O estudo da hemostasia vascular das plaquetas

Violações neste link da hemostasia podem prosseguir com uma tendência para trombose ou gemorragiam, Dependendo do que for escolhido métodos de pesquisa. Além Disso, todos os parâmetros dos métodos de investigação hemostasia são divididas em básicas e adicionais, ou testes de segunda linha, que se aplicam apenas se, se os testes revelarem alguma violação. Para o principal (básico) Os seguintes testes se aplicam.

Testes de resistência (fragilidade) capilares - manguito, enlatado, angioresistometria

Destes testes, o mais acessível e ao mesmo tempo bastante informativo Teste Konchalovsky-Rumpel-Leede.

A avaliação é feita pelo número e tamanho das hemorragias, formado na parte superior da superfície palmar do antebraço (em um círculo com diâmetro 5 cm) após 5 minutos de compressão do ombro com manguito a uma pressão de 12-13,3 kPa (90-100 Mm Hg. Arte.). Os resultados são levados em conta através 5 min após a remoção do manguito. O número de petéquias é superior a 10 indica aumento da fragilidade dos microvasos, que está frequentemente associada a trombocitopenia ou função plaquetária angiotrófica prejudicada. A ocorrência de hemorragias sob o próprio manguito também é levada em consideração..

Amostra de jarro é realizado nas mesmas áreas da pele com um aumento gradual da pressão negativa - de 20 kPa (150 mm Hg. Arte.) e inferior. Na avaliação dos resultados, são contadas petéquias, apareceu sob os bancos.

Testes para a duração e magnitude do sangramento capilar

Com clássico Teste do duque a almofada inferior do lóbulo da orelha, após aquecê-la levemente, é perfurada a uma profundidade de 3,5-4 mm. O tempo de sangramento para tal estudo normalmente não excede 4 m, e as gotas de sangue no papel de filtro são relativamente pequenas e começam a diminuir rapidamente aproximadamente 1-1,5 minutos após a punção. Com trombocitopenia grave (Menos 20 Lata 1 eu) e disfunção plaquetária grave, o tempo de sangramento aumenta para 20-40 minutos, manchas de sangue tornam-se significativamente maiores e não diminuem por muito tempo ou diminuem em ondas, então aumente novamente. O teste de Duke não é sensível o suficiente, em 2/3 em pacientes com trombocitopatias dá resultados normais.

Amostras mais sensíveis, em que o tempo de sangramento é estudado no contexto da estase venosa criada artificialmente, por que um manguito de um dispositivo de medição de pressão arterial é colocado no ombro e a pressão é mantida durante todo o estudo, igual 5,3 kPa (40 mm Hg. Arte.). No contexto de tal estase em ensaios de Borhgrevink-Waaler na superfície palmar do terço superior do antebraço, são aplicadas incisões transversais de profundidade com escarificador 1 mm e 8-10 mm de comprimento (tempo normal de sangramento - até 10 m), e na amostra de Ivey et al.. na mesma região do antebraço, três punções transversais com profundidade de 3 mm (tempo normal de sangramento - até 7 m).

No contexto da mesma estase venosa, pesquisa sobre A. DE. Shitikova, em que uma injeção profunda é feita na falange terminal do dedo 3 mm, após o que a ponta do dedo é imersa em um copo de 5 ml de solução isotônica de cloreto de sódio e o tempo de sangramento na luz transmitida são levados em consideração (se a solução estiver muito intensamente manchada com sangue, então, para observação adicional, o dedo é movido para outro copo). A quantidade de sangue perdida é determinada pelo aumento do volume de líquido nas xícaras (tempo normal de sangramento - até 4 m, volume de sangue perdido - de 0,01 para 0,4 ml).

No teste G. N. Sushkevich o volume de sangue perdido é determinado pela cor da solução de amônia (0,04 %) , em que estão imersos pedaços de papel com manchas de sangue, por colorimetria usando um colorímetro médico.

Indicações de testes de duração do sangramento, anormal, indicam uma violação pronunciada da hemostasia vascular plaquetária, no entanto, se os resultados destes testes forem normais, a presença de trombocitopatias leves não pode ser excluída.

Contando o número de plaquetas no sangue

Contando o número de plaquetas no sangue (em uma câmara de contagem Goryaev com contraste de fase ou com tonalidade ou usando contadores de partículas) - o método mais importante para diagnosticar trombocitopenia e trombocitopatias, ocorrendo com uma diminuição constante ou periódica no número dessas células (Anomalias de Bernard-Soulier, Mea-Heggglina et al.).

