射精の細胞化学研究
細胞化学反応, 射精で実施, 化学組成とその細胞の機能活性への洞察を提供.
酸性ホスファターゼ活性の射精の決意
酸性ホスファターゼ活性 血液中の活性よりも大きい何回も射精. 酸性ホスファターゼは前立腺分泌物の一部であります, その生産は、男性の性腺刺激ホルモンによって刺激されます. それは精子で検出される細胞化学反応および精液の他の細胞を使用して. 活性は、そのことによって決定されます 方法ゴールドバーグ - バルカ.
試薬.
1. ホルマリンアルコール (準備の一部 40 % ホルマリンは9部に溶解します 96% エチルアルコール).
2. Pararozanilin: 1 PhucのためのG塩基性フクシン- で加熱中に溶解sinosernistoy酸 25 ミリリットル 2 N塩酸; 冷却, 冷蔵庫で濾過し、格納されています. 試薬耐性.
3. 硝酸ナトリウム水溶液 4 %. 4. 酢酸緩衝液のためのメチルグリーンの溶液 2 % (pHは - 5). 得られた溶液をクロロホルムで洗浄しました, クロロホルムのほぼ等量混合し、 2 % メチルグリーンソリューション. 日中は急落, した後、紫色に塗られ、クロロホルムを分離漏斗を用いて除去しました.
5. Inkubatsionnaya環境, 二つの成分から成ります.
- コンポーネント: 20 MGナフトール-A5 - リン酸に溶解し 0,5 (0,3) mlのジメチルホルムアミド, 加えます 40 ミリリットル 0,1 Nの酢酸ナトリウムの溶液および濾紙で濾過; 研究日準備.
- B成分: 8 滴 4 % 硝酸ナトリウム溶液と混合しました 8 pararozanilinaをドロップ; 元臨時です. インキュベーション培地の両方の成分を得るために接続されています (pHは5,2-5,4). 必要に応じて、任意のpHを修正 50 % 酢酸, 苛性アルカリ溶液.
メソッド. 新鮮な精液を遠心分離し, 精子の数が多い遠心分離を分配するとき. 堆積物から研磨されたガラスの薄いストロークを準備, その, ならびに血液塗抹標本, 風乾されました. ホルマリンアルコールにしてビーカー中に浸漬することによって固定され乾燥塗抹 30 から (もういや) 蒸留水で洗浄し. そして、スミアはインキュベーション培地を入れたビーカー中に浸漬し、温度のインキュベーターに配置されています 37 °C 2 いいえ. その後、それらを蒸留水ですすぎました, 浸漬 10 メチルグリーンの溶液とガラス中の分 (核のための対比), すぐに水で洗い流し, 濾紙で乾燥させ、液浸顕微鏡システムによって検査.
酸性ホスファターゼ活性は、平均細胞化学係数で表すことができます。 (SCK) 上 polukolychestvennomu法Astaldi-ベルガ. 式に従って
SCK =(3* 2 * B * 1)/100
分子内の数字は、色の強度を示し、ここで (最大 - 3, 中程度 - 2, 足跡 - 1), と文字 - 細胞の割合によっては、特定の色の強さを数え; 図 100 分母に - 細胞の総数を数え.
例えば, カウント 100 セル, そのうちの最大の色の強さを持っています 20 セル, 中程度 - 20 そして、次のと - 60 セル. ここに:
SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6
ユニット内に配置精子酸ホスファターゼは、ヘッドの上部に赤橙色をキブル.
ヘッドの忙しいクロマチン部分が緑色で、酸ホスファターゼが含まれていません.
酸ホスファターゼのより拡散した淡い色は頭部の下の部分の周りに検出されました, 時にはそれが精子の首にまで及びます. 通常の精子射精中の酸性ホスファターゼの中間細胞化学係数が2.0〜2.4であり、.
