Studi Sitokimia ejakulasi

Reaksi Sitokimia, dilakukan dengan ejakulasi, memberikan wawasan ke dalam komposisi kimia dan aktivitas fungsional dari sel-sel.

Penentuan asam ejakulasi aktivitas fosfatase

Kegiatan asam fosfatase ejakulasi berkali-kali lebih besar dari aktivitasnya dalam darah. Asam fosfatase merupakan bagian dari sekresi prostat, produksinya dirangsang oleh gonadotropin laki-laki. Menggunakan reaksi cytochemical terdeteksi dalam sperma dan sel-sel lain dari ejakulasi. Kegiatan ditentukan oleh nya Metode Goldberg - Barka.

Reagen.

1. Alkohol Formalin (salah satu bagian dari siap 40 % formalin dilarutkan dalam sembilan bagian 96% etil alkohol).

2. Pararozanilin: 1 g fuchsin dasar untuk Phuc- Asam sinosernistoy terlarut selama pemanasan di 25 ml 2 Asam klorida N; didinginkan, disaring dan disimpan dalam lemari es. Reagen tahan.

3. Larutan natrium nitrat 4 %. 4. Suatu larutan metil hijau untuk penyangga asetat 2 % (pH - 5). Solusi yang dihasilkan dicuci dengan kloroform, kemudian dicampur untuk jumlah kira-kira sama kloroform dan 2 % metil solusi hijau. Anjlok siang hari, dan kemudian dicat dalam warna ungu, kloroform telah dihapus dengan corong pisah.

5. Lingkungan Inkubatsionnaya, yang terdiri dari dua komponen.

• Sebuah komponen: 20 mg naftol-A5-fosfat dilarutkan dalam 0,5 (0,3) ml dimetilformamida, menambahkan 40 ml 0,1 N larutan natrium asetat dan disaring melalui kertas saring; mempersiapkan hari studi.
• B-komponen: 8 tetes 4 % larutan natrium nitrat dicampur dengan 8 tetes pararozanilina; adalah mantan tempore. Untuk memperoleh kedua komponen dari media inkubasi terhubung (pH 5,2-5,4). Jika perlu, memperbaiki pH setiap 50 % asam asetat, larutan alkali kaustik.

Metode. Ejakulasi segar disentrifugasi, ketika sejumlah besar sperma Dispense sentrifugasi. Dari sedimen mempersiapkan kaca dipoles stroke tipis, bahwa, serta Pap darah, udara kering. Pap kering diperbaiki dengan membenamkan mereka dalam gelas kimia dengan formalin alkohol di 30 dari (tidak lagi) dan dicuci dengan air suling. Kemudian smear tenggelam dalam gelas dengan media inkubasi dan ditempatkan dalam inkubator pada suhu 37 ° C 2 tidak. Setelah itu, mereka dibilas dalam air suling, direndam selama 10 min dalam gelas dengan larutan metil hijau (counterstained untuk inti), cepat dicuci dengan air, dikeringkan dengan kertas saring dan diperiksa oleh sistem mikroskop perendaman.

Kegiatan asam fosfatase dapat dinyatakan dengan faktor cytochemical rata (SCK) oleh Metode polukolychestvennomu Astaldi-Verga. Menurut rumus

SCK =(3*a 2 * b a * 1)/100

di mana angka-angka dalam pembilang menunjukkan intensitas warna (maksimum - 3, moderat - 2, jejak kaki - 1), dan surat-surat - dengan persentase sel dihitung intensitas warna tertentu; angka 100 di penyebut - jumlah sel dihitung.

Sebagai Contoh, terhitung 100 sel, yang memiliki intensitas warna maksimum 20 sel, moderat - 20 dan dengan mengikuti - 60 sel. Di sini:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1,6

Fosfatase asam spermatozoa terletak di unit kibbles merah-oranye di bagian atas kepala.

Sibuk bagian kromatin kepala berwarna hijau dan tidak mengandung asam fosfatase.

Sebuah warna pucat lebih menyebar pada asam fosfatase terdeteksi di sekitar bagian bawah kepala, dan kadang-kadang meluas ke leher sperma. Koefisien cytochemical Tengah asam fosfatase dalam ejakulasi sperma normal adalah 2,0-2,4.

