Studio cytochemical del liquido seminale

Reazione cytochemical, condotto con eiaculato, fornisce intuizioni nella composizione chimica e l'attività funzionale delle cellule.

Determinazione dell'acido dell'attività della fosfatasi eiaculare

Attività della fosfatasi acida eiaculare molte volte superiori sua attività nel sangue. Fosfatasi acida fa parte delle secrezioni prostatiche, la sua produzione è stimolata da gonadotropina maschio. Utilizzando reazioni citochimiche viene rilevato nello sperma e altre cellule del liquido seminale. L'attività è determinato dalla sua Metodo Goldberg - Barka.

Reagenti.

1. Alcol formalina (una parte del ready 40 % formalina disciolto in nove parti 96% alcol etilico).

2. Pararozanilin: 1 g fucsina base per Phuc- L'acido sinosernistoy sciolti durante il riscaldamento in 25 ml 2 Acido cloridrico N; raffreddato, filtrato e conservato in frigorifero. Reattivo resistente.

3. Una soluzione acquosa di nitrato di sodio 4 %. 4. Una soluzione di verde metile per tampone acetato 2 % (pH - 5). La soluzione risultante è stata lavata con cloroformio, poi mescolati per circa uguali quantità di cloroformio e 2 % soluzione verde metil. Caduto durante il giorno, e poi verniciato nel colore viola, il cloroformio è stato rimosso con un imbuto separatore.

5. Ambiente Inkubatsionnaya, costituito da due componenti.

• Un componente: 20 mg naftolo-A5-fosfato è stato sciolto in 0,5 (0,3) ml dimetilformammide, aggiungere 40 ml 0,1 N soluzione di acetato di sodio e filtrata attraverso carta da filtro; preparazione di una giornata di studio.
• Componente B: 8 gocce 4 % soluzione di nitrato di sodio è stata mescolata con 8 scende pararozanilina; sono ex tempore. Per ottenere entrambe le componenti del mezzo di incubazione è collegato (pH 5,2-5,4). Se necessario, correggere qualsiasi pH 50 % acido acetico, una soluzione di alcali caustici.

Metodo. Eiaculato fresco viene centrifugato, quando un gran numero di spermatozoi dispense centrifugazione. Da sedimenti preparare tratti sottili di vetro lucido, che, così come strisci di sangue, aria secca. Gli strisci essiccati fissati immergendoli in un bicchiere con l'alcol in formalina a 30 da (non più) e lavato con acqua distillata. Poi gli strisci sono immersi in un becher con medium di incubazione e poste in un incubatore a temperatura 37 ° C 2 no. Successivamente, essi sono stati sciacquati in acqua distillata, immerso per 10 min in un bicchiere con una soluzione di verde metil (counterstained per nuclei), rapidamente lavato via con acqua, asciugati con carta da filtro ed esaminati dal sistema di microscopio ad immersione.

Attività della fosfatasi acida può essere espressa per il fattore medio citochimico (SCK) da Metodo polukolychestvennomu Astaldi-Verga. Secondo la formula

SCK =(3*a b 2 * a * 1)/100

dove i numeri al numeratore indica l'intensità del colore (massimo - 3, moderata - 2, orme - 1), e le lettere - della percentuale di cellule contate una certa intensità colore; cifra 100 nel denominatore - il numero totale di cellule contate.

Per Esempio, contati 100 cella, di cui con un intensità massima del colore 20 cella, moderata - 20 e con il seguente - 60 cella. Qui:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6

La fosfatasi acida spermatozoi trova nell'unità Kibbles rosso-arancione nella parte superiore della testa.

Occupato parte cromatina della testa è verde e non contiene fosfatasi acida.

È stato rilevato un colore pallido più diffuso sulla fosfatasi acida intorno alla parte inferiore della testa, e talvolta si estende al collo dello sperma. Medio coefficiente citochimica di fosfatasi acida nel normale eiaculazione sperma è 2.0-2.4.