A contagem de plaquetas também sugere, É possível realizar mais pesquisas funcionais e de que forma deveria ser realizada? (com ou sem pré-concentração plaquetária, fotometricamente ou microscopicamente, etc.. d.).

Estudando o tamanho das plaquetas em um esfregaço – trombotsitometriya

Estudando o tamanho das plaquetas em um esfregaço (trombotsitometriya) permite fazer um julgamento preliminar sobre diferentes populações dessas células no sangue do sujeito e obter informações sobre uma série de suas anomalias, bem como saturação plaquetária com grânulos.

Para algumas trombocitopatias (Síndrome de Wiskott-Aldrich) plaquetas muito pequenas predominam no sangue (para 2 μm de diâmetro), com outros - formas gigantescas (Anomalias de Bernard-Soulier, Meya-Hegglina) - Para 8 m ou mais. Em várias trombocitopatias, estas células são pobres em grânulos (cm. abaixo), em outros, a centralização dos grânulos é interrompida quando as plaquetas se espalham no vidro, o que indica uma violação da reação de liberação dos grânulos e das substâncias que eles contêm, necessário para hemostasia. Todas essas propriedades, bem como a capacidade das plaquetas de se espalharem e formar processos, a avaliação da estrutura dessas células pode ser estudada por meio de microscopia eletrônica convencional e de varredura, e também usando óptica de interferência de acordo com Nomarski.

Retração do coágulo sanguíneo naturalmente violado com trombocitopenia grave (menos de 30-40 G em 1 eu) e em algumas formas de deficiência qualitativa de plaquetas, na maioria das vezes - com trombocitoastia de Glanzmann, trombocitopenia urêmica, etc..

Estudo da função de agregação adesiva das plaquetas (AAFT)

Estudo da função de agregação adesiva das plaquetas (AAFT) - o elo mais importante no diagnóstico laboratorial da maioria das trombocitopatias. Atualmente, uma série de métodos de pesquisa facilmente viáveis ​​e publicamente disponíveis foram desenvolvidos., incluindo visual, microscópico e hardware (agregômetros, microfiltros, etc.) registro desta função, os seguintes métodos podem ser considerados indicativos:.

Métodos para retenção de plaquetas em vidro (ou filtros)

As plaquetas são contadas no sangue venoso antes e depois de passarem a uma determinada taxa através de uma coluna de esferas de vidro padrão ou através de um pigtail de fibra de vidro.; Com base na perda de plaquetas do sangue, avalia-se o grau de sua adesividade.

Mais acessível, embora um pouco menos preciso, um método para determinar o número de plaquetas no sangue antes e depois de seu contato por um determinado período de tempo com a superfície interna do frasco, girando a uma certa velocidade. Métodos mais precisos para determinar a retenção de plaquetas em filtros milipore (diâmetro dos poros - 15-20 mícrons). Nestes testes, a avaliação pode ser realizada aumentando o gradiente de pressão acima e abaixo do filtro (o entupimento dos poros com plaquetas e seus agregados leva ao aumento deste indicador).

Métodos para estudar a função de agregação plaquetária

Teste de agregação de hemolisado com base na capacidade de hemolisar glóbulos vermelhos lavados, sendo estudado para reprodução 10^-2 e 10^-6, causar agregação em seu plasma quando agitado, contendo um grande número de plaquetas (proporção de volumes de plasma citrato e hemolisado - 1,0:0,2). O tempo de ocorrência da agregação é levado em consideração (norma em alta concentração de hemolisado – 11-17 s, em baixo - 40-54 s) e sua gravidade. A dinâmica do processo e sua intensidade também podem ser avaliadas fotometricamente (colorímetro médico, filtro verde, mexendo) e em um agregógrafo de qualquer desenho.

Ao registrar o processo graficamente, use uma alta diluição de hemolisado (10^-6) permite obter um agregador de duas ondas, em que a segunda onda está associada à liberação de estimuladores de agregação endógena das plaquetas - ADP, catecolaminas, tromboxano, etc.. Esta segunda onda caracteriza a reação de libertação, não é observado na ausência de grânulos densos nas plaquetas (doença pool de armazenamento) ou em caso de violação da reação de liberação (síndrome semelhante à aspirina, etc.).

