Микроскопическое исследование спинномозговой жидкости

Определение цитоза

В спинномозговой жидкости здоровых людей содержится очень небольшое количество клеток. Клиническое значение в основном имеют лейкоциты (лимфоциты). Чтобы подсчету лейкоцитов не мешали эритроциты, их разрушают путем добавления к неразведенной спинномозговой жидкости 1/10 части уксусной кислоты с фуксином. Фуксин окрашивает ядросодержащие клетки в красный цвет. Для окраски лейкоцитов используют реактив Самсона (смешивают 30 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл жидкого фенола, 2 мл спиртового раствора фуксина 1 : 10 и доливают 100 мл дистиллированной воды). Реактив стойкий, хорошо окрашивает клетки и в течение нескольких часов сохраняет их от цитолиза.

Применяют также раствор, содержащий 5 мл 10 % раствора уксусной кислоты и 0,1 г метилвиолета. Он менее стойкий, окрашивает клетки в синий цвет.

Вследствие цитолитических свойств спинномозговой жидкости подсчитывать количество клеток следует сразу после ее взятия. Жидкость отмеряют в пробирку каплями или микропипеткой в пропорции 10 частей спинномозговой жидкости и 1 часть красящего раствора и оставляют на 10—25 мин для окраски клеток. Для разведения можно использовать смеситель для лейкоцитов. Клетки спинномозговой жидкости очень быстро прилипают к стенкам пробирки, поэтому жидкость, находящуюся в пробирке, перед исследованием необходимо тщательно перемешать вращательными движениями между ладонями.

Для подсчета цитоза используется камера Фукса—Розенталя. Подсчет производят во всей сетке через 5 мин после заполнения камеры. Количество клеток в 1 мкл определяют по формуле

X=(A*11)/(3.2*10)

где X — количество клеток в 1 мкл; A — количество клеток, сосчитанное на поверхности сетки; 3,2 — объем камеры; 11/10 — степень разведения.

Допускается оформление результатов подсчета в виде дроби, например 14/3, где 14 — количество сосчитанных клеток в камере, 3 — округленная цифра объема камеры. При большом количестве клеток достаточно сосчитать их в одной половине сетки и удвоить полученное число. При резко выраженном плеоцитозе (значительном увеличении количества клеток) допустимо сосчитать клетки в 16 малых квадратах и умножить полученное число на 16.

При отсутствии камеры Фукса—Розенталя можно пользоваться счетной камерой Горяева со значительно меньшей емкостью, поэтому в ней подсчитывают клетки не менее чем в трех квадратах, рассчитывают среднее арифметическое и умножают его на 1,2. Множитель 1,2 получают из формулы

X=(A*11)/(0.9*10)

где 0,9—емкость камеры, 11/10 — степень разведения.

При подсчете клеток в неразведенной спинномозговой жидкости одну из первых капель, вытекающих из пункционной иглы, помещают в камеру Фукса—Розенталя и определяют число клеток, как указано выше.

В норме количество клеток (лимфоцитов) в 1 мкл спинномозговой жидкости из желудочков мозга и мозжечково-мозговой цистерны составляет 0—1, а в жидкости, полученной при поясничной пункции — 2—4.

У детей в возрасте до трех месяцев в 1 мкл спинномозговой жидкости обнаруживается до 20—23 клеток, до одного года — 14—15, до двух лет — 11—14, от двух до пяти лет — 10—12, от пяти до семи лет—8—10, от семи до десяти лет — 6—8, старше десяти лет — 4—5.

При менингите, абсцессе и опухолях мозга количество клеток в спинномозговой жидкости увеличивается.

При исследовании геморрагической спинномозговой жидкости в ряде случаев необходимо установить ее истинный цитоз. Для этой цели используется метод Фридмана: геморрагическую жидкость набирают с реактивом Самсона для определения цитоза и изотоническим раствором хлорида натрия для подсчета количества эритроцитов в 1 мкл спинномозговой жидкости.

Например, число клеток в 1 мкл — 20, число эритроцитов — 3600. Количество эритроцитов и лейкоцитов в крови больного узнают из общего анализа, выполненного до спинномозговой пункции. Например, в 1 мкл крови 4 200 000 эритроцитов, 7000 лейкоцитов. Отсюда на один лейкоцит приходится 4200000/7000=600 эритроцитов.

