Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria – Penyakit Marchiafava Michele

Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria - bentuk anemia hemolitik didapat yang relatif jarang, terhubung dengan perubahan struktur eritrosit, Neutrofil dan trombosit. Terjadi dengan tanda-tanda hemolisis intravaskular, di mana hemoglobinuria diamati, gemosiderinuriya, peningkatan hemoglobin bebas plasma. Penyakit ini sering diperumit oleh trombosis vena perifer dan pembuluh organ internal..

Etiologi dan patogenesis hemoglobinuria nokturnal paroksismal

Deskripsi pertama dari penyakit ini diberikan dalam 1882 g. Sudah dijelaskan lebih detail di 1928 g.

Nama umum untuk penyakit ini adalah paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNG), Namun, itu tidak sesuai dengan esensi penyakit, karena dengan itu tidak ada paroxysms nyata dan hemoglobinuria tidak selalu diamati.

Hemolisis intravaskular dengan hemosiderinuria, selain PNH, juga diamati pada banyak bentuk anemia hemolitik autoimun, baik dengan panas, serta dengan antibodi dingin, terutama dalam bentuk dengan hemolisin termal, serta dalam beberapa bentuk anemia hemolitik herediter, terkait dengan pelanggaran struktur membran eritrosit.

Penyakit Marchiafava-Micheli terjadi pada usia yang berbeda. Alasan peningkatan penghancuran sel darah merah adalah cacat pada sel darah merah itu sendiri..

Eritrosit pasien dengan PNH, sebagaimana disebutkan di atas, mudah dihancurkan oleh komplemen saat menciptakan kondisi optimal untuk aksinya, atau saat mengasamkan whey, atau dengan peningkatan konsentrasi komplemen di sekitar eritrosit karena terciptanya konsentrasi ion yang rendah dalam media sukrosa. Eritrosit pasien dengan PNH memiliki kepekaan yang meningkat terhadap efek antibodi seperti aglutinin., dan, terutama, Hemolisin.

PNH mempengaruhi lebih dari sekedar sel darah merah., tetapi juga leukosit dan trombosit pasien. Trombosit dan leukosit pasien dengan PNH memiliki sensitivitas yang meningkat terhadap efek komplemen seperti pada pengasaman serum, dan dalam medium dengan sukrosa kekuatan ion rendah. Mereka berkali-kali lebih sensitif terhadap aksi isoaglutinin., dibandingkan trombosit donor dan leukosit. Demikian, trombosit dan leukosit memiliki defek membran yang sama, apa itu eritrosit?.

Mendeteksi imunoglobulin pada permukaan sel darah merah, leukosit dan trombosit, dan dengan demikian membuktikan bahwa PNH termasuk dalam kelompok penyakit autoagresif, tidak mungkin dengan metode yang paling sensitif..

Ada bukti kuat untuk kehadiran dua populasi sel darah merah yang berbeda di PNH.. Sel yang paling resisten pada orang sehat - retikulosit adalah yang paling rapuh di PNH. Hal ini menunjukkan bahwa, bahwa populasi eritrosit yang abnormal tidak bertahan hidup sampai matang, dan sel darah merah dewasa yang lebih tua termasuk dalam populasi yang sehat atau hampir sehat.

IN 1970 dalam studi eritrosit dari mulatto, menderita PNH, menemukan, apa isinya?, seperti mulatto yang sehat, dua varian elektroforesis normal G-6-PD; pilihan A, umum di Afrika, dan opsi B, Eropa. Setelah hemolisis, ternyata, bahwa eritrosit patologis hanya mengandung satu varian G-6-PD, dan eritrosit normal - keduanya varian elektroforesis G-6-PD. Karenanya, sel darah merah yang dihemolisis berasal dari satu sel.