精子形成の細胞の細胞質に顆粒の蓄積を明らかにしました, 明るく特定に塗ら (赤橙色) 色. 入り組ん精細管の支持細胞中で, 多くの場合、大幅に積極酸ホスファターゼについて染色, 半透明の非着色ヘッド (xromatin) 精子. 組織球及びマクロファージは、いくつかの顆粒を含みます, 積極酸ホスファターゼについて染色. 単離されたリンパ球, そして時には、好中球は、個々のペレットであります, 酸性ホスファターゼ活性を有します.
コハク酸脱水素酵素活性の決意 (SDG) 射精で
Sukcinatdegidrogenaza - 酵素, 酸化還元反応に関与します, 射精のかなりの数の細胞に含まれます. しかし、様々な病理学的プロセスにおけるその活性の変化の性質はまだよく理解されていません. 細胞中のコハク酸脱水素酵素活性はNartsissovaの修正された方法によって決定されます.
試薬.
1. アセトン - トリロン (アセトン - 60 ミリリットル, distillirovannaya水 - 40 ミリリットル, トリロンB - 250 ミリグラム).
2. メチルグリーンの溶液 2 % (同じ染料, 酸性ホスファターゼのために使用されます).
3. Inkubatsionnaya環境, 以下の成分からなります:
と) リン酸緩衝液 (pHは7,2-7,4) - 10 ミリリットル;
へ) 5,4 % コハク酸ナトリウムの溶液 - 10 ミリリットル;
で) コンプレIII (13 中に希釈したMG 5 mlの蒸留水);
G) 蒸留水 - 5 ミリリットル;
D) 紫色のニトロテトラゾリウム (10 中に希釈したMG 10 mlの水).
すべてのコンポーネントが1つのパッケージに混合し、冷蔵庫に保存されています. 準備されたメディアを再利用することができる - のために 10 日以上.
メソッド. スミア, 射精から調製, Trilon-のためにアセトン中で固定 30 から, 蒸留水で洗浄し、空気中で乾燥. そして、スミアは、インキュベーション培地に浸漬し、温度のインキュベーターに配置されています 37 °C 1 いいえ, その後、それらを蒸留水および、メチルグリーンdokrashivayut洗浄します 10 M. その後、再びすぐに水で洗浄し、, 濾紙で乾燥させ、液浸顕微鏡システムによって検査.
通常の精子 コハク酸デヒドロゲナーゼの活性が高いです, 大青紫色顆粒で表さ, その, 一緒にマージ, 密な塊を形成します, 首の精子を充填, いくつかの精子個々のペレットは、頭の周りに発見されました.
一緒に融合顆粒を計算することはできません, したがって、マイクロメートルで測定されたコハク酸脱水素酵素、着色部精子の活性を決定します. 精子のコハク酸デヒドロゲナーゼのために特別塗装の長さに沿って、精子中の酵素の活性の程度で判断されています. 接眼マイクロメータとオブジェクトマイクロメートルの長さで、特定の色のついた部分で測定されます 100 spermatozoidax. 精子の染色切片でカウントの長さを追加し、によって得られた図形を分割 100, 平均の長さを受け取ります, 単一の精子のためsuktsinatdegidrogenaznuyu活性を発現しています. 通常は、4,3±0.7 mで. この計算LDH活性が最も有益であるため、研究目的のために使用することをお勧めします.
実際には全体のアプリケーションの場合、この方法は非常に複雑であり、, コハク酸デヒドロゲナーゼの量を表現することが好ましいです。 Astaldi法ベルガ. 精液中の精子の中間細胞化学係数LDHは正常です 2,7 0.3±.
精子形成細胞に LDH活性は、大青紫色顆粒の塊の形で検出され, 多くの場合、大きな塊にマージ, 細胞質の異なる領域に位置します. 精子形成に達するの細胞の中央の細胞化学的要因 2,0. 射精の細胞の成熟と、成熟精子中のLDHの活性を増加させる超えます 2,0. キブルSDG見つかった特定のリンパ球の細胞質中.
精液中のペルオキシダーゼ活性の決意
精子, 精子形成細胞と回旋精細管の支持細胞は、ペルオキシダーゼ不足しています.