Dalam sitoplasma sel spermatogenesis mengungkapkan akumulasi butiran, cerah dicat tertentu (merah-oranye) warna. Dalam sel-sel pendukung tubulus seminiferus berbelit-belit, sering tajam positif bernoda untuk asam fosfatase, tembus kepala non-berwarna (xromatin) sperma. Histiosit dan makrofag mengandung beberapa butiran, positif bernoda untuk asam fosfatase. Dalam limfosit terisolasi, dan kadang-kadang neutrofil yang pelet individu, memiliki aktivitas asam fosfatase.

Penentuan aktivitas dehidrogenase suksinat (SDG) ejakulasi

Sukcinatdegidrogenaza - Enzim, berpartisipasi dalam reaksi redoks, terkandung dalam sel-sel dalam sejumlah besar ejakulasi. Namun, sifat dari perubahan aktivitas dalam berbagai proses patologis masih belum dipahami dengan baik. Kegiatan dehidrogenase suksinat dalam sel ditentukan dengan metode modifikasi dari Nartsissova.

Reagen.

1. Aseton-Trilon (aseton - 60 ml, distillirovannaya air - 40 ml, Trilon B - 250 mg).

2. Suatu larutan metil hijau 2 % (pewarna yang sama, yang digunakan untuk asam fosfatase).

3. Lingkungan Inkubatsionnaya, terdiri dari komponen-komponen berikut:

dan) dapar fosfat (pH 7,2-7,4) - 10 ml;

untuk) 5,4 % larutan natrium suksinat - 10 ml;

di) complexone III (13 mg diencerkan dalam 5 ml air suling);

g) air sulingan - 5 ml;

d) nitrotetrazolium ungu (10 mg diencerkan dalam 10 ml air).

Semua komponen dicampur dalam satu paket dan disimpan dalam lemari es. Media disiapkan dapat digunakan kembali - untuk 10 hari atau lebih.

Metode. Pap, dibuat dari ejakulasi, tetap dalam aseton untuk Trilon- 30 dari, dicuci dengan air suling dan dikeringkan di udara terbuka. Kemudian Swab dicelupkan ke dalam inkubasi Rabu dan dimasukkan ke dalam termostat pada suhu 37 ° C 1 tidak, kemudian dicuci dengan air suling dan metil dokrašivaût hijau selama 10 m. Selanjutnya lagi dengan cepat dicuci dengan air, dikeringkan dengan kertas saring dan diperiksa oleh sistem mikroskop perendaman.

Normal sperma punya aktivitas tinggi dari Suksinat dehidrogenase, dikirimkan oleh besar biru-ungu butiran, bahwa, penggabungan antara, membentuk massa padat, mengisi leher sperma, sperma butiran individu dapat ditemukan di kepala.

Menghitung fusi dengan satu sama lain pelet tidak mungkin, Oleh karena itu, untuk menentukan aktivitas Suksinat dehidrogenase dicat bagian dari sperma diukur dalam mikrometer. Pada panjang tertentu dilukis di sukcinatdegidrogenazu sebagian kepala sperma dinilai berdasarkan tingkat aktivitas enzim dalam spermatozoide ini. Menggunakan lensa micrometer micrometer dan diukur panjang khusus dicat bagian dalam 100 sperma. Dilipat panjang bernoda plot dihitung spermatozoid dan membagi angka yang dihasilkan oleh 100, mendapatkan panjang rata-rata, mengungkapkan sukcinatdegidrogenaznuû kegiatan untuk satu sperma. OK itu adalah 4.3 ± 0.7 μm. Ini menghitung aktivitas SDG paling informatif dan oleh karena itu dianjurkan untuk digunakan untuk tujuan ilmiah.

Untuk aplikasi yang luas dalam praktek metode ini agak rumit, Ianya lebih baik untuk mengungkapkan jumlah Suksinat dehidrogenase di Astal′di metode-Verga. Rata-rata koefisien sperma SDG cytochemical di ejakulasi normal 2,7 ± 0.3.

Di sel-sel spermatogenesis SUKSINAT DEHIDROGENASE aktivitas terdeteksi dalam bentuk kelompok besar biru-ungu butiran, sering menggabungkan ke benjolan besar, Terletak di berbagai bagian dari sitoplasma. Rata-rata koefisien dari cytochemical di sel-sel spermatogenesis tidak mencapai 2,0. Sebagai pematangan sel aktivitas meningkat dan SDG ejakulasi dalam dewasa sperma melebihi 2,0. Di dalam sitoplasma limfosit tertentu ditemukan besar butiran SDG.