O teste de agregação de hemolisado pode ser realizado em qualquer laboratório, não requer quaisquer reagentes especiais.

Micrométodo visual para determinar a agregação plaquetária

Sua essência é, que o sangue venoso obtido sob condições de siliconização é estabilizado por duplo volume 3,8 % citrato de sódio (razão 2,4:0,6 ml), ele é centrifugado 6 minutos a 100 rpm, após o qual o plasma rico em plaquetas resultante é aplicado 0,02 ml em lâminas de vidro e misturados com o mesmo volume de agentes agregantes - ADP, trombina, colágeno, norepinefrina ou ristomicina. As concentrações finais dos agentes agregantes no plasma sanguíneo em estudo devem ser:

• ADF 0,5*10^-4 mmol / L;
• norepinefrina - 0,015%;
• trombina — 0,125 unidades/ml (concentração de colágeno é selecionada experimentalmente).

É possível testar ambos, e maiores concentrações de agentes agregantes. A seleção de sua concentração pode variar dependendo da atividade desigual de medicamentos de diferentes fabricantes e com diferentes atividades das amostras, portanto, é necessário um ajuste preliminar da concentração de cada agente no plasma normal.

A mistura de agentes agregadores de plasma sanguíneo rico em plaquetas é misturada agitando a lâmina, contra um fundo escuro, por meio de uma lupa, registra-se o tempo de aparecimento dos agregados em forma de “tempestade de neve”. Na avaliação dos resultados, o número de plaquetas no plasma é levado em consideração. Assim, Tempo de agregação ADP, aumenta de 27-37 s em 400 Lata 1 l plaquetas até 62-75 s em 50 Lata 1 eu, e agregação de trombina - respectivamente de 40-52 a 79- 106 de.

Gravação gráfica do processo de agregação

O registro gráfico do processo de agregação sob a influência dos mesmos agentes agregadores é um método muito informativo para o estudo funcional das plaquetas. Realizado em agregógrafos ou.

Ao registrar graficamente, não apenas o tempo de início da agregação é determinado, mas também a sua intensidade (pelo desvio da curva e pela área do agregagrama), a presença da primeira e segunda ondas de agregação - ao usar baixas concentrações de adrenalina e ADP (a segunda onda caracteriza a reação de libertação), bem como desagregação patológica.

Exame visual ou gráfico da agregação plaquetária sob a influência da ristomicina

Muito o exame visual ou gráfico da agregação plaquetária sob a influência da ristomicina é importante. Este tipo de agregação está quebrado (concentração final de ristomicina 0,8-1,0 mg/ml) com uma das diáteses hemorrágicas mais comuns - angiohemofilia (doença de von Willebrand), bem como com anomalia plaquetária de Bernard-Soulier e com alguns tipos adquiridos de inibição da síntese do fator de von Willebrand (uremia, inibição imunológica dele, etc.. d.).

Determinação quantitativa do fator von Willebrand no plasma sanguíneo

A determinação quantitativa do fator de von Willebrand no plasma sanguíneo é realizada por aglutinação com ristomicina de uma suspensão de plaquetas formalinizadas normais em várias diluições do plasma livre de plaquetas estudado.

O método é importante tanto para o diagnóstico da angiohemofnia quanto para a inibição secundária da síntese desse fator, e avaliar a gravidade do dano endotelial (vasculite, aterosclerose e outros.) e tendência à trombose, em que o nível do fator von Willebrand no sangue geralmente aumenta significativamente.

Nível do fator von Willebrand indica a capacidade do endotélio de sintetizá-lo (reduzido na aigiohemofilia) e o grau de dano endotelial na vasculite, aterosclerose e outras doenças, ocorrendo com danos ao revestimento interno dos vasos sanguíneos.

Para obter plaquetas normais fixas, as plaquetas são adicionadas sequencialmente ao plasma sanguíneo rico em plaquetas de indivíduos saudáveis. 0,2 % Solução EDTA (0,5 ml 5 ml de plasma) e pela 2 min - solução de fixação (20 ml 40 % formalina em 1000 ml de tampão fosfato com 0,2 gEDTA, pH 6,4).