Для получения величины истинного цитоза составляют уравнение:

на 600 эритроцитов — 1 лейкоцит;

на 3600 эритроцитов — X лейкоцитов, следовательно,

X=3600/600=6 леикоцитов.

Истинный цитоз спинномозговой жидкости 20—6=14 клеток в 1 мкл.

Применение этого метода ограничено, так как спинномозговая жидкость со значительной примесью крови непригодна для такого исследования.

Определение количества эритроцитов в спинномозговой жидкости имеет значение для установления тяжести состояния больного при внутричерепных кровоизлияниях.

При наличии в 1 мкл 2000—5000 эритроцитов спинномозговая жидкость окрашивается в розовый цвет, 900—1000 эритроцитов — только слегка опалесцирует. В бесцветной жидкости может быть обнаружено более низкое содержание эритроцитов. Клиническое значение имеет нарастание уровня эритроцитов в динамике.

Дифференциация клеток спинномозговой жидкости проводится в счетной камере в нативном и окрашенном виде.

При большом увеличении (окуляр 10X или 15Х, объектив 40X) в счетной камере обращают внимание на величину клеток, форму, расположение и величину ядер, наличие включений в цитоплазме. Легко дифференцируются лимфоциты, нейтрофильные гранулоциты, макрофаги. В норме в спинномозговой жидкости содержатся только лимфоциты.

Для получения полной характеристики клеточного состава спинномозговой жидкости исследуются окрашенные препараты. Клетки жидкости окрашиваются хуже, чем клетки крови. Существует несколько способов окраски: по Розиной, Возной, Папаниколау, Алексееву, Май-Грюнвальду, Паппенгейму.

Определение характера плеоцитоза методом люминисцентной микроскопии

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю спинномозговой жидкости и смешивают ее с красителем флюорохромов (смесь водно-солевых растворов акридинового оранжевого и родамина в разведении 1:20000). Приготовленный препарат исследуют под люминесцентным микроскопом МЛ-2 в сине-фиолетовых лучах видимого спектра, применяя комбинации светофильтров возбуждения: ФС 1—4, СЗС 14—4, БС 8—2 и запирающий светофильтр ЖС-1 с иммерсионным объективом. В качестве нефлюоресцирующего иммерсионного масла для исследования применяют диметилфталат (диметиловый эфир ортофталевой кислоты).

На темном фоне поля зрения полинуклеары и лимфоциты легко выявляются по зеленому свечению цитоплазмы. Подсчитывают подряд 100 клеток, учитывая количество лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов.

Лимфоциты отличаются от нейтрофильных гранулоцитов по характеру ядра (глыбчатой структуры с оранжевыми включениями) и ярко-зеленой флюоресценции.

Нейтрофильные гранулоциты имеют четкую структуру, хроматин их ядер светится диффузно, однородным ярко- зеленым цветом. Цитоплазма желто- зеленая, в ней рассеяны кирпично-красные гранулы.

В случаях незначительного цитоза нативную спинномозговую жидкость центрифугируют и изучают осадок.

Люминисцентно-микроскопическое исследование спинномозговой жидкости позволяет легко сделать заключение о нейтрофильном, лимфоцитарном или полиморфно-клеточном характере плеоцитоза.

Морфологическая характеристика клеток спинномозговой жидкости

Лимфоциты

В спинномозговой жидкости здоровых людей встречаются малые и средние лимфоциты (1—2 в 1 мкл) размером 4—6 мкм. Это клетки округлой формы с большим глыбчатым ядром и очень узкой цитоплазмой.

При лимфоидном плеоцитозе (туберкулезный менингит, цистицеркоз) наряду с малыми и средними появляются большие лимфоциты (8—9 мкм), изредка можно обнаружить лимфоциты с прямым делением ядра.

Количество лимфоцитов (наряду с другими клетками) увеличивается в спинномозговой жидкости при опухолях мозга, хроническом течении менингита. При нейрохирургических заболеваниях увеличение числа лимфоцитов в послеоперационном периоде возникает вслед за повышением количества нейтрофильных гранулоцитов и свидетельствует о благоприятном исходе.