Fakta ini dengan sangat pasti menunjukkan adanya dua populasi eritrosit., berbeda tidak hanya secara fungsional, sebagai, misalnya, dalam mikrosferositosis, tetapi juga berdasarkan asal: dengan kata lain, itu menegaskan adanya klon patologis sel, t. Ini adalah. mutasi somatik. Identitas lesi membran eritrosit, neutrofil dan trombosit menunjukkan bahwa, bahwa informasi patologis kemungkinan besar diterima oleh sel, di sebelah batang, t. Ini adalah. sel progenitor myelopoiesis. Pertumbuhan blastoma tidak khas untuk PNH. Hanya kasus terisolasi dari perkembangan leukemia cepat dengan latar belakang PNH yang telah dijelaskan.. Namun, Kita dapat mengasumsikan, bahwa PNH adalah varian dari tumor jinak pada sistem darah, lama tanpa proliferasi tumor, karakteristik bentuk lain dari leukemia.

Mekanisme perkembangan sensitivitas komplemen pada PNH masih belum jelas..

Tidak ada perubahan signifikan dalam aktivitas enzim glikolisis dan siklus pentosa-fosfat.

PNH mengurangi aktivitas asetilkolinesterase eritrosit, kemungkinan besar karena pelanggaran struktur membran eritrosit, karena enzim terletak di permukaan membran dan mudah terganggu ketika rusak. Dikenal, bahwa penggunaan inhibitor asetilkolinesterase tidak berpengaruh pada kelangsungan hidup eritrosit. Namun, penurunan aktivitas asetilkolinesterase juga diamati pada bentuk lain dari anemia hemolitik., oleh karena itu tidak dapat berfungsi sebagai penjelasan untuk fenomena peningkatan sensitivitas komplemen- keabsahan.

Ada bukti, menunjukkan peningkatan jumlah asam lemak tak jenuh, terkandung dalam fosfolipid, membran eritrosit. Kemungkinan tidak dikesampingkan, bahwa perubahan lipid hanyalah cerminan dari beberapa perubahan lain dalam struktur membran eritrosit. Ketika mempelajari protein membran eritrosit pasien dengan PNH dengan elektroforesis dalam gel poliakrilamida dengan adanya natrium dodesil sulfat, ditemukan, bahwa pada beberapa fraksi kandungan proteinnya berbeda nyata dengan kontrol.

Peran utama dalam patogenesis komplikasi trombotik pada PNH diberikan pada pemecahan eritrosit intravaskular dan stimulasi koagulasi oleh faktor-faktor, dilepaskan dari eritrosit selama pemecahannya. PNH menghancurkan terutama retikulosit., mungkin, ini harus menjelaskan frekuensi komplikasi trombotik pada penyakit ini, tidak seperti bentuk lain dari anemia hemolitik, disertai dengan hemolisis intravaskular yang parah.

Manifestasi klinis hemoglobinuria nokturnal paroksismal

Penyakit ini biasanya dimulai secara diam-diam. Pasien mengeluh kelemahan, rasa tidak enak, pusing. Terkadang ada sklera subikterik. Sakit kepala sering menjadi keluhan pertama., nyeri di perut berbagai lokalisasi. Kecenderungan peningkatan trombosis memaksa pasien untuk berkonsultasi dengan dokter. Hemoglobinuria sangat jarang merupakan gejala pertama penyakit dan pada beberapa pasien PNH mungkin tidak ada sama sekali.. Dalam beberapa kasus, itu muncul untuk pertama kalinya setelah 2-3 tahun dan bahkan setelahnya 10 tahun setelah onset penyakit.

Salah satu tanda khas PNH adalah serangan nyeri perut.. Lokalisasinya bisa sangat berbeda.. Di luar masa krisis, sakit perut, biasanya, tidak diamati. Sering disertai muntah. Yang paling disukai, nyeri perut pada pasien dengan PNH dikaitkan dengan trombosis pembuluh mesenterika.

Trombosis pembuluh perifer (paling sering - vena ekstremitas atas dan bawah, lebih jarang - pembuluh ginjal) juga merupakan gejala khas hemoglobinuria nokturnal paroksismal. Di 12 % pada pasien dengan PNH, tromboflebitis diamati. Komplikasi trombotik adalah penyebab kematian paling umum pada penyakit ini..