Penentuan aktivitas peroksidase ejakulasi

Sperma, sel spermatogenesis dan sel pendukung dari tubulus seminiferus berbelit-belit peroksidase hilang.

The neutrophilic granulosit aktivitas ejakulasi peroksidase dinyatakan sampai batas yang signifikan dan dapat bervariasi tergantung pada sifat dari proses patologis, serta dalam darah perifer. Tingkat aktivitas peroksidase di granoulozitah neutrofil penting untuk menilai status fungsional dan aktivitas inflamasi dalam organ genital pria. Mewarnai stroke oleh Graham Knollû-ejakulasi dan akuntansi aktivitas enzim oleh Astal′di mirip dengan stroke darah yang diadakan Vergu.

Peroksidase aktivitas dalam sel-sel ejakulasi ditentukan oleh Metode Graham-Knollâ.

Reagen.

1. Alkohol Formalin (sama, seperti untuk asam fosfatase).

2. Reagen Peroksidaznyj: ʙenzidin (di ujung pisau bedah) dilarutkan dalam 6 ml 96 % etil alkohol, menambahkan 4 ml air suling 0,02 ml 3 % hidrogen peroksida. Reagen cocok untuk makan dalam 5-6 hari.

3. Romanowski pewarna di penangkaran 1-2 tetes pada 1 ml air suling.

Metode. Segar ejakulasi stroke catatan selama 30 dengan formalinovym alkohol, dicuci dengan air yang mengalir dan kering. Kemudian tuangkan reagen peroksidaznym stroke 5-7 min, dicuci secara menyeluruh dalam menjalankan air dan kering. Setelah mereka 15-dokrašivaût 20 pewarna min Romanowski, dicuci dengan air yang mengalir, kering dan mikroskopiruût yang menggunakan sistem mikroskop pencelupan.

Dengan reaksi positif peroksidase di granoulozitah neutrofil terdeteksi besar butiran coklat keemasan di sejumlah besar. Ketika sejumlah besar sel-sel Anda ingin menghitung rata-rata koefisien dari cytochemical (SCK). Di dalam sitoplasma histiocytes mengandung peroksidase terisolasi dalam kelompok kecil pelet sama.

Penentuan glikogen dalam ejakulasi

Konten perubahan glikogen dalam sel yang berbeda mempengaruhi fungsi mereka atau membuktikan pengembangan proses patologis. Penentuan glikogen dalam kandang harus dilaksanakan Mack Manus metode.

Reagen.

1. Suatu larutan asam yodium 1 % (bersiap-siap untuk menggunakan).

2. Mata air: 5 ml 10 % sebagai metabisulfita kalium atau natrium, 5 ml 1 Asam klorida N, air hingga 100 ml (bersiap-siap untuk menggunakan).

3. Schiff Reagent: 1 g fuchsine dasar untuk asam fuksinosernistoj, pra ditumbuk dalam lumpang porselen, larut dengan gemetar konstan selama 5 min di 200 ml air suling mendidih, melewati filter kertas dan menambahkan cooling untuk 50 ° C 20 ml 1 Asam klorida N, dan ketika pendinginan ke 25 ° C adalah 1 g kalium metabisulfita atau natrium. Reagen siap berdiri di lemari es untuk 24 h setelah yang dia menjelaskan dan keluarga Stano cocok untuk konsumsi manusia

4.Larutan metil hijau 2 %, kloroform dicuci

5.Kimiawi murni metil alkohol.

Metode.

Smear kering tipis ejakulasi memperbaiki kimiawi murni metilovam alkohol selama 3 m, bilas dengan air suling dan dicelupkan ke dalam cangkir dengan 1 % suatu larutan asam yodium pada 5 m. Kemudian smear dicuci dengan air suling, kering, bilas dengan air belerang dan kering lagi.

Lebih bawah stroke di kaca dengan reagen Schiff pada 15 m, Bilas mereka dalam tiga porsi air belerang (oleh 3 min setiap), mencuci keluar 10 min di inti air dan dokrašivaût 3 m metil hijau. Kemudian opolascerve air stroke, kering kertas filter dan mikroskopiruût menggunakan pencelupan mikroskop sistem.

Di matang sperma glikogen hilang. Di dalam sitoplasma sperma muda, terutama dengan "kerah", jejak-jejak terdeteksi glikogen (±), kadang-kadang dalam bentuk granul individu di bagian atas kepala atau di kerah".