Nel citoplasma di cellule di spermatogenesi rivelato accumulo di granuli, dipinte a colori vivaci in uno specifico (rosso-arancio) colore. Nelle cellule di sostegno dei tubuli seminiferi contorti, spesso fortemente macchiato positivamente per fosfatasi acida, traslucido testa non colorato (xromatin) sperma. Istiociti e macrofagi contengono qualche granello, positivamente colorate per fosfatasi acida. In linfociti isolati, e talvolta neutrofili sono i singoli pellet, avente una attività di fosfatasi acida.

Determinazione dell'attività succinato deidrogenasi (SDG) nel liquido seminale

Sukcinatdegidrogenaza - Enzima, partecipando a reazioni redox, contenuta in cellule in un numero significativo di eiaculato. Tuttavia, la natura del cambiamento della sua attività in vari processi patologici è ancora ben compresa. Deidrogenasi Succinate nelle cellule è determinata da un metodo modificato di Nartsissova.

Reagenti.

1. Acetone-Trilon (acetone - 60 ml, distillirovannaya acqua - 40 ml, Trilon B - 250 mg).

2. Una soluzione di verde metil 2 % (la stessa tintura, che viene utilizzato per la fosfatasi acida).

3. Ambiente Inkubatsionnaya, costituito dai seguenti componenti:

e) tampone fosfato (pH 7,2-7,4) - 10 ml;

a) 5,4 % soluzione di sodio succinato - 10 ml;

in) complexone III (13 mg diluito in 5 acqua distillata ml);

g) acqua distillata - 5 ml;

d) nitrotetrazolium viola (10 mg diluito in 10 ml di acqua).

Tutti i componenti sono miscelati in un pacchetto e conservati in frigorifero. Preparato medio può essere riutilizzato - per 10 giorni o più.

Metodo. Strisci, preparata dal liquido seminale, fissato in acetone per Trilon- 30 da, lavati con acqua distillata ed essiccato all'aria. Poi gli strisci sono immersi in mezzo di incubazione e poste in un incubatore a temperatura 37 ° C 1 no, dopo di che vengono lavati con acqua distillata e dokrashivayut verde metile per 10 m. Poi di nuovo rapidamente lavato con acqua, asciugati con carta da filtro ed esaminati dal sistema di microscopio ad immersione.

Sperma normale avere alta attività di succinato deidrogenasi, rappresentata da grandi granuli blu-viola, che, fondendo insieme, formare una massa densa, riempimento collo sperma, alcuni spermatozoi singoli pellet si trovano intorno alla testa.

Calcola fuse insieme granuli non è possibile, pertanto, per determinare l'attività della succinato deidrogenasi parte colorata spermatozoi misurata in micrometri. Lungo la lunghezza del dipinto appositamente per succinato deidrogenasi degli spermatozoi sono giudicati dal grado di attività dell'enzima in sperma. Con micrometro oculare e la lunghezza oggetto micrometri viene misurato in specifiche parte colorata 100 spermatozoidax. L'aggiunta di lunghezza contati in sezioni colorate di spermatozoi, e dividendo la cifra risultante dalla 100, ricevere una lunghezza media, esprimendo attività suktsinatdegidrogenaznuyu per un singolo spermatozoo. Normalmente, si tratta di 4,3 ± 0,7 m. Questa attività di calcolo LDH è la più informativo e si consiglia pertanto di utilizzare per scopi di ricerca.

Per un'ampia applicazione nella pratica, questo metodo è piuttosto complicato, è preferibile esprimere la quantità di succinato deidrogenasi Astaldi-method Verga. Medio citochimica coefficiente LDH di spermatozoi nel liquido seminale è normale 2,7 ± 0,3.

Nelle cellule della spermatogenesi Attività LDH viene rilevata sotto forma di grappoli di granuli di grandi dimensioni blu-violetto, spesso si fondono in grandi gruppi, situati in diverse zone del citoplasma. Fattore Medio cytochemical nelle cellule del raggiunge spermatogenesi 2,0. Con la maturazione delle cellule del liquido seminale ed aumenta l'attività di LDH in spermatozoi maturi supera 2,0. Nel citoplasma di alcuni linfociti trovato crocchette SDG.

Determinazione dell'attività perossidasica nel liquido seminale

Lo sperma, cellule spermatogenesi e cellule di supporto dei tubuli seminiferi contorti perossidasi mancante.