Dalam pemeriksaan objektif pasien, pucat dengan sedikit warna ikterik paling sering menarik perhatian.. Muka sering bengkak, kadang terlalu kenyang. Kemungkinan sedikit pembesaran limpa dan hati, meskipun ini tidak khas untuk PNG.

Hemoglobinuria nokturnal paroksismal ditandai dengan tanda-tanda hemolisis intravaskular., yang paling penting adalah peningkatan hemoglobin plasma bebas. Gejala ini diamati secara berkala di hampir semua pasien dengan PNH.. Namun, tingkat peningkatan hemoglobin bebas plasma bervariasi dan tergantung pada, selama periode penyakit apa penelitian dilakukan?. Selama krisis, angka ini meningkat secara signifikan, ada juga peningkatan jumlah metalbumin plasma.

Tingkat hemoglobin bebas dalam plasma tergantung pada derajat hemolisis saat ini., kandungan haptoglobin, derajat filtrasi hemoglobin dalam urin dan laju penghancuran kompleks hemoglobin-haptoglobin. Dalam kasus hemolisis derajat kecil, kadar hemoglobin plasma bebas tidak akan cukup untuk menyaringnya melalui filter ginjal.. Oleh karena itu, hemoglobinuria bukanlah gejala wajib penyakit.. Ketika melewati tubulus nefron, hemoglobin yang disekresikan dihancurkan sebagian dan disimpan di epitel tubulus.. Hal ini menyebabkan hemosiderin diekskresikan dalam urin..

Hemosiderin diekskresikan dalam urin pada sebagian besar pasien dengan hemoglobinuria nokturnal paroksismal.. Terkadang hemosiderinuria tidak segera muncul. Ini penting, tetapi bukan tanda penyakit spesifik PNH.

Indikator laboratorium untuk hemoglobinuria nokturnal paroksismal

Kandungan hemoglobin pada penderita PNH berkisar antara 1,86- 3,1 mmol/l (30-50 G / l) dan bahkan lebih rendah dari normal selama remisi.

Jumlah eritrosit pada pasien dengan PNH menurun sesuai dengan tingkat penurunan hemoglobin. Indeks warna tetap mendekati kesatuan untuk waktu yang lama. Dimana, jika pasien kehilangan sejumlah besar zat besi dalam urin dalam bentuk hemosiderin dan hemoglobin, kadar zat besi secara bertahap menurun. Indeks warna yang rendah diamati pada sekitar setengah dari pasien. Beberapa dari mereka memiliki peningkatan kadar hemoglobin P, terutama selama eksaserbasi.

Dalam proporsi yang signifikan dari pasien peningkatan kadar retikulosit, tapi relatif rendah (2- 4 %). Jumlah leukosit dalam PNH dalam banyak kasus berkurang. Pada banyak pasien, itu adalah 1,5-3 G per 1 l, tetapi terkadang menurun menjadi 0,7-0,8 G in 1 l. Leukopenia, biasanya, diamati karena penurunan jumlah granulosit neutrofilik. Terkadang kandungan leukosit dalam PNH normal atau meningkat - hingga 10-11 G per hari. 1 l.

Dengan PNH, aktivitas fagositosis granulosit neutrofilik menurun..

Trombositopenia juga sering terlihat di PNH, Namun, keadaan fungsional trombosit adalah normal. Mungkin, ini menjelaskan kelangkaan komplikasi hemoragik pada penyakit ini, meskipun jumlah trombosit terkadang menurun sebagian besar - hingga 10-20 G per 1 l. Biasanya, pada kebanyakan pasien, jumlah trombosit adalah 50-100 G per 1 l. Jumlah trombosit yang normal tidak menyingkirkan diagnosis hemoglobinuria nokturnal paroksismal..

Saat memeriksa sumsum tulang gejala ditemukan, sebagian besar karakteristik anemia hemolitik - iritasi kuman hematopoietik merah dengan jumlah myelokariosit yang normal. Beberapa pasien mengalami sedikit penurunan jumlah megakariosit..

