Исследование фибринолиза

Для клиники чрезвычайно важно выявление как повышения фибринолитической активности крови, так и ее снижения, что может быть связано либо с интенсивным потреблением плазминогена и его активаторов при их активации и фиксации в сгустках и тромбах, либо с повышением антиплазминовой и антиактиваторной активности плазмы. При этом следует всегда помнить, что интенсивный фибринолиз в сгустках и тромбах, обнаруживаемый по повышению содержании ПДФ в плазме, закономерно сочетается со снижением резерва плазминогена и его активаторов в плазме (циркулирующей крови).

Состояние естественного лизиса сгустков

Общее представление о состоянии естественного лизиса сгустков может дать метод Котовщиковой—Кузника в модификации В. П. Балуды либо в модификации Е. П. Иванова.

Принцип метода состоит в том, что с учетом гематокритного числа и содержания в крови эритроцитов определяется число последних, выпавших из сгустка в осадок за определенный срок инкубации. При повышении фибринолитической активности крови объем этой фракции (третьей) эритроцитов увеличивается. В случае глубокой гипокоагуляции и гипофибриногенемии, при которых образуются неполноценные и более рыхлые сгустки, данных методика может давать ошибочные результаты.

По методике Bidwell в модификации Г. В. Андреенко фибринолиз оценивается по убыли фибрина из сгустков.

Исследование фибринолитической активности эуглобулиновой фракции плазмы крови

Исследование фибринолитической активности эуглобулиновой фракции плазмы крови является важнейшим базисным тестом, что подтверждено комиссией Европейского общества по тромбозам.

Для этого используются либо классические методики определения эуглобулинового лизиса сгустков, либо определение литической активности эуглобулиновой фракции на фибриновых пластинах (в последнем случае влияние разных количеств фибрина на показания теста нивелируется). Лизис в этих тестах происходит благодаря тому, что в эуглобулиновую фракцию выделяются плазминоген и его активаторы, тогда как ингибиторы фибринолиза в основной своей массе удаляются. Поэтому с помощью эуглобулиновых тестов оценивается содержание в плазме крови плазминогена и его активаторов.

При получении крови в условиях основного обмена, т. е. утром натощак, до подъема больного с постели, тканевых активаторов плазминогена в крови почти нет. Следовательно, в таких условиях определяется в основном состояние внутреннего (собственно кровяного) процесса активации плазминогена.

Этот процесс может быть резко ускорен предварительной контактной активацией комплекса факторов XIIa—калликреин—ВМ кининоген каолином, в результате чего эуглобулиновый лизис сокращается с 2,5—3 ч до 2—10 мин. На этом принципе контактной активации основаны методы определения XIIa-зависимого фибринолиза.

Способность эндотелия сосудов выделять в кровь внешний активатор фибринолиза (активатор тканевого типа, АТТ) оценивается по ускорению эуглобулинового лизиса после сжатия сосудов манжетой от аппарата для измерения артериального давления (проба Ойвина—Чекалиной), либо после дозированной физической нагрузки на велоэргометре, или при фармакологической стимуляции (производными вазопрессина — десмопрессином или адиуретином).

В литературе описано множество модификаций этих методик.

Так, например, при проведении компрессионного теста по классической методике давление в манжете поддерживается на уровне 10,7 кПа (80 мм рт. ст.) либо на 1,3 кПа (10 мм рт. ст.) выше диастолического в течение 15—20 мин, а при более современной модификации теста по В. П. Балуде — 3 мин при компрессии на 1,3 кПа (10 мм рт. ст.) выше систолического давления. В обоих случаях второй раз кровь на исследование берется из пережатых сосудов до снятия манжеты.

С помощью таких проб может быть изучено влияние компрессии не только на фибринолиз, но и на другие антитромботические свойства стенок сосудов (антикоагулянтные, антиагрегационные и пр.).

Нагрузочные пробы стандартизируются таким образом, чтобы в норме эуглобулиновый лизис ускорялся в 2 раза и более (выполнение исследования не в условиях основного обмена приводит к очень большим случайным ошибкам, поэтому до начала исследования больной утром не должен вставать с постели, венопункция должна проводиться в палате).