好中性顆粒球射精ペルオキシダーゼ活性は、有意な程度に発現され、病理学的プロセスの性質に応じて変えることができます, 同様に、末梢血中の. 好中球ペルオキシダーゼ活性のレベルは、男性の生殖器官における炎症過程のその機能の状態と活性を評価することが重要です. 精液グラハム·ノールとAstaldi-ベルガによる酵素の会計活動のステンド塗抹標本は、類似の血液塗抹標本であります.
射精の細胞におけるペルオキシダーゼ活性は、以下によって決定されます グラハム·ノールの方法.
試薬.
1. ホルマリンアルコール (同じ, その酸性ホスファターゼ).
2. Peroksidaznыy試薬: ʙenzidin (メスの先端に) 中に溶解し 6 ミリリットル 96 % エチルアルコール, 加えます 4 蒸留水のミリリットル 0,02 ミリリットル 3 % 過酸化水素. 5-6日間使用可能な試薬.
3. 1-2の希釈でロマノフスキー色素の低下します 1 mlの蒸留水.
メソッド. スミアを固定した新鮮な精液 30 アルコールとホルマリン, 流水で洗浄し、乾燥. そして5-7分間ストロークペルオキシダーゼ試薬を注ぎます, 徹底的に流水で洗浄し、乾燥. その後、彼らは15をdokrashivayut 20 分染料ロマノフスキー, 流水で洗浄し、, 液浸顕微鏡システムを用いて乾燥し、mikroskopiruyut.
好中性顆粒球でペルオキシダーゼに陽性反応が多数の主要な黄金褐色の顆粒を明らかにするとき. 計算に必要な白血球の数が多いです 平均細胞化学因子 (SCK). 組織球の個々のペルオキシダーゼの細胞質は、顆粒として小さなクラスターとして存在し、.
精液中のグリコーゲンの決意
種々の細胞内のグリコーゲン含有量の変化は、それらの機能または病理学的プロセスの開発の証拠に影響を与えます. 細胞中のグリコーゲンの決意を行います マクマナスによる.
試薬.
1. 過ヨウ素酸水溶液 1 % (使用するための準備).
2. Sernistaya水: 5 ミリリットル 10 % カリウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウム, 5 ミリリットル 1 N塩酸, 水に 100 ミリリットル (使用するための準備).
3. 試薬Shiffa: 1 fuksinosernistoy酸G塩基性フクシン, 磁器乳鉢でプレ破砕, のための一定の振とう下で溶解されています 5 分 200 沸騰蒸留水のミリリットル, 濾紙を通過しまで冷却しながら添加しました 50 °C 20 ミリリットル 1 N塩酸, に冷却したとき 25 °C - 1 Gカリウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウム. 準備された試薬は冷蔵庫に保管されています 24 時間そのあとで彼は啓蒙と消費vitsyaに適さないとなります
4.メチルグリーンの水溶液 2 %, クロロホルムで洗浄
5.化学的に純粋なメチルアルコール.
メソッド.
シン乾燥スミアを固定するための化学的に純粋なメチルアルコールを射精します 3 M, 蒸留水で洗浄し、ビーカーに浸漬 1 % 水性ヨウ素酸 5 M. 次に、このスミアを蒸留水で洗浄し, 乾燥しました, 亜硫酸再び水で洗浄し、乾燥させ.
にシッフ試薬とのカップに浸し、さらに綿棒 15 M, 硫黄水の3つの部分でそれらをすすぎます (上 3 分ごと), 洗浄 10 水と細胞核dokrashivayutで分 3 分メチルグリーン. その後、再び水綿棒ですすぎ, 液浸系顕微鏡を用いてろ紙および乾燥mikroskopiruyut.
成熟した精子ではグリコーゲンが不足しています. 若い精子の質に, 特に「襟」と, グリコーゲンの痕跡を明らかにしました (±), 個々のペレット状の頭部の上部または「カラー」で、時には.