Kadar besi serum di PNH Hal ini tergantung pada tahap penyakit, derajat hemolisis intravaskular dan aktivitas hematopoietik. Dimana, jika pasien memiliki hemoglobinuria persisten atau sering, serta hemosiderinuria persisten, kandungan zat besi dalam tubuh, dan karenanya, dan serum berkurang, terkadang sangat signifikan. Terkadang PNH dimulai dengan tanda-tanda hipoplasia. Simpanan besi dalam tubuh pasien dengan PNH bergantung pada:, satu sisi, dari hilangnya zat besi dalam urin, dan di sisi lain, pada intensitas eritropoiesis. Oleh karena itu, defisiensi besi tidak dapat dianggap sebagai tanda diagnostik hemoglobinuria nokturnal paroksismal..

Kadar bilirubin serum pada PNH dalam kebanyakan kasus sedikit meningkat atau normal, terutama melalui tidak langsung. Kandungan rata-rata bilirubin adalah 22-28 mol/l. Ini harus diperhitungkan, bahwa selama pemecahan hemoglobin intravaskular, kompleks hemoglobin-haptoglobin terbentuk, yang juga akhirnya terurai untuk membentuk bilirubin.

Pada beberapa pasien dengan PNH, penyakit ini dimulai dengan gambaran anemia aplastik..

Diagnosis hemoglobinuria nokturnal paroksismal

Dengan hemoglobinuria nokturnal paroksismal, struktur membran eritrosit terganggu, yang dimanifestasikan dalam peningkatan kepekaannya terhadap efek komplemen. Hipersensitivitas semacam itu dideteksi menggunakan tes Hem, atau tes sukrosa yang lebih sensitif. Namun, dalam beberapa kasus, terutama dalam bentuk hemolisin dari anemia hemolitik autoimun, Tes sukrosa dapat memberikan hasil positif palsu. Hemolisin difiksasi pada permukaan eritrositnya sendiri dan menghancurkannya dengan adanya komplemen dalam media sukrosa., sedangkan PNH ditandai dengan penghancuran sel oleh komplemen tanpa paparan antibodi.

Untuk mengecualikan bentuk hemolisin dari anemia hemolitik autoimun, dianjurkan untuk mempelajari hemolisin menggunakan metode yang dijelaskan di atas dan menggunakan uji sukrosa silang dengan serum pasien dan eritrosit dari donor kelompok tunggal., dan bukan sebaliknya, bagaimana diterima. Dengan PNH, tes langsung positif, dan salibnya negatif. Dalam bentuk hemolisin, AIHA dapat diamati sebagai positif, dan uji silang negatif. Dalam kasus ini, disarankan untuk menggunakan varian ketiga dari tes sukrosa - menggunakan kedua serum, dan eritrosit pasien. Derajat hemolisis pada varian ini minimal pada PNH dan maksimal pada bentuk hemolisin AIHA.. Hasil ini hanya dapat dijelaskan dengan spesifisitas antibodi yang tinggi dalam serum pasien dengan bentuk hemolisin dari anemia hemolitik autoimun terhadap antigen., hadir dalam jumlah yang lebih besar dalam eritrosit pasien, daripada di eritrosit donor. Tes sukrosa positif langsung pada pasien ini dikaitkan, mungkin, dengan antibodi tetap pada eritrosit.

Deteksi hemolisin dengan metode hemaglutinasi agregat dan yang lainnya membantu membuat diagnosis yang benar. Tidak dapat digunakan sebagai serum donor pasien, karena jika mengandung hemolisin, hasilnya mungkin positif palsu. Hasil negatif dapat terjadi, jika serum pasien dengan PNH atau serum pasien dengan sirosis hati digunakan sebagai sumber komplemen, artritis reumatoid, lupus eritematosus sistemik dan penyakit lainnya, di mana tingkat komplemen menurun. Tes sukrosa dan tes Hem menjadi kurang jelas, jika heparin digunakan sebagai antikoagulan saat mengambil darah pasien, bukan natrium sitrat. Setelah krisis hemolitik, intensitas tes Hem dan tes sukrosa menurun, tapi mereka tidak pergi negatif..