Плазматические клетки

Плазматические клетки можно обнаружить в спинномозговой жидкости только при длительно текущих воспалительных процессах в ткани мозга и мозговых оболочках. Морфология плазматических клеток такая же, как в крови или пунктате костного мозга.

Это клетки округлой формы с эксцентрически расположенным ядром и интенсивно окрашенной, базофильной цитоплазмой. В некоторых случаях количество их может достигать 26%. Встречаются плазматические клетки также в послеоперационном периоде и при вялом течении репаративных процессов при травмах мозга.

Гистиоциты

В нормальной спинномозговой жидкости иногда обнаруживаются в виде единичных экземпляров.

В окрашенных препаратах гистиоциты имеют большое ядро и относительно узкую цитоплазму. Величина клеток от 7 до 10 мкм, форма округлая или неправильная. Ядро бобовидной или неправильной лопастной формы, нормохромное. Ядрышки видны в нативных препаратах при фазовоконтрастной микроскопии.

При туберкулезном менингите в спинномозговой жидкости обнаруживается большое количество гистиоцитов, расположенных раздельно и скоплениями, цитоплазма их базофильная, окрашивается более интенсивно.

Согласно имеющимся данным, клетки некоторых видов нейроглии могут превращаться в гистиоциты. Большое количество гистиоцитов в спинномозговой жидкости обнаруживается у больных, перенесших оперативное вмешательство на головном или спинном мозге (что указывает на активную тканевую реакцию и нормальное заживление раны), а также у лиц, страдающих туберкулезным менингитом и цистицеркозом при вялом течении воспалительного процесса. При опухолях головного мозга с прорастанием в подпаутинное пространство или в стенки желудочков гистиоциты могут появляться в спинномозговой жидкости в сочетании с макрофагами и измененными клетками, что характерно для возникновения вокруг опухоли реактивной зоны.

Макрофаги

Макрофаги образуются из одно- и многоядерных клеток эндотелия паутинной мозговой оболочки и моноцитов. Элементы эндотелия паутинной мозговой оболочки отделяются от синцития и превращаются в округлые клетки, обладающие амебовидным движением и проникающие в спинномозговую жидкость.

Макрофаги активно поглощают и переваривают клетки и другие элементы, попадающие в спинномозговую жидкость при патологических процессах, способствуя ее очищению. Включения в цитоплазме макрофагов легко дифференцируются в камере и в окрашенных препаратах.

Макрофаги фагоцитируют эритроциты, разрушенные или неизмененные нейтрофильные гранулоциты, капли жира, кристаллы гематоидина и др. Часто в цитоплазме макрофага имеются вакуоли различной величины или одна большая вакуоль, которая занимает почти всю цитоплазму, ядро при этом смещено к периферии. В таких случаях клетка имеет вид перстня — перстневидный макрофаг.

В норме макрофаги в спинномозговой жидкости отсутствуют. Появление их при нормальном цитозе свидетельствует о геморрагии или воспалительном процессе в центральной нервной системе. Большое количество макрофагов в спинномозговой жидкости в послеоперационном периоде указывает на активную санацию (положительный прогноз). Небольшое количество макрофагов или их отсутствие при выраженном плеоцитозе — неблагоприятный прогностический признак.

Зернистые шары — ксантомные клетки

Зернистые шары (ксантомные клетки) представляют собой большие макрофаги с множественными включениями капелек жира в цитоплазме.

Это чаще всего клетки округлой формы, окрашенные фуксином в темно-коричневый цвет. При обработке спинномозговой жидкости суданом III зернистые шары окрашиваются в оранжево-красный цвет.

Обнаруживаются в спинномозговой жидкости при попадании в нее жидкости из кист разной этиологии, при распаде ткани мозга (вместе с каплями жира), иногда в послеоперационном периоде, при некоторых опухолях мозга (краниофарингиоме, эпендимоме и др.). Если опухоль располагается вблизи желудочков мозга, то зернистые шары чаще всего выявляются в спинномозговой жидкости из желудочков. Источником зернистых шаров являются микроглиоциты, а также олигодендроциты, клетки наружной оболочки сосудов и паутинной оболочки.