精子形成細胞に グリコーゲンはチェリーレッド顆粒の形態で大量に発見されました, 全体の細胞質を埋めます. 細胞の成熟と成熟した精子の彼が消失するまでグリコーゲンを失います. Spermatocitы グリコーゲンは細胞質中でだけでなく、含まれています, だけでなく、核内で. 入り組ん精細管の支持細胞では、グリコーゲンは、チェリーレッドの顆粒と拡散であります. 射精で成熟した好中球顆粒球, ならびに末梢血塗抹標本で, グリコーゲンの有意な量を含有します. 好中球顆粒球の射精大幅に増加グリコーゲンの量と慢性前立腺炎では、ペルオキシダーゼの活性を増加させます. 単離されたリンパ球では時々、通常のグリコーゲン顆粒に見られます.
マクロファージ チェリーレッドの色に染色されたグリコーゲンの背景精液塗抹標本の痕跡が含まれています, これはグリコサミノグリカンの射精大量の血漿中の存在を示します (mukopolisaxaridov).
リボ核酸の定義 (RNA) 射精で
細胞内のRNAのレベル上昇 それは彼らの成長に対して高い活性を示します, sekretornoй, 合成やその他の活動. 多くの場合、再生するこれらの細胞の能力の低下と関連付けられ若い細胞におけるRNAの量を減少させます. 細胞中のRNA含有量を決定します チキンコープの方法.
試薬.
1. 試薬チキンコープ: 別途用意しました 2 % メチルグリーンソリューションとピロニン, メチルグリーン溶液を注意深くクロロホルムで洗浄しました; 色素作業溶液を混合することによって調製されます 2 % ソリューション·ピロニン (12,5 ミリリットル) と 2 % メチルグリーンソリューション (7,5 ミリリットル) 追加しました 30 mlの蒸留水. 色素耐性, 冷蔵庫に保存.
2. ロック - 化学的に純粋なメチルアルコールを.
メソッド. スミアを、メタノールで固定されています。 3 M, 色素作業溶液のピロニンメチルグリーン 15 M, すぐに水で洗浄し、濾紙で乾燥. 液浸顕微鏡システムを用いてMikroskopiruyut. 鮮やかな赤い色で塗らのRNAピロニン, 細胞核 - メチルグリーングリーン.
成熟した精子は、RNAが含まれていません. 細胞は、RNA精子形成が豊富です, それらが成熟するにつれて細胞の数を減少します. spermatohonyyで 細胞質豊かなピンク色, spermatotsytovで どのようなフェージング, と 精子細胞で 紅梅色. 若い精子の「カラー」 ピンクのは、主に「カラー」を描きました.
精子, その開発の最終段階にあり, 入り組ん精細管の支持細胞にピンクの物質の残骸を失います (RNA) そして成熟精子になります.
精子形成の細胞では、グリコーゲンを多量に含んでいます, RNAが大幅にLDH活性およびCFを発現させました. しかし, 通常, 射精のこれらの単離された細胞, したがってCBFV非現実的をカウント. このような場合には、結論の物語の形式に限定.
白血球の細胞化学的特性評価 それは彼らの機能活性を示す重要な指標であります. 射精物中の白血球の数をカウントは同じで搬送されます, 射精と末梢血中の他の細胞と同様に.
射精の通常の方法により染色塗抹標本で (azurozinovymi混合物, ヘマトキシリン - エオシンなど。), 同様に、ネイティブの準備は常に白血球を区別することは容易ではありません, 精子形成の細胞, 前立腺上皮, 組織球、およびその他の要素.
形態学的に関連して細胞化学技術は、多くの場合、細胞の種類の確立を支援します. そう, 発現したペルオキシダーゼ活性, 大黄金褐色のビーズを提供, 細胞の全体の質を満たします, 成熟した好中球の特徴, 他の細胞中で、このような反応が観察され. グリコーゲンへの激しい反応は、好中球及び精子形成の細胞の典型的なものです, これらは、ペルオキシダーゼ活性を有さありません. 細胞および精子形成のない成熟顆粒に含まれるRNA. 精子形成の細胞は、酸性ホスファターゼの反応を顕著にしています, と好中性顆粒球、彼女は非常に不十分発現し、その上. D.