Penentuan hemoglobin bebas dalam plasma darah dengan metode Bing dimodifikasi oleh Derviz dan Bialko pada hemoglobinuria nokturnal paroksismal

Metode ini didasarkan pada kemampuan hemoglobin untuk bereaksi dengan benzidin dalam lingkungan asam dengan adanya hidrogen peroksida untuk membentuk warna hijau., menjadi biru dulu, dan kemudian menjadi ungu kemerahan. Intensitas warna sebanding dengan jumlah hemoglobin.

Reagen.

1. Penyangga asetat 0,1 M, pH 4,6: 27,22 g natrium asetat dilarutkan dalam 1 l air (0,2 Solusi M dari); disiapkan dalam labu volumetrik lain 1 l 0,2 larutan M asam asetat; campur 480 ml larutan no 1 dan 520 ml larutan no 2.
2. Hidrogen peroksida 0,3 % larutan (disiapkan sebelum digunakan dengan mengencerkan perhydrol dalam 100 waktu).
3. Asam klorida benzidin 0,1 % larutan: 50 mg asam klorida benzidin dilarutkan dalam 35-40 ml buffer asetat, panaskan larutan menjadi 80 °C dalam penangas air dan setelah pendinginan, bawa dengan buffer asetat ke 50 ml.

Saring ke dalam botol gelap dan simpan pada suhu kamar selama tidak lebih dari 7 hari-hari. Reagen yang menguning tidak dapat digunakan, dengan penggelapan yang cepat, perlu untuk mengkristal ulang benzidin dari alkohol.

Metode.

Darah untuk penelitian diambil dari vena dengan jarum kering ke dalam tabung reaksi silikon., mengandung antikoagulan apapun. Darah dengan antikoagulan disentrifugasi tidak lebih dari 10 menit pada 1500 / Min. Setelah pemisahan plasma, kembali disentrifugasi untuk 10 menit pada 8000 rpm untuk sedimentasi leukosit.

Tuang ke dalam tabung reaksi 4 ml buffer asetat, 2 ml hidrogen peroksida, 2 ml benzidin 0,04 ml serum darah yang akan diuji dicampur dan didiamkan 3 m, kemudian dituangkan ke dalam kuvet dengan panjang jalur optik 1 cm dan difotometer terhadap larutan kompensasi dengan filter lampu hijau. Intensitas warna biru meningkat dalam 4-5 menit, oleh karena itu, pengukuran diulang 3-5 kali berturut-turut dan pembacaan maksimum dicatat. Setelah 5-6 menit, warna serum menjadi rona ungu-cokelat., dan nilai kerapatan optik mulai berkurang. Dari dua hasil densitas optik maksimum yang ditemukan, diambil rata-ratanya.

Solusi kompensasi, yang terdiri dari 6 ml buffer asetat, 8 ml hidrogen peroksida, 3 ml larutan benzidin 0,06 ml larutan natrium klorida isotonik, disiapkan pada saat yang sama dengan sampel.

Kurva kalibrasi diturunkan dari larutan hemoglobin. Dalam darah, diambil untuk menyiapkan larutan hemoglobin, mengukur isinya. (pada kolorimeter medis atau refraktometer medis). Siapkan larutan hemoglobin dengan konsentrasi 1 g/l, dari mana larutan dengan konsentrasi lebih rendah disiapkan: 0,005,0,025, 0,05, 0,1 dan 0,2 g/l. Dari setiap solusi yang dihasilkan, tambahkan 0,04 ml untuk campuran 4 ml buffer asetat, 2 ml larutan benzidin 2 ml hidrogen peroksida.

Larutan stok hemolisat (1 g/l) untuk kurva kalibrasi harus tetap dingin, dan larutan kerja dengan konsentrasi yang lebih rendah harus disiapkan segera sebelum penelitian.