Нейтрофильные гранулоциты

Нейтрофильные гранулоциты в спинномозговой жидкости сходны с нейтрофильными гранулопитами крови, их цитоплазма (в счетной камере и в нативных препаратах) часто вытянута или имеет выпячивания (псевдоподии). Это разнообразие форм клеток наблюдается в первые 10—15 мин после взятия спинномозговой жидкости и указывает на сохранение нейтрофильны- ми гранулоцитами способности передвигаться. Характерным является сегментированное ядро, количество сегментов в котором колеблется от двух до пяти; палочкоядерные нейтрофильные гранулоциты встречаются довольно редко.

При хранении спинномозговой жидкости нейтрофильные гранулоциты изменяются раньше, чем другие клетки. Ядра нейтрофильных гранулоцитов могут подвергаться лизису или сегменты становятся округлыми, с четкими контурами, соединенными тонкой перемычкой; в дальнейшем они приобретают вид отдельных гранул. Нейтрофильный гранулоцит, у которого сохраняется только один сегмент ядра округлой формы, по виду напоминает нормобласт. Встречаются набухшие нейтрофильные гранулоциты с нечеткими контурами сегментов, занимающих почти всю цитоплазму. В окрашенных препаратах можно наблюдать все стадии распада нейтрофильных гранулоцитов — от набухания ядра до полного разрушения структуры клетки, когда контуры цитоплазмы не видны, а сегменты ядра становятся бесформенными, состоящими из нежной сеточки хроматина. Принадлежность этих клеток к нейтрофильным гранулоцитам можно установить только по реакции на пероксидазу: наличию зелено-желтых или коричневых гранул в разрушенной цитоплазме.

Иногда в спинномозговой жидкости встречаются нейтрофильные гранулоциты с пикнотичным ядром в виде гиперхромных комочков неправильной формы.

Нейтрофильные гранулоциты появляются в спинномозговой жидкости при кровоизлияниях в подпаутинное пространство, воспалительных заболеваниях нервной системы, после нейрохирургических операций. Наличие нейтрофильных гранулоцитов при примеси крови в спинномозговой жидкости указывает на воспаление мозговых оболочек.

Преобладание неизмененных нейтрофильных гранулоцитов свидетельствует об остром воспалительном процессе.

Внезапное появление нейтрофильного плеоцитоза наблюдается при прорыве абсцесса под оболочки мозга.

При абсцессе, расположенном в глубине ткани мозга, обычно наблюдается нерезко выраженный плеоцитоз с преобладанием лимфоцитов.

При затухании воспалительного процесса в спинномозговой жидкости появляются дегенерированные формы нейтрофильных гранулоцитов.

Наличие измененных и неизмененных нейтрофильных гранулоцитов характерно для продолжающегося воспалительного процесса. Следует учитывать, что неизмененные нейтрофильные гранулоциты появляются в спинномозговой жидкости при примеси свежей крови, в таких случаях необходимо корригирующее определение цитоза.

Эозинофильные гранулоциты

Эозинофильные гранулоциты в нативных препаратах спинномозговой жидкости дифференцируют с другими клетками по наличию характерной блестящей крупной зернистости, заполняющей цитоплазму. Клетки с двухлопастным ядром встречаются редко, чаще всего наблюдаются одноядерные формы. В окрашенном препарате морфология эозинофильных гранулоцитов такая же, как в крови. В спинномозговой жидкости чаще всего обнаруживаются разрушенные эозинофильные гранулоциты.

Содержание эозинофильных гранулоцитов в спинномозговой жидкости при цистицеркозе колеблется от 1 до 46%.

Возникновение менингита как осложнения цистицеркозного арахноидита сопровождается появлением нейтрофильного плеоцитоза и уменьшением количества эозинофильных гранулоцитов. Для абсцедирования эхинококкового пузыря в головном мозге характерно присутствие в его содержимом нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов, что служит вспомогательным признаком при дифференциации его с абсцессом. Иногда большое количество эозинофильных гранулоцитов можно обнаружить в содержимом кист опухолей головного и спинного мозга (невриноме, краниофарингиоме, эпендимоме, метастазах рака в головной мозг). Выраженное увеличение количества эозинофильных гранулоцитов в спинномозговой жидкости может отмечаться после желудочковой цистерноскопии.