Ослабление реакции на компрессию или нагрузку свидетельствует о недостаточной реактивности фибринолитической системы и повышенном тромбогенном риске, что верифицировано рядом исследований.

Содержание плазминогена в плазме крови

Содержание плазминогена в плазме крови может полуколичественно оцениваться путем добавления к эуглобулиновой фракции определенной дозы стрептокиназы. Согласно методике Слобожанкиной — Федоровой, подбирается такая активность стрептокиназы, которая обеспечивает лизис эуглобулинов за 9—11 мин, однако возможно использование больших ее концентраций (нормативные показатели выводятся в каждой лаборатории отдельно). При дефиците плазминогена время лизиса в данном тесте удлиняется в тем большей степени, чем меньше этого профермента.

Исследование лизиса сгустков плазмы крови

Параллельное исследование лизиса сгустков плазмы крови по той же методике при стимуляции процесса стрептокиназой позволяет по разнице полученных показателей оценить активность антиплазмина в исследуемой плазме крови, поскольку в эуглобулиновой фракции антиплазмина практически нет, а в коагулировавшей цельной плазме он имеется.

Количество антиплазмина рассчитывается по коэффициенту

(ПЛС—ЭЛС)/ЭЛС;

 где ПЛС — время лизиса сгустка плазмы в присутствии стрептокиназы,

ЭЛС — время лизиса эуглобулинового сгустка в присутствии той же дозы стрептокиназы.

Далее, пользуясь этим коэффициентом, определяют активность антиплазмина в процентах по предварительно составленной кривой разведения (полученной на смешанных образцах нормальной плазмы крови).

Более точны и вместе с тем легко выполнимы методы исследования фибринолиза по расщеплению азофибрина, представляющего собой соединение фибрина, ковалентно связанного с хромогенным субстратом (азопептидом)

Принцип метода состоит в том, что в три пробирки вносят по 10 мг азофибрина, смешивают с буфером (pH 7,4), после чего в две из них вносят по 0,15 мл исследуемой плазмы крови и дополнительно в одну из этих пробирок — 10000 Ед/мл стрептокиназы.

После инкубации в течение 1 ч растворы фильтруют и фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 440 нм или на медицинском колориметре при синем светофильтре.

Плазминовая активность плазмы определяется в пробе без стрептокиназы по изменению оптической плотности фильтрата в сравнении с содержимым 3-й пробирки, а содержание в плазме плазминогена — в пробе со стрептокиназой. При инкубации же плазмина и исследуемой плазмы на том же субстрате определяется антиплазминовая активность. Контрольные показатели, полученные при исследовании нормальной плазмы крови, принимаются за 100 %.

Таким образом, с помощью сравнительно небольшого набора простых лабораторно-функциональных методов можно получить представление о состоянии различных механизмов фибринолиза, содержании в плазме и освобождении из стенки сосудов плазминогена, его активаторов и ингибиторов.

Как и при исследовании свертывающей системы крови, эти данные могут быть существенно дополнены иммунологическим определением компонентов системы фибринолиза и продуктов расщепления фибриногена и фибрина.

Методы выявления «свидетелей» и молекулярных маркеров внутрисосудистого свертывания крови и фибринолиза

В процессе внутрисосудистого свертывания крови и сопряженного с ним интенсивного фибринолиза происходит, с одной стороны, потребление и более или менее выраженное снижение уровня в крови ряда компонентов системы гемостаза, а с другой — появление их частей, осколков и метаболитов, которые в нормальной плазме крови отсутствуют или содержатся в небольшом количестве.

Выявление таких «свидетелей» и маркеров активации внутрисосудистого свертывания и фибринолиза имеет важное диагностическое значение при ДВС-синдромах, тромбоэмболических заболеваниях и микротромбоваскулитах различного генеза (инфекционного, иммунного, опухолевого и т. д.).