Biasanya, dalam 1 l plasma darah mengandung 0,0005 mmol/l (0,01-0,04 G) hemoglobin.

Penentuan hemosiderin urin pada hemoglobinuria nokturnal paroksismal

Selama pemecahan hemoglobin, besi diserap oleh epitel tubulus ginjal dan merupakan bagian dari hemosiderin.. Sel epitel deskuamasi tubulus ginjal dalam kasus ini mengandung butiran hemosiderin.

Setelah pemeriksaan yang cermat dari sedimen urin setelah sentrifugasi, butiran hemosiderin terlihat bahkan tanpa pewarnaan khusus.. Namun, mereka menonjol lebih jelas ketika diwarnai oleh metode Perls.

Metode.

Setelah sentrifugasi urin, lapisan atasnya tersedot, larutan yang baru disiapkan ditambahkan ke endapan 1 % garam darah kuning dan 1 % larutan asam klorida (campur volume yang sama 2 % larutan asam klorida dan garam darah kuning). Setelah 10 menit setelah pencampuran, campuran disentrifugasi dan endapan diperiksa. Butiran hemosiderin menjadi biru.

Penentuan methemalbumin plasma dengan metode spektrofotometri

Reagen.

1. Buffer isoosmotik fosfat (pH 7,4): campur 18 ml 0.15 M larutan natrium dihidrogen fosfat (24,4 g YaN2R04 aktif 1 l air) dan 82 ml 0,15 M larutan natrium hidrogen fosfat (21,3 г NaH₂SETELAH₄ di 1 l air).
2. natrium hidrosulfit.
3. larutan soda kaustik 1 M.
4. Solusi albumin serum manusia (40 g/l).
5. Solusi permata (5 mg / 100ml); disiapkan segera dengan melarutkan hemin dalam sedikit soda api, dan kemudian: membawanya ke volume yang dibutuhkan dengan larutan serum albumin.

Metode.

K 2 ml serum atau plasma ditambahkan 1 ml larutan buffer iso-osmotik, pH 7,4. Campuran disentrifugasi 30 menit pada 1200-1500 rpm. Tentukan kerapatan optik di 569 nm. Plasma yang diencerkan kemudian ditempatkan dalam tabung reaksi dan kira-kira 5 mg natrium hidrogen sulfat kering. Melalui 5 min ukur kembali kerapatan optik pada panjang gelombang yang sama. Perbedaan antara dua nilai kerapatan optik sesuai dengan kerapatan optik methemalbumin. Konsentrasi methemalbumin ditentukan oleh kurva kalibrasi.

Grafik kalibrasi adalah output sebagai berikut:. Larutan hemin dengan albumin dipindahkan ke dalam tabung reaksi dalam jumlah 0,01 untuk 0,1 g/l (dari 0,2 untuk 2 ml). Dalam tabung reaksi itu, dimana jumlah larutan lebih sedikit 2 ml, tambah sampai 2 ml larutan albumin. Kemudian tambahkan 1 ml buffer iso-osmotik fosfat. Campuran disentrifugasi pada 1500 / Min, dan kemudian mengukur kerapatan optik. Perbedaan antara pengukuran diplot sesuai dengan jumlah hemin.

Normalnya, tidak ada hemalbumin dalam plasma darah.. Itu muncul dalam kasus hemolisis intravaskular, misalnya, dengan hemoglobinuria nokturnal paroksismal atau bentuk hemolisin dari anemia hemolitik autoimun, dan juga tanpa adanya haptoglobin, ketika heme berikatan dengan albumin.

Tes Ham untuk hemoglobinuria nokturnal paroksismal

Tes Hema didasarkan pada penurunan resistensi eritrosit pasien PNH terhadap penurunan pH medium dengan adanya komplemen serum segar..

Reagen.

1. Suatu larutan asam klorida 0,2 n.
2. larutan amonia 0,04 %.

Metode.