A mistura é mantida a uma temperatura de +4°C durante pelo menos 1 não, após o que é submetido à centrifugação, o sobrenadante é removido, e o sedimento plaquetário é lavado duas vezes com uma solução em suspensão (um volume 3,8 % solução de citrato de sódio e cinco volumes de solução isotônica de cloreto de sódio; O pH é ajustado para 7,4). A suspensão preparada de plaquetas formalinizadas normais é embalada de acordo com 1 ml e armazenado a -20°C. Uma curva de calibração de diluição é construída usando plasma normal livre de plaquetas, com amostras das quais plaquetas formalinizadas são misturadas. A seguir, a aglutinação da ristomicina é determinada na mistura. A curva de calibração é usada para determinar a quantidade de fator de von Willebrand no plasma sanguíneo de teste. As plaquetas fixas são melhor preservadas quando uma pequena quantidade de azida sódica é adicionada à solução conservante.

Testes, refletindo agregação plaquetária espontânea

Ao examinar pacientes com tromboembolismo ou com maior tendência a trombose e isquemia, os exames estão incluídos nos principais métodos, refletindo agregação plaquetária espontânea, t. é. ocorrendo no sangue total ou plasma sanguíneo sem adição de agentes agregantes.

Para identificar esse fenômeno, a microscopia de um esfregaço de sangue presta atenção à proporção entre o número de plaquetas individuais e seus agregados, consistindo de 3-5 plaquetas ou mais. Este fenômeno é melhor revelado ao visualizar sedimentos, obtido com zeitrif intensivo- digestão do plasma rico em plaquetas (20—30 minutos às 6000 / Min), estabilizado com solução de citrato ou EDTA-citrato. No entanto, resultados mais estáveis ​​são obtidos pelos seguintes métodos para determinar a agregação espontânea.

Método Wu-Hoak

O método Wu-Hoak é baseado em, que o sangue é retirado de uma veia em dois tubos de ensaio, um dos quais contém uma solução de EDTA, e na outra - uma mistura da mesma solução de EDTA com 4 % solução de formaldeído. Após a mistura, o conteúdo dos tubos pode assentar 30 min à temperatura ambiente.

Durante a sedimentação, os agregados assentam, e plaquetas individuais permanecem na camada sobrenadante. Após a sedimentação, o número de plaquetas na camada sobrenadante em cada tubo é contado. Normalmente, a diferença no número de plaquetas no conteúdo de ambos os tubos não excede 10-15 %, com o aumento da agregação espontânea, aumenta.

Método N. E. Tarasova

De acordo com o método de N. E. Tarasova (1984) a perda de plaquetas do sangue citratado total em agregados é levada em consideração após agitação por 3 minutos em um agitador AVU-1 a uma velocidade de 90-100 vezes por 1 m.

Em um tubo de ensaio com 0,5 ml de sangue, abalado, introduzido 1 ml 1 % solução de formaldeído em solução isotônica de cloreto de sódio. O segundo tubo de controle não é agitado, e no sangue nele contido da mesma pessoa que está sendo examinada através 3 min solução de formalina também é injetada.

O sangue em ambos os tubos assenta 30 m, após o qual o número de plaquetas na camada sobrenadante é contado. Normalmente, a diferença na contagem de plaquetas não excede 20 %, com uma maior tendência à agregação, aumenta.

Nos casos em que seja detectada violação na aplicação de testes básicos, caracterizando hemostasia plaquetária, realizar conforme necessário para conduzir pesquisas adicionais. Destes, os mais importantes são os seguintes.

Estudos adicionais para determinar a hemostasia plaquetária

Estudo do número de megacariócitos no mielograma e trefina da medula óssea com estudo da morfologia dessas células

Aumento significativo no número de megacariócitos em seções de medula óssea, geralmente combinado com um aumento mais ou menos pronunciado no número de plaquetas no sangue, observado com eritremia, trombocitose hemorrágica e essencial e outras doenças mieloproliferativas. Megacariocitose moderada, combinado com trombocitopenia, característica da púrpura trombocitopênica (Doença de Werlhof).

No caso de aplasia e hipoplasia da medula óssea de qualquer origem, o conteúdo de megacariócitos nas secções da medula óssea é reduzido, e o número de plaquetas no sangue periférico.

Amegacariocitose parcial é observada com deficiência de trombocitopoietina (uma forma rara de trombocitopenia congênita), aparecimento de anticorpos antimegacariócitos no sangue, aplasia parcial essencial de megacariócitos (pode preceder o desenvolvimento de leucemia).