Маркеры потребления и активации тромбоцитарного звена гемостаза

К маркерам потребления и активации тромбоцитарного звена гемостаза относятся тромбоцитопения, повышение уровня в плазме компонентов гранул — антигепаринового фактора 4 тромбоцитов, (3-тромбоглобулина и др., а также сохранение в циркуляции функционально менее активных и хуже агрегирующих кровяных пластинок.

Основные маркеры повреждения и функциональной неполноценности эндотелия сосудов — повышение уровня в плазме крови фактора Виллебранда, ослабление реакции эуглобулинового лизиса при компрессии сосудов манжетой, физической нагрузке или введении аналогов вазопрессина.

Гиперкоагуляция

Гиперкоагуляция, если таковая имеется, может служить признаком активации свертывающей системы крови. Выявляется она с помощью общих коагуляционных тестов и инструментальных методов исследования (тромбоэластография), а в клинике — на основании трудности получения крови из вены — легкого тромбирования как самого сосуда, так и игл, а также неполного стабилизирования крови при перемешивании ее с цитратом (образования в пробирке макро- и микросгустков).

Такая частично свернувшаяся кровь совершенно непригодна для дальнейшего исследования системы гемостаза, поэтому до центрифугирования крови обязательно следует проверять, нет ли в ней сгустков. При наличии сгустков кровь не подлежит дальнейшему исследованию (но может быть использована для приготовления сыворотки и проведения ряда биохимических анализов). Опыт показывает, что недостаточно строгое соблюдение этой рекомендации нередко служит источником грубых ошибок при исследовании системы гемостаза.

Гиперкоагуляция в ряде тестов еще не свидетельствует о наличии тромбогенной опасности. Более того, известно большое число тромбофилий, для которых характерна исходная гипо-, а не гиперкоагуляция. К ним относятся тромбофилии, обусловленные дефицитом фактора XII, прекалликреина и ВМ кининогена, дисфибриногенемиями, дефицитом протеина С и т. д. Свертываемость практически не изменяется при склонности к тромбозам вследствие повышения гематокритного показателя (часто при этом наблюдается гипокоагуляция), тромбоцитемии, неполноценности фибринолиза и т. д.

Исходя из приведенных причин, нельзя ставить знак равенства между гиперкоагуляцией и тромбогенной опасностью, в силу чего этот признак в настоящее время в число стигматов тромбофилии не включается.

Активация «моста» между факторами XIIa+калликреин и фактором VII

Активация «моста» между факторами XIIa+калликреин и фактором VII, что распознается путем исследования протромбинового времени с бычьим тромбопластином до и после охлаждения исследуемой плазмы крови в течение 18—24 ч при температуре +4°С (тест холодовой активации). При ряде тромбофилий после охлаждения отмечается уменьшение протромбинового времени на 25—50 %. Другие тромбопластины, кроме бычьего, для проведения этого исследования непригодны.

Наличие в плазме крови свободного пептида А

Наличие в плазме крови свободного пептида А, выявленного иммунологическими методами, служит прямым доказательством тромбинемии, поскольку тромбин прежде всего отщепляет от молекулы фибриногена пептиды А. Методика ограниченно доступна из-за трудности получения иммунной анти-А-сыворотки.

Кроме того, повышение уровня пептида в плазме крови обычно кратковременное, так как он быстро элиминируется из кровотока системой мононуклеарных фагоцитов. В связи с этим уровень пептида А информативен лишь при его повышении, что является достоверным признаком наличия в крови активного тромбина.

Расслоение фибриногенового пула и образование в плазме растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК)

У здоровых людей фибриноген по свойствам, электрофоретической подвижности и чувствительности к тромбину, полностью коагулирует в тромбиновом тесте при добавлении 12—14-секундного тромбина.

В отличие от этого при внутрисосудистой активации свертывания крови (тромбинемии) и фибринолиза происходят расслоение фибриногенового пула, образование РФМК, связывающих часть фибриногена (заблокированный фибриноген), и возможно, ранних продуктов фибринолиза (фрагментов X и V), а также ранних и поздних ПДФ в свободном состоянии. РФМК и связанный с ними фибриноген под влиянием тромбина либо не коагулируют (остаются в сыворотке), либо свертываются медленно и только при воздействии высоких концентраций тромбина (3-секундного). Для выявления в плазме и сыворотке крови РФМК и других инертных компонентов фибриногенового пула используются следующие паракоагуляционные тесты.