Il granulociti neutrofili attività eiaculato perossidasi è espresso in misura significativa e può variare a seconda della natura del processo patologico, così come nel sangue periferico. Il livello di perossidasi in neutrofili è importante per valutare il loro stato funzionale e l'attività del processo infiammatorio negli organi genitali maschili. Strisci colorati di sperma Graham-Knoll e l'attività contabile dell'enzima da Astaldi-Verga sono analoghi striscio di sangue.

Perossidasi in cellule del liquido seminale è determinato metodo di Graham-Knoll.

Reagenti.

1. Alcol formalina (stesso, e che la fosfatasi acida).

2. Peroksidaznыy reagente: ʙenzidin (sulla punta di un bisturi) disciolto in 6 ml 96 % alcol etilico, aggiungere 4 ml di acqua distillata 0,02 ml 3 % acqua ossigenata. Reagente utilizzabile per 5-6 giorni.

3. Romanovsky Dye a una diluizione di 1-2 gocce su 1 acqua distillata ml.

Metodo. Sperma fresco strisci sono stati fissati per 30 formalina con l'alcol, lavato con acqua corrente ed essiccato. Poi versare colpi reagente perossidasi per 5-7 minuti, accuratamente lavati in acqua corrente ed essiccati. Dopo di che hanno dokrashivayut 15 20 min tintura Romanovsky, lavato con acqua corrente, essiccato e mikroskopiruyut utilizzando il sistema di microscopio ad immersione.

Quando una risposta positiva a perossidasi in granulociti neutrofili rivela grandi granuli d'oro-marrone in gran numero. Con un gran numero di cellule bianche del sangue necessario calcolare la Fattore medio cytochemical (SCK). Il citoplasma di istiociti perossidasi individuo è presente come piccoli cluster quali granuli.

Determinazione del glicogeno nel liquido seminale

I cambiamenti nel contenuto di glicogeno in varie cellule influenzano la loro funzione o evidenza di sviluppo del processo patologico. Determinazione del glicogeno nelle cellule è effettuata da McManus.

Reagenti.

1. Una soluzione acquosa di acido periodico 1 % (preparando a utilizzare).

2. Acqua Sernistaya: 5 ml 10 % potassio o di sodio metabisolfito, 5 ml 1 Acido cloridrico N, acqua 100 ml (preparando a utilizzare).

3. Reattivo Shiffa: 1 g fucsina base per l'acido fuksinosernistoy, pre-schiacciato in un mortaio di porcellana, sono sciolti sotto costante agitazione per 5 min 200 ml di acqua distillata bollente, passato attraverso un filtro di carta ed è stato aggiunto con raffreddamento 50 ° C 20 ml 1 Acido cloridrico N, e una volta raffreddato a 25 ° C - 1 g di potassio o di sodio metabisolfito. Il reagente preparato viene conservato in frigorifero per 24 h dopo di che ha illuminato e diventare non idonei al consumo vitsya

4.La soluzione acquosa di verde metil 2 %, lavato con cloroformio

5.Alcool metilico chimicamente puro.

Metodo.

Strisci sottili essiccato eiaculato fissati alcool metilico chimicamente puro per 3 m, risciacquato con acqua distillata ed immersi in un becher con 1 % acquosa di acido iodico 5 m. Poi gli strisci sono stati lavati con acqua distillata, secco, sulfurea risciacquato in acqua di nuovo e asciugato.

Ulteriori tamponi immersi in una tazza con il reagente di Schiff per 15 m, sciacquare in tre porzioni di acqua sulfurea (da 3 min ogni), lavato 10 min in acqua e nuclei di cellule dokrashivayut 3 min verde metile. Poi di nuovo sciacquati con tamponi di acqua, filtrare carta e asciugato mikroskopiruyut mezzo del microscopio sistema ad immersione.

In spermatozoi maturi glicogeno mancante. Nel citoplasma della giovane sperma, in particolare con il "collare", tracce rivelato di glicogeno (±), talvolta in forma di pellets individuali nella parte superiore della testa o del "collare".

