individual esteja presente como pequenos aglomerados, tais como grânulos.

Determinação de glicogênio no ejaculado

Alterações no conteúdo de glicogênio em várias células afectar a sua função ou evidência de desenvolvimento de processo patológico. Determinação de glicogénio nas células é efectuada por McManus.

Reagentes.

1. Uma solução aquosa de ácido periódico 1 % (preparação de usar).

2. Água Sernistaya: 5 ml 10 % de potássio ou de sódio metabissulfito, 5 ml 1 Ácido clorídrico N, água para 100 ml (preparação de usar).

3. Reagente Shiffa: 1 g fucsina básica para o ácido fuksinosernistoy, pré-moído num almofariz de porcelana, Dissolve-se sob agitação constante durante 5 min 200 ml de ferver água destilada, passados ​​através de um filtro de papel e adicionou-se com arrefecimento a 50 ° C 20 ml 1 Ácido clorídrico N, e quando arrefecida a 25 ° C - 1 g de potássio ou de metabissulfito de sódio. O reagente preparado é mantido na geladeira por 24 h após o que ele iluminou e tornou impróprio para consumo vitsya

4.A solução aquosa de verde metilo 2 %, lavou-se com clorofórmio

5.Álcool metílico quimicamente pura.

Método.

Esfregaços finos secos ejacular fixo álcool metílico quimicamente puro para 3 m, lavado com água destilada e imerso numa proveta com 1 % iódico ácido aquoso 5 m. Em seguida, as manchas foram lavadas com água destilada, seco, sulfuroso enxaguadas em água e novamente seco.

Mais cotonetes mergulhados em um copo com o reagente de Schiff para 15 m, lavá-los em três porções de água sulfurosa (de 3 min cada), lavado 10 min em água e núcleos de células dokrashivayut 3 verde metil min. Então, novamente enxaguada com água swabs, papel de filtro e seco mikroskopiruyut usando microscópio sistema de imersão.

Em espermatozóides maduros glicogênio faltando. No citoplasma da nova esperma, especialmente com o "colar", traços revelados de glicogênio (±), por vezes sob a forma de peletes individuais na parte superior da cabeça ou no "colar".

Nas células da espermatogénese Glicogénio é encontrado em grandes quantidades, sob a forma de um granulado vermelho-cereja, preenche todo o citoplasma. Com a maturação de células perdem glicogênio até seu desaparecimento em espermatozóides maduros. Spermatocitы glicogénio conter não apenas no citoplasma, mas também no núcleo. Nas células de suporte dos túbulos seminíferos complicadas, o glicogênio é um grânulos vermelho-cereja e difusa. Granulócitos neutrófilos maduros no ejaculado, , bem como em esfregaços de sangue periférico, contêm uma quantidade significativa de glicogénio. Em prostatite crônica em granulócitos neutrófilos ejaculação aumenta significativamente a quantidade de glicogênio e aumenta a atividade da peroxidase. Em linfócitos isolados vezes são encontrados em grânulos de glicogênio normais.

Macrófagos conter vestígios de manchas de sêmen glicogênio Fundo manchado na cor vermelho-cereja, o que indica a presença no plasma do ejaculado grandes quantidades de glicosaminoglicanos (mukopolisaxaridov).

Definição de ácido ribonucléico (RNA) no ejaculado

Os níveis elevados de ARN em células Ele mostra alta atividade contra o seu crescimento, sekretornoй, sintética e outras actividades. Diminuindo a quantidade de ARN em células jovens, muitas vezes associada com a diminuição da capacidade destas células para regenerar. O conteúdo de RNA nas células é determinada o método do galinheiro.

Reagentes.

1. Reagente Chicken Coop: Prepara-se separadamente 2 % metílicos soluções verdes e pironina, metil solução verde foi cuidadosamente lavado com clorofórmio; Solução de trabalho de corante é preparado pela mistura de 2 % solução piroxina (12,5 ml) e 2 % solução de metil verde (7,5 ml) com adição 30 ml de água destilada. O corante resistente, armazenado na geladeira.

2. Bloquear - quimicamente puro álcool metílico.

Método. Esfregaços são fixados com metanol para 3 m, dye solução de trabalho pironina-metil verde 15 m, rapidamente enxaguado com água e secou-se com papel de filtro. Mikroskopiruyut usando o sistema de microscópio de imersão. RNA piroxina pintado na cor vermelho brilhante, núcleo das células - verde verde metil.

Espermatozóides maduros não contêm RNA. As células são ricos em ARN espermatogénese, o que diminui o número de células à medida que amadurecem. Em spermatohonyy citoplasma rico cor-de-rosa, em spermatotsytov o desvanecimento, e em espermátides Rosa claro. Em jovem esperma "colar" rosa pintado predominantemente "colar".

Esperma, localizado na última fase do seu desenvolvimento, nas células de suporte dos túbulos seminíferos complicadas perder os restos de uma substância cor de rosa (RNA) e tornar-se espermatozóides maduros.

Nas células da espermatogénese contém uma grande quantidade de glicogénio, O ARN foi expressa de forma significativa a actividade LDH e CF. Mas, normalmente, estas células isoladas no ejaculado, portanto, contar CBFV impraticável. Em tais casos, limitado à forma narrativa de conclusão.

Caracterização citoquímica de leucócitos É um indicador importante da sua actividade funcional. A contagem do número de leucócitos no ejaculado substância é realizada na mesma, Tal como em outras células no ejaculado e sangue periférico.

Nos esfregaços corados pelos métodos habituais de ejaculado (misturas azurozinovymi, Hematoxilina-eosina e outros.), bem como preparações nativas nem sempre são fáceis de distinguir os leucócitos, células de espermatogénese, epitélio prostático, histiócitos e outros elementos.

Técnicas citoquímicas em conjunto com morfológica muitas vezes ajudar a estabelecer um tipo de células. Assim, A actividade da peroxidase expressa, fornecidas grandes grânulos dourados marrom-, preenche todo o citoplasma de células, característica de neutrófilos maduros, em outras células, tais reacção é observado. Reação grave a glicogênio é típico de neutrófilos e células de espermatogénese, mas estes não têm actividade de peroxidase. ARN contido nas células e não a espermatogénese granulócitos maduros. As células da espermatogénese ter pronunciado reacção com fosfatase ácida, e granulócitos neutrófilos, ela expressou muito mal, e assim por diante. d.