После удаления опухоли мозга при активном заживлении послеоперационной раны увеличивается количество эозинофильных гранулоцитов, что можно расценивать как местную аллергическую реакцию мозговых оболочек на травму и всасывание продуктов тканевого распада.

Измененные клетки и тени клеток

Благодаря цитолитическим свойствам спинномозговой жидкости клетки, находящиеся в ней продолжительное время, сохраняют лишь контуры цитоплазмы и остатки ядер. Определить их морфологическую принадлежность не представляется возможным. Чаще всего таким изменениям подвергаются нейтрофильные гранулоциты, иногда это клетки злокачественных опухолей. Легко подвергаются цитолизу клетки паутинной оболочки и эпендимы желудочков мозга.

Тканевые базофилы встречаются в спинномозговой жидкости после нейрохирургических вмешательств.

Клетки паутинной мозговой оболочки в спинномозговой жидкости

Клетки паутинной мозговой оболочки (арахноэндотелия) — это клетки однослойного эпителия, их можно дифференцировать как при подсчете цитоза в камере, так и в окрашенных препаратах, приготовленных из осадка спинномозговой жидкости. Это довольно крупные клетки неправильной формы или округлые с относительно небольшим круглым или овальным ядром, расположенным в центре.

Ядра клеток окрашиваются гипохромно, а цитоплазма — в бледно- или серовато-голубой цвет, при этом она имеет неровные контуры и часто содержит включения фагоцитированных частиц (капельки жира, клеточные элементы, вакуоли). Цитоплазма клеток паутинной мозговой оболочки нередко разрушена, в таких случаях обнаруживаются характерные ядра и обрывки цитоплазмы. Хроматин ядер имеет мелкопетлистую или зернистую структуру, иногда заметно одно голубое ядрышко. Величина ядер от 5 до 19 мкм.

Наличие в спинномозговой жидкости единичных клеток паутинной оболочки еще не свидетельствует о патологии, так как эти клетки выстилают подпаутинное пространство и, слущиваясь, попадают в спинномозговую жидкость. Увеличение количества клеток паутинной оболочки наблюдается при арахноидите, цистицеркозе мозга. В содержимом арахноидальной кисты обнаруживаются отдельно расположенные клетки паутинной оболочки и их симпласты в виде групп ядер различной величины и интенсивности окраски, окруженных бледной цитоплазмой без четких границ между клетками.

Клетки сосудистого сплетения

Из сосудистого сплетения желудочков в спинномозговую жидкость могут попадать полигональные, округлые, иногда цилиндрические крупные (15—19 мкм) клетки. Небольшие (4—5 мкм) ядра расположены в центре или эксцентрически, гиперхромные, цитоплазма эозинофильная, интенсивно окрашенная. В цитоплазме клеток сосудистого сплетения имеется зернистость, иногда в виде глыбок и включений, величиной 1—3 мкм, округлой или неправильной формы, зеленоватого или голубоватого цвета. В некоторых клетках могут обнаруживаться вакуоли или захваченные эритроциты.

Клетки сосудистого сплетения чаще всего обнаруживаются в жидкости из желудочков мозга.

Клетки эпендимы желудочков мозга в спинномозговой жидкости

Клетки эпендимы желудочков мозга в спинномозговой жидкости, полученной при поясничной пункции, легко разрушаются в процессе приготовления и окраски препарата. В окрашенном мазке они имеют вид образований, состоящих из ядер овальной формы с нежной структурой. В некоторых клетках сохранившаяся цитоплазма окружает ядро в виде неширокой каймы.

В жидкости из желудочков мозга чаще всего встречаются клетки эпендимы с сохранившейся структурой, по морфологическим признакам напоминающие клетки паутинной мозговой оболочки, но ядра их окрашены бледнее и имеют более нежное, гомогенное распределение хроматина. Полюсы овальных клеток эпендимы часто заостренные, цитоплазма имеет сероватый оттенок. Встречаются отдельно расположенные клетки и большие скопления, в которых могут не определяться границы отдельных клеток.