Бета-нафтоловый тест

Бета-нафтоловый тест (прежнее название — определение фибриногена Б) недостаточно специфичен, поэтому в настоящее время применяется редко.

Сущность его состоит в том, что к плазме крови добавляется раствор β-нафтола в 50 % этиловом спирте (5 капель на 1 мл). Если через 10 мин при встряхивании выпадает осадок в виде грубых хлопьев, проба считается положительной.

Этаноловый тест

Этаноловый тест — легковыполним, для проведения его к 0,4 мл исследуемой плазмы, стабилизированной раствором цитрата в смеси с аминокапроновой кислотой (для блокирования фибринолиза), добавляют 0,15 мл 50 % раствора этанола (концентрация проверяется спиртометром).

Образование через 10 мин нежного сгустка свидетельствует о наличии в плазме крови РФМК. Тест специфичен, но позволяет выявить лишь часть РФМК (в основном — крупномолекулярных), дает положительный результат при ДВС, тромбозах и других видах тромбинемии. В III стадии ДВС на фоне выраженной гипофибриногенемии (менее 0,5—0,7 г/л), как и при гепаринизации, этаноловый тест часто становится отрицательным.

Протаминсульфатный тест

Протаминсульфатный тест основан на осаждении ранних продуктов фибринолиза и части РФМК протаминсульфатом, получаемым из молок рыб. Тест достаточно специфичен, но для его проведения пригодны лишь некоторые виды протаминсульфата.

Способности протаминсульфата инактивировать гепарин и вызывать паракоагуляцию не связаны между собой. В силу этого образцы протаминсульфата, используемые для паракоагуляциониого теста, должны предварительно тестироваться либо на растворе фибрин мономера, либо на нормальной плазме крови, к которой предварительно добавляется небольшое количество тромбина и стрептокиназы (либо только стрептокиназы).

Если при этом тест становится положительным, то протаминсульфат пригоден для диагностического использования. Во многие фирменные диагностические наборы входит контрольная (референтная) плазма, дающая положительный результат протаминсульфатного теста. Ею пользуются для тестирования реактива.

Следует учитывать, что с помощью этанолового и протаминсульфатного тестов выявляются разные компоненты фибриногенового пула, в связи с чем их результаты далеко не всегда совпадают друг с другом. Так, у одних больных с ДВС-синдромом положительны оба теста, у других — лишь один из них. Поэтому для более надежной диагностики необходимо выполнение обоих тестов.

Ортофенантролиновый тест

Ортофенантролиновый тест (ОФТ) — высокоинформативен, позволяет проводить качественное и количественное определение РФМК в плазме с небольшим количеством тромбоцитов (дополнительно центрифугируется 20 мин при 4000 об/мин).

Для проведения теста пригоден только солянокислый ортофенантролин. Раствор ортофенантролина 0,033 М (0,78 %) смешивается при комнатной температуре в равных количествах (по 0,1 мл) с исследуемой плазмой на предметном стекле и при покачивании определяется время появления в смеси первых хлопьев.

Учет ведется в течение 2 мин.

Полученные результаты (в секундах) переводят с помощью калибровочной кривой в количество РФМК. Калибровочную кривую получают путем добавления разных концентраций фибринмономера, полученного по методу Радзевич—Ходоровой, к пулу плазмы крови здоровых людей (доноров). В норме хлопья появляются через 120 с; чем быстрее они появляются, тем больше РФМК содержится в исследуемой плазме.

Тест более достоверен, чем этаноловый и протаминсульфатный.

Выявление РФМК по агглютинации эритроцитов, покрытых фибрин-мономерами (FM-test)

Эритроциты человека I(O) группы покрываются фибрин-мономерами и используются в диагностикуме.

Плазма крови на стекле смешивается с тест-эритроцитами. Появление агглютинации (оценивается от + до +++) свидетельствует о наличии РФМК, взаимодействующих с фибрин-мономерами на поверхности эритроцитов.