Dari vena ambil 5 - 6 ml darah. Natrium oksalat atau natrium sitrat digunakan sebagai antikoagulan. Pada saat yang sama ambil 15-20 ml darah dari donor dari kelompok yang sama. Pisahkan eritrosit dari plasma dalam darah pasien dan donor.

Serum darah donor dituangkan ke dalam 0,5 ml dalam enam tabung reaksi, dua dari mereka ditempatkan pada 20 menit dalam penangas air pada suhu 56 °C untuk inaktivasi komplemen serum, empat tabung reaksi yang tersisa dibiarkan pada suhu kamar. Eritrosit pasien dicuci dua kali dengan larutan natrium klorida isotonik., kemudian disuspensikan dalam larutan yang sama dengan perbandingan 1:1.

Skema studi disajikan dalam tabel.

Campur isi setiap tabung, ditempatkan pada 1 h dalam termostat pada suhu 37 ° C, dan kemudian disentrifugasi.

Untuk tes kosong 0,05 m eritrosit pasien dan donor ditambahkan secara terpisah ke 0,55 ml larutan natrium klorida isotonik.

Setelah sentrifugasi, tingkat hemolisis dapat dinilai dengan mata. Untuk mengukur derajat hemolisis di setiap tabung untuk 4,7 ml 0,04 % ditambahkan larutan amonia 0,3 ml lapisan permukaan, dan dalam tabung reaksi dengan sampel kosong - 0,3 ml serum darah awal.

Untuk mengidentifikasi 100 % hemolisis 4,7 ml larutan amonia ditambahkan 0,3 ml suspensi eritrosit (0,05 ml eritrosit pasien 0,55 ml larutan natrium klorida isotonik).

Kepadatan optik larutan diukur pada kolorimeter medis dan bacaan dibandingkan dengan kerapatan optik larutan amonia tanpa eritrosit.:

% hemolisis =((AKU S₁-AKU S₂)/AKU S₃)*100;

dimana E₁ - kerapatan optik sampel uji; AKU S₂— kerapatan optik kosong; AKU S₃- kepadatan optik 100 % hemolisat.

Biasanya hemolisis tidak lebih dari 5 % eritrosit.

Tes Hem dianggap positif jika, jika hemolisis lebih dari 6 % eritrosit.

Dengan hemoglobinuria nokturnal paroksismal dan bentuk hemolisin dari anemia hemolitik autoimun, kadang-kadang terjadi hemolisis hingga 50-80 % eritrosit. Penyakit-penyakit ini ditandai dengan hemolisis hanya dengan adanya serum darah yang tidak aktif. (tabung no. 2). Jika inaktivasi serum tidak mencegah hemolisis (tabung no. 3), adalah mungkin untuk menganggap adanya bentuk lain dari anemia hemolitik atau kesalahan dalam perumusan penelitian.

Untuk penghancuran eritrosit pada pasien dengan hemoglobinuria nokturnal paroksismal pada pH 6,5 membutuhkan adanya komplemen, terkandung dalam serum darah segar.

Tes sukrosa untuk hemoglobinuria nokturnal paroksismal

Tes sukrosa didasarkan pada, bahwa eritrosit pasien dengan hemoglobinuria nokturnal paroksismal dan bentuk hemolisin dari anemia hemolitik autoimun dihancurkan dalam larutan dengan kekuatan ionik rendah dengan adanya komplemen.

Reagen.

1. Larutan sukrosa: 9,42 sukrosa dilarutkan 0,005 penyangga M fosfat; pH 6,2 (91 ml 0,005 М NaH₂SETELAH₄ dan 9 ml 0,005 М Na₂HPO₄).
2. Reagen untuk menentukan konsentrasi hemoglobin: 200 mg garam darah merah terlarut 1 l air suling, tambahkan di sana 0,5 ml asetonsianhidrin.

Metode.

Darah pasien diambil dari vena ke dalam dua tabung reaksi - keringkan (8— 10 ml) dan dengan antikoagulan (2- 3 ml). Natrium sitrat digunakan sebagai antikoagulan. Eritrosit dari tabung reaksi dengan antikoagulan dicuci dua kali dengan larutan natrium klorida isotonik.. Setelah mencuci dan aspirasi supernatan ke 0,4 ml eritrosit ditambahkan 0,25 ml larutan natrium klorida isotonik.

