Studi tentang hemostasis pembuluh darah-platelet

Pelanggaran pada tingkat hemostasis dapat terjadi dengan kecenderungan untuk perdarahan atau trombosis, tergantung pada metode penelitian yang dipilih. Selain, Semua metode penelitian platelet Hemostasis dibagi menjadi primer dan sekunder, Tes atau baris kedua, yang hanya berlaku dalam kasus, jika menggunakan tes mengungkapkan pelanggaran. Utama (bazïsnım) Berikut ini adalah tes.

Sampel untuk ketahanan (kerapuhan) kapiler - manset, Guci, angiorezistometriya

Dari tes ini, paling mudah diakses dan belum cukup informatif Contoh Konchalovsky-Tiller-LEED.

Estimasi yang dibuat pada jumlah dan ukuran perdarahan, terbentuk di atas permukaan palmar lengan bawah (dalam lingkaran dengan diameter 5 cm) Setelah 5 menit kompresi pada tekanan manset bahu 12-13,3 kPa (90-100 Mm Hg. Seni.). Hasil diperhitungkan melalui 5 menit setelah penghapusan manset. Jumlah petechiae lebih 10 menunjuk ke peningkatan kerapuhan microvessels, yang sering dikaitkan dengan trombositopenia atau fungsi trombosit pelanggaran angiotroficheskoy. Juga memperhitungkan terjadinya perdarahan, dan tepat di bawah kerah.

Sampel Banochnaya dilakukan di daerah yang sama dari kulit pada tekanan negatif membangun di tingkatan - dari 20 kPa (150 mm Hg. Seni.) dan lebih rendah. Dalam menilai petechiae hasil dihitung, muncul di Bank.

Sampel pada durasi dan besarnya perdarahan kapiler

Dalam klasik Duke sidang daun telinga rol lebih rendah setelah pemanasan cahayanya menembus ke kedalaman 3,5-4 mm. Pendarahan dalam penelitian ini biasanya tidak melebihi 4 m, setetes darah di kertas filter yang relatif rendah dan mulai menurun dengan cepat sejak sekitar 1-1,5 menit setelah tusukan. Ketika menyatakan trombositopenia (kurang 20 T di 1 l) disfungsi trombosit dan waktu perdarahan berat meningkat menjadi 20-40 menit, noda darah yang jauh lebih besar, dan penurunan jangka panjang atau mengurangi gelombang, kemudian meningkat lagi. Sampel Duke tidak cukup sensitif, di 2/3 Pasien dengan thrombocytopathies memberikan hasil yang normal.

Tes lebih sensitif, di mana waktu pendarahan diselidiki pada latar belakang sebuah stasis vena artifisial diciptakan, yang bahu ditumpangkan pada aparat manset untuk mengukur tekanan darah dan untuk penelitian didukung tekanan, sama 5,3 kPa (40 mm Hg. Seni.). Terhadap latar belakang stasis seperti di Borchgrevink sampel-Vaaler pada permukaan palmar dari ketiga atas dari lancet lengan diterapkan kedalaman sayatan melintang 1 mm dan panjang 8-10 mm (laju waktu perdarahan - up 10 m), dan sampel Ivey et al. sama diterapkan pada lancet lengan untuk mengambil darah dari tusukan jari tiga mendalam melintang 3 mm (laju waktu perdarahan - up 7 m).

Terhadap latar belakang stasis vena yang sama dilakukan Sebuah studi di. DARI. Shitikova, dimana di falang terminal diterapkan kedalaman tusukan 3 mm, kemudian ujung jari dicelupkan ke dalam cangkir 5 ml larutan natrium klorida isotonik dan waktu perdarahan dihitung dalam cahaya yang ditransmisikan (Jika solusi tersebut secara intensif bernoda darah, tindak lanjut untuk jari tersebut akan dipindahkan ke secangkir berbeda). Jumlah darah yang hilang ditentukan oleh peningkatan volume cairan dalam cangkir (laju waktu perdarahan - up 4 m, volume darah yang hilang - dari 0,01 untuk 0,4 ml).

Dalam tes di T. N. Shushkevich Volume darah yang hilang ditentukan oleh warna amonia (0,04 %) , yang direndam kertas dengan noda darah, dengan kolorimetri pada colorimeter medis.

Indikasi tes selama perdarahan, Abnormal, bukti penyalahgunaan menyatakan hemostasis platelet-vaskular, Namun, di bawah hasil normal sampel ini tidak mengecualikan thrombocytopathy menyatakan ringan.