Тест высокочувствителен, позволяет выявить РФМК в концентрации выше 10 мг/мл.

Полное выявление коагулирующей части фибриногенового пула и РФМК с помощью яда эфы песчаной

Раствор яда песчаной эфы или его коагулирующей фракции (эхитокс, экарин) полностью коагулирует фибриноген, все РФМК и ранние продукты фибринолиза, в связи с чем с его помощью можно оценивать общее количество коагулирующих компонентов фибриногенового пула в плазме крови и количество РФМК и заблокированного фибриногена, оставшихся после первичного свертывания в сыворотке, полученной после свертывания тромбином.

Используется концентрация яда, которая вызывает коагуляцию нормальной плазмы за 20—30 с.

При наличии РФМК в пробе с ядом в плазме крови выявляется большее количество фибриногена, чем в тесте с тромбином, а в сыворотке крови, полученной после свертывания 15-секундным тромбином, при добавлении яда образуется второй сгусток, в который уходят все РФМК и связанный с ними заблокированный фибриноген, а также ранние ПДФ.

Указанные феномены характерны для тромбинемии и массивного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром, тромбоэмболии и др.), тогда как в сыворотке крови здоровых людей тест с ядом не выявляет РФМК и заблокированный фибриноген. После свертывания ядом фибриноген и его крупномолекулярные производные уже не обнаруживаются ни хроматографически, ни с помощью теста склеивания стафилококков.

Помимо вышеуказанных, для определения РФМК и ранних продуктов расщепления фибриногена (или фибрина) плазмином могут применяться следующие тесты.

Тест склеивания стафилококков

Тест склеивания стафилококков (ТСС, стафилококковый клампинг-тест) — простой и высокоинформативный метод выявления в сыворотке РФМК и ранних продуктов фибринолиза (фрагментов X, а также связанного с ними заблокированного фибриногена).

Основан на способности некоторых штаммов стафилококка (Neumann Д₂S и др.) в силу наличия на их поверхности особого клампинг-фактора подвергаться агглютинации под влиянием остающихся в сыворотке, после свертывания РФМК и ранних ПДФ (фрагментов X).

Кровь для исследования берется на стабилизирующий раствор в смеси с аминокапроновой кислотой для предотвращения фибринолиза в пробирке.

Тест выполняется на стекле или в планшетах на 74 гнезда при смешивании равных объемов диагностикума и исследуемой сыворотки крови в разведениях 1:2, 1:4, 1:8 и т. д.

Учитывается конечное разведение, в котором еще определяется агглютинация. У здоровых людей содержание РФМК и ранних ПДФ в сыворотке не превышает 0,002 г/л (2 мкг/мл).

Иммунологическое определение ранних и поздних ПДФ в сыворотке крови

Иммунологическое определение ранних и поздних ПДФ в сыворотке крови основано на способности антифибриногеновой сыворотки давать иммунную преципитацию с компонентами фибриногенового пула (чувствительность сыворотки определяется на разведениях фибриногена).

При иммуноэлектрофорезе в силу разной подвижности РФМК, фрагментов X, Y, D и E возможно ориентировочное их определение. Количественная оценка производится путем исследования разных разведений фибриногена, плазмы и сыворотки крови. Более специфичны тесты со специфическими сыворотками анти-D, анти-димер D и др.

ПДФ-латекс тест

Тест склеивания частиц латекса, нагруженных антителами анти-D, анти-E, антидимер D и др. (ПДФ-латекс тест), заключается в определении с помощью диагностических наборов перечисленных ПДФ по склеиванию частиц латекса при смешивании с разными разведениями исследуемой сыворотки.

Определение содержания в плазме крови активированного фактора XIII как показателя циркуляции в крови тромбина

Фактор XIII, активируемый тромбином в присутствии ионов кальция, расщепляется на цепь A, обладающую фибрин-стабилизирующей активностью, и инертную цепь S.

Раздельное определение их содержания (по степени стабилизации фибрин-олигомеров и иммунологическое) позволяет диагностировать внутрисосудистое свёртывание крови по наличию тромбинемии. Метод сложен, используется в основном для научных исследований. В настоящее время разрабатываются более доступные способы определения фактора XIIIa.