Pada saat yang sama, darah diambil dari donor dengan golongan darah yang sama dalam dua tabung - dengan antikoagulan (2-3 ml), itu diproses dengan cara yang sama, seperti darah orang sakit, dan kering (8- 10 ml) untuk mendapatkan serumnya. Setelah pemisahan serum donor 0,5 ml ditempatkan dalam penangas air pada suhu 56 ° C 30 menit untuk inaktivasi komplemen. Serum donor harus diambil pada hari percobaan dan disimpan dalam lemari es.. Skema studi ditunjukkan pada tabel.

Tabung ditempatkan di termostat untuk 30 menit pada 37 ° C, dan kemudian disentrifugasi untuk 10 menit pada 2000 rpm dan menilai derajat hemolisis.

Untuk melakukan ini, tabung reaksi diisi dengan 3,4 ml reagen untuk menentukan konsentrasi hemoglobin dan 0,6 ml di atas- lapisan sedimen dari setiap tabung. Melalui 10 min mengukur kerapatan optik larutan dalam tabung reaksi di 540 nm pada refraktometer medis (spektrofotometer) atau kolorimeter medis (fotokolorimeter FEK-M) dengan filter hijau, membandingkan data yang diperoleh dengan kerapatan optik larutan untuk menentukan hemoglobin. Rata-rata dari dua bacaan dari setiap percobaan diambil.. Perhitungan dilakukan sesuai dengan rumus:

% hemolisis in vitro =((AKU S₁-AKU S₅)/(AKU S₈-AKU S₅))*100

dimana E₁ adalah kerapatan optik larutan dalam tabung reaksi No. 1; AKU S₅ adalah kerapatan optik larutan dalam tabung reaksi No. 5, diperlukan untuk menghilangkan warna serum itu sendiri; AKU S₈ adalah kerapatan optik larutan dalam tabung reaksi No. 8, di mana 100% hemolisis terjadi.

Untuk uji silang sukrosa (tabung no. 2) 100%-dan hemolisis diperiksa dalam tabung reaksi No. 7.

Evaluasi hasil.

Normal dalam tabung reaksi No. 1, mengandung eritrosit dari pasien yang diteliti, hemolisis tidak melebihi 2-3 %.

Dengan hemoglobinuria nokturnal paroksismal dan bentuk hemolisin dari anemia hemolitik autoimun (AIGA) dalam tabung ini, hemolisis melebihi 6 % Dalam tabung kontrol — Tidak. 4, mengandung eritrosit pasien dan serum darah donor yang tidak aktif, vial no. 5, mengandung eritrosit dan serum darah donor, dan nomor 6, mengandung larutan natrium klorida isotonik alih-alih serum - hemolisis tidak boleh melebihi 1-2 %.

Uji silang sukrosa (tabung no. 2) dengan bentuk hemolisin dari AIHA biasanya positif (dengan adanya hemolisin dalam serum darah), tapi bisa juga negatif.. In vitro No. 3 (eritrosit dan serum pasien) hemolisis terjadi seperti pada PNH, dan dalam bentuk hemolisin dari AIHA. Pada hemoglobinuria nokturnal paroksismal, hemolisis maksimum ditemukan pada sampel sukrosa rutin. (tabung no. 1), kurang jelas - dalam sampel dengan eritrosit pasien sendiri (tabung no. 3); tidak ada hemolisis dalam uji silang sukrosa (tabung no. 2).

Dengan bentuk hemolisin dari AIHA hemolisis yang paling menonjol terdeteksi dalam sampel dengan serum darah dan eritrosit pasien sendiri (tabung no. 3), agak kurang jelas - dalam tabung reaksi No. 1. In vitro No. 2 hemolisis sering terjadi, tetapi ketidakhadirannya tidak mengecualikan bentuk hemolisin dari AIHA.