Alterações morfológicas e citoquímicas em megacariócitos são observadas em muitas trombocitopatias.

Estudo microscópico eletrônico da ultraestrutura plaquetária

O estudo microscópico eletrônico da ultraestrutura plaquetária é importante para o diagnóstico de diversas trombocitopatias, em que o número de grânulos não proteicos de alta densidade óptica está ausente ou drasticamente reduzido (contendo ADP, Serotonina, catecolaminas, cálcio, etc), ou grânulos de proteína α, o que é típico de uma série de trombocitopatias, agrupados em um grupo de doenças de pool de armazenamento, ou doenças por deficiência de grânulos.

Defeitos no aparelho contrátil também podem ser detectados. (sistemas de microtúbulos) e lisossomos plaquetários.

Ao microscopia eletrônica de varredura ou estudo de plaquetas usando óptica de interferência de acordo com Nomarski, defeitos na fixação de plaquetas em uma superfície estranha também podem ser detectados, eles se espalharam sobre ela, formação de tiro, centralização e secreção de grânulos, o que é típico de muitos tipos de trombocitopatias.

Determinação de anticorpos antiplaquetários por imunofluorescência- pesquisa em suspensão de plaquetas de imunoglobulina, associado a essas células – Método Dixon

Este método sofisticado permite diferenciar entre trombocitopenias imunes e não imunes..

Porém, nas formas mais graves da doença com trombocitopenia grave, é inaceitável, uma vez que a determinação da imunoglobulina ligada requer um número bastante grande (mais de 40-50 G em 1 eu) contagem de plaquetas.

Determinação da vida útil de plaquetas autólogas marcadas

A determinação do tempo de vida das plaquetas autólogas marcadas permite distinguir a trombocitopenia do tempo de vida normal das plaquetas em circulação (sobre 9 Noites) e formas da doença com uma vida útil reduzida dessas células.

Os primeiros estão mais frequentemente associados a uma diminuição na produção de plaquetas na medula óssea, o segundo - com sua morte acelerada, ou com a ação de anticorpos antiplaquetários (com trombocitopenia autoimune, a vida útil das plaquetas é reduzida para várias horas), ou com perda intensiva dessas células em agregados e trombos com coagulação intravascular disseminada ou trombose maciça (consumo de trombocitopenia).

Determinação quantitativa do conteúdo no plasma sanguíneo antes e depois da agregação de fatores plaquetários

Determinação quantitativa do conteúdo no plasma sanguíneo antes e depois da agregação de vários fatores plaquetários - fator fosfolipídico de membrana 3, conteúdo de grânulos α (fator anti-heparina 4, b-тромбоглобулина, fator mitogênico plaquetário) e grânulos não proteicos de alta densidade eletro-óptica (Serotonina, catecolaminas, ADF), bem como hidrolases ácidas.

Estes estudos fornecem informações sobre o conteúdo de estruturas relevantes e seus componentes nas plaquetas, sobre sua liberação no plasma durante o processo de agregação, e também sobre interno- ativação plaquetária vascular, acompanhada pela liberação de plaquetas no plasma sanguíneo com aumento na concentração de componentes densos e grânulos α neste último (fator anti-heparina 4, β-tromboglobulina, etc.).

Métodos de pesquisa quantitativa de fatores plaquetários são importantes para identificar diversas trombocitopatias (violações da segurança de grânulos e seus componentes, paresia de reação para liberação desses componentes, um aumento em seu conteúdo no plasma sanguíneo devido ao intenso interno- adesão vascular e agregação plaquetária, etc.). Várias trombocitopatias são caracterizadas por uma diminuição no conteúdo do fator plaquetário nas membranas 3 ou uma violação de sua disponibilidade para participar do processo de coagulação sanguínea.

Estudo das características bioquímicas das plaquetas e suas estruturas individuais

Estudo das características bioquímicas das plaquetas e suas estruturas individuais - estroma, grânulos, mitocôndrias, etc.. d. permitem documentar a conexão entre diferentes tipos de patologia e disfunção plaquetária com certos tipos de deficiência enzimática (Deficiência de COX, tromboxano sintetase, etc.), com violação da composição das lipoproteínas de membrana, necessário para interação com agentes agregadores, e T. d.

Tais estudos estão disponíveis apenas para laboratórios de pesquisa bem equipados e, portanto, não são utilizados na prática generalizada..