Выявление активации протромбина

При активации протромбина фактором Xa происходит отщепление от субстрата фрагмента Ф1—2, определяемого иммунологически. Нарастание содержания последнего в плазме свидетельствует об активации системы свертывания крови.

Выявление клеточных маркеров активации внутрисосудистого свертывания крови

Феномен повреждения (фрагментации) эритроцитов

При ДВС-синдроме и других видах блокады микроциркуляции в мелких сосудах эритроциты подвергаются травмированию, в связи с чем в мазках крови увеличивается число фрагментированных клеток (более 7— 10%).

Более точно этот феномен определяется путем разделения клеток крови в градиенте плотности фиколла-верографина (плотность 1,077) по методике, используемой в иммунологии для выделения лимфоцитов и моноцитов. В норме кольцо лейкоцитарной интерфазы имеет беловатый опалесцирующий цвет и в нем при подсчете в камере Горяева содержится менее 400 эритроцитов в 1 мкл (чаще до 200).

При ДВС-синдроме число всплывающих (поврежденных) эритроцитов резко возрастает (до 1000—40 000 в 1 мкл и более), в связи с чем кольцо окрашивается в розовый или красный цвет. Количественно феномен оценивается путем подсчета содержания эритроцитов в интерфазе (в камере Горяева).

Метод позволяет дифференцировать ДВС-синдром с блокадой микроциркуляции и тромбирование магистральных сосудов, при котором повреждение эритроцитов незначительно.

Феномен продукции тромбопластина моноцитами

При некоторых видах ДВС-синдрома (особенно иммунного и инфекционного генеза) моноциты активируются и приобретают способность продуцировать тканевый тромбопластин.

Для выявления этого феномена клетки крови разделяются в градиенте плотности (фиколл-верографиновая смесь, плотность 1,077) для получения фракции, содержащей большое количество моноцитов, кратковременно культивируются, и затем определяется свертывающая активность суспензии до и после разрушения клеток. При тяжелом инфекционно-септическом процессе эта функция моноцитов может подавляться.

Выявление снижения уровня в плазме крови (потребления) компонентов свертывающей, фибринолитической и калликреин-кининовой систем

При остром и подостром ДВС-синдроме отмечается усиленное потребление и метаболизм ряда компонентов системы гемостаза, в связи с чем уровень их в плазме существенно снижается. Особенно выражено подавление факторов VIII, V, антитромбина III, белков C и S, фибронектина, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена, плазминогена.

Определение некоторых из этих параметров имеет значение не столько для диагностики, сколько для оценки остроты процесса и эффективности заместительной терапии.

Уровень фактора I (фибриногена) также часто снижается, что, однако, маскируется исходно повышенным содержанием его в плазме при инфекционных и иммунных заболеваниях, токсикозах беременности и других видах патологии.

Выявление неоантигенов

В процессе активации факторов свертывания и фибринолиза и последующего образования их комплексов с физиологическими антагонистами возникают новые антигенные маркеры, отсутствующие отдельно в составных частях этих пар. Так, например, комплекс тромбин-антитромбин III образует антиген, не свойственный» отдельно ни тромбину, ни антитромбину III.

Точно так же образуется неоантиген в парном соединении плазмин — антиплазмин и т. д. При наличии антисывороток к этим неоантигенам легко установить наличие в крови активированных ключевых ферментов свертывания крови (тромбина) и фибринолиза (плазмина).

Современная клиника располагает достаточно большим набором тестов, выявляющих внутрисосудистую активацию свертывания крови и фибринолиза.

Многие из этих тестов общедоступны, быстро и легко выполнимы. Использование их в комплексе с некоторыми другими исследованиями обеспечивает надежную лабораторную диагностику ДВС-синдрома и других видов массивного внутрисосудистого свертывания крови. Наблюдение за маркерами внутрисосудистого свертывания крови имеет значение и для правильной оценки динамики патологического процесса, степени эффективности и достаточности проводимой терапии.