Nelle cellule della spermatogenesi Glicogeno si trova in grandi quantità in forma di un granulato rosso ciliegia, riempie tutto il citoplasma. Con la maturazione delle cellule perdere glicogeno fino alla sua scomparsa in spermatozoi maturi. Spermatocitы glicogeno contiene non solo nel citoplasma, ma anche nel nucleo. Nelle cellule di sostegno dei tubuli seminiferi contorti, il glicogeno è un granuli rosso ciliegia e diffusa. Coppia granulociti neutrofili nel liquido seminale, nonché in striscio di sangue periferico, contengono una quantità significativa di glicogeno. In prostatite cronica in granulociti neutrofili eiaculato aumenta notevolmente la quantità di glicogeno e aumenta l'attività di perossidasi. Nei linfociti isolati a volte si trovano in normali granuli di glicogeno.

I macrofagi contenere tracce di glicogeno Sfondo strisci seminali colorati in colore rosso ciliegia, che indica la presenza nel plasma del liquido seminale grandi quantità di glicosaminoglicani (mukopolisaxaridov).

Definizione di acido ribonucleico (RNA) nel liquido seminale

Elevati livelli di RNA in cellule Essa mostra alta attività contro la loro crescita, sekretornoй, sintetici e altre attività. Diminuendo la quantità di RNA in cellule giovani spesso associato con diminuzione della capacità di queste cellule di rigenerarsi. Contenuto di RNA nelle cellule è determinata il metodo del pollaio.

Reagenti.

1. Reattivo Chicken Coop: preparata a parte 2 % soluzioni verdi metile e pironina, soluzione verde metile è stato accuratamente lavato con cloroformio; soluzione di lavoro colorante viene preparato miscelando 2 % soluzione pironina (12,5 ml) e 2 % soluzione verde metil (7,5 ml) con aggiunta 30 acqua distillata ml. Il colorante resistente, conservato in frigorifero.

2. Bloccare - alcool metilico chimicamente puro.

Metodo. Strisci vengono fissati con metanolo per 3 m, colorante soluzione di lavoro pironina-metil verde 15 m, rapidamente risciacquati con acqua ed essiccato con carta da filtro. Mikroskopiruyut utilizzando il sistema di microscopio ad immersione. RNA pironina dipinto in colore rosso brillante, nuclei cellulari - metile verde.

Sperma maturo, non contengono RNA. Le cellule sono ricche di RNA spermatogenesi, che diminuisce il numero di cellule come fanno maturare. In spermatohonyy citoplasma ricco di colore rosa, in spermatotsytov cosa dissolvenza, e in spermatidi rosa chiaro. In giovane sperma "collare" rosa dipinto prevalentemente "collare".

Sperma, situato nell'ultima fase del suo sviluppo, nelle cellule di supporto dei tubuli seminiferi contorti perdere i resti di una sostanza di colore rosa (RNA) e diventare spermatozoi maturi.

Nelle cellule della spermatogenesi contiene una grande quantità di glicogeno, RNA è stato espresso in modo significativo l'attività LDH e CF. Ma, generalmente, queste cellule isolate nel liquido seminale, quindi contare CBFV impraticabile. In tali casi, limitato alla forma narrazione della conclusione.

Caratterizzazione cytochemical dei leucociti Si tratta di un indicatore importante della loro attività funzionale. Contando il numero di leucociti in sostanza eiaculato viene effettuata nello stesso, Come in altre cellule del liquido seminale e nel sangue periferico.

Negli strisci colorati con i soliti metodi di eiaculare (miscele azurozinovymi, Ematossilina-eosina e altri.), così come i preparativi nativi non sono sempre facili da distinguere leucociti, cellule della spermatogenesi, epitelio prostatico, istiociti e altri elementi.

Tecniche citochimiche in collaborazione con morfologico spesso aiutano stabilire una sorta di cellule. Così, perossidasi espresso, grandi perline dorate-marrone previsti, riempie l'intero citoplasma delle cellule, Caratteristica di neutrofili maturi, in altre cellule si osserva tale reazione. Grave reazione di glicogeno è tipico di neutrofili e di cellule della spermatogenesi, ma queste non hanno perossidasi. RNA contenuto nelle cellule e la spermatogenesi non granulociti maturi. Le cellule della spermatogenesi hanno pronunciato reazione alla fosfatasi acida, e granulociti neutrofili, ha espresso molto male, e così via. d.