Di sel-sel spermatogenesis glikogen ditemukan dalam jumlah besar dalam bentuk butiran ceri-merah, mengisi semua sitoplasma. Sebagai pematangan sel kehilangan glikogen mereka sampai kematiannya di matang sperma. Spermatotsity berisi glikogen tidak hanya di dalam sitoplasma, tetapi dalam kernel. Dalam mendukung sel tubulus seminiferous berbelit-belit glikogen diposisikan sebagai butiran ceri-merah dan sebaran. Neutrofil matang di ejakulasi, seperti dalam darah perifer smear, mengandung sejumlah besar glikogen. Jika kronis prostatitis di granoulozitah neutrofil ejakulasi adalah meningkat kegiatan glikogen dan peroksidase. Di terisolasi limfosit biasanya kadang-kadang butiran glikogen.

Makrofag mengandung jejak glikogen Von smear ejakulasi ternyata ceri merah, yang menunjukkan sejumlah besar ejakulasi plasma glikosaminoglikan (mukopolisaxaridov).

Penentuan Asam ribonukleat (RNA) ejakulasi

Peningkatan kadar RNA dalam sel bukti aktivitas tinggi pada pertumbuhan, sekresi, sintetis dan kegiatan lainnya. Pengurangan RNA dalam sel-sel kecil yang sering dikaitkan dengan penurunan kemampuan sel-sel untuk regenerasi. Isi dari RNA dalam sel ditentukan oleh Metode Kurnika.

Reagen.

1. Reagen Kurnika: mempersiapkan secara terpisah 2 % solusi metil hijau dan pironina, solusi metil hijau dicuci dengan kloroform; bekerja disiapkan dengan mencampur larutan pewarna 2 % solusi pironina (12,5 ml) dan 2 % metil solusi hijau (7,5 ml) dengan penambahan 30 ml air suling. Tahan noda, disimpan dalam lemari es.

2. Pengikut adalah kimiawi murni metil alkohol.

Metode. Memperbaiki stroke metilovam alkohol selama 3 m, cat solusi bekerja pironin-metil hijau 15 m, cepat opolascerve air dan kering kertas filter. Mikroskopiruût menggunakan pencelupan mikroskop sistem. RNA ternyata pyronin dalam warna merah cerah, inti-metil hijau hijau.

Dewasa sel-sel sperma tidak mengandung RNA. Sel-sel spermatogenesis kaya RNA, jumlah yang berkurang dalam sel sebagai mereka jatuh tempo. Dari spermatogony sitoplasma kaya warna pink, dari spermatocitov Ini pucat, dan Apakah spermatids pink pucat. Muda memiliki sperma "kerah" Pink dicat didominasi "kerah".

Sperma, berada di tahap akhir dari pengembangan, untuk mendukung sel-sel tubulus seminiferous berbelit-belit kehilangan substansi residu pink (RNA) dan tumbuh menjadi dewasa sperma.

Dewasa kuman sel berisi glikogen dalam jumlah besar, RNA dan banyak aktivitas yang dinyatakan dan KF SDG. Tapi, biasanya, Sel-sel tunggal di ejakulasi, Jadi menghitung SCK desain. Dalam kasus tersebut harus terbatas bentuk narasi kesimpulan.

Cytochemical karakteristik leukosit meningkat indikator penting bagi aktivitas fungsional. Jumlah zat-zat dalam leukosit meningkat ejakulasi hanya sebagai, seperti dalam sel dan darah perifer dalam ejakulasi lainnya.

Di konvensional smear bernoda ejakulasi (azurozinovymi campuran, haematoxylin-eosin, dll.), serta dalam obat-obatan asli tidak selalu mudah untuk membedakan antara leukosit meningkat, sel spermatogenesis, epitel prostat, histiocytes dan elemen lainnya.

Metode cytochemical dalam hubungannya dengan morfologi seringkali membantu mengatur jenis sel. Jadi, dinyatakan sebagai aktivitas peroksidase, disediakan oleh butiran coklat keemasan besar, mengisi semua sitoplasma sel, Karakteristik dewasa oleh granulosit, sel-sel lain respon ini tidak terjadi. Reaksi parah terhadap glikogen khas dari neutrofil dan sel spermatogenesis, tapi ini tidak memiliki aktivitas peroksidase. RNA yang terkandung dalam sel-sel dan spermatogenesis ada granulosit matang. Sel-sel spermatogenesis telah diucapkan reaksi asam fosfatase, dan granulosit neutrofil, dia menyatakan sangat buruk, dan sebagainya. d.