Menghitung jumlah trombosit darah

Menghitung jumlah trombosit darah (di ruang penghitungan bawah Goryaeva fase kontras atau warna, atau dengan bantuan counter partikel) - Cara yang paling penting untuk mendiagnosis trombositopenia dan thrombocytopathy, melanjutkan dengan penurunan terus menerus atau intermiten dalam jumlah sel-sel ini (anomali Bernard-Soulier, Мея—Хегглина и др.).

Подсчет числа тромбоцитов также подсказывает, можно ли проводить их дальнейшее функциональное исследование и каким способом оно должно быть выполнено (с предварительным концентрированием тромбоцитов или без него, фотометрически или микроскопически и т. d.).

Изучение размеров тромбоцитов в мазке – trombotsitometriya

Изучение размеров тромбоцитов в мазке (trombotsitometriya) позволяет составить предварительное суждение о разных популяциях этих клеток в крови исследуемого и получить информацию о ряде их аномалий, а также о насыщении тромбоцитов гранулами.

При некоторых тромбоцитопатиях (синдроме Вискотта—Олдрича) в крови преобладают очень малые тромбоциты (untuk 2 мкм в диаметре), при других — гигантские формы (anomali Bernard-Soulier, Мея—Хегглина) - Untuk 8 m atau lebih. При ряде тромбоцитопатий эти клетки бедны гранулами (cm. di bawah), при других — нарушена централизация гранул при распластывании тромбоцитов на стекле, что свидетельствует о нарушении реакции освобождения гранул и содержащихся в них веществ, необходимых для осуществления гемостаза. Все эти свойства, а также способность тромбоцитов к распластыванию и образованию отростков, оценка структуры этих клеток могут быть изучены с помощью обычной и сканирующей электронной микроскопии, а также с помощью интерференционной оптики по Номарскому.

Ретракция кровяного сгустка закономерно нарушается при выраженной тромбоцитопении (менее 30—40 Г в 1 l) и при некоторых формах качественной неполноценности тромбоцитов, чаще всего — при тромбоцитоастении Гланцманна, уремической тромбоцитопатии и др.

Исследование адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов (ААФТ)

Исследование адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов (ААФТ) — важнейшее звено лабораторной диагностики большинства тромбоцитопатий. В настоящее время разработан ряд легко выполнимых и общедоступных методов исследования, включающий визуальную, микроскопическую и аппаратную (агрегометры, микрофильтры и др.) регистрацию этой функции к ориентировочным могут быть отнесены следующие методики.

Методы ретенции тромбоцитов на стекле (или фильтрах)

Проводится подсчет тромбоцитов в венозной крови до и после пропускания ее с о пределенной скоростью через стандартную колонку со стеклянными шариками или через косичку из стекловолокна; по убыли тромбоцитов из крови судят о степени их адгезивности.

Более доступен, хотя и несколько менее точен, метод определения числа тромбоцитов в крови до и после контакта ее в течение определенного срока с внутренней поверхностью колбы, вращающейся с определенной скоростью. Более точны методы определения задержки тромбоцитов на миллипорных фильтрах (диаметр пор — 15—20 мкм). При этих тестах оценка может проводиться по нарастанию градиента давления выше и ниже фильтра (закупорка пор тромбоцитами и их агрегатами ведет к увеличению этого показателя).

Методы исследования агрегационной функции тромбоцитов

Гемолизат-агрегационный тест основан на способности гемолизата отмытых эритроцитов, исследуемого в разведении 10^-2 dan 10^-6, вызывать при помешивании агрегацию в его же плазме, одержащей большое количество тромбоцитов (соотношение объемов цитратной плазмы и гемолизата — 1,0:0,2). Учитываются время появления агрегации (норма при высокой концентрации гемолизата—11—17 с, при низкой — 40—54 с) и ее выраженность. Динамика процесса и его интенсивность могут оцениваться также фотометрически (медицинский колориметр, зеленый светофильтр, помешивание) и на агрегографе любой конструкции.

При графической регистрации процесса использование высокого разведения гемолизата (10^-6) позволяет получить двухволновую агрегатограмму, в которой вторая волна связана с выходом из тромбоцитов эндогенных стимуляторов агрегации — АДФ, katekolamin, тромбоксана и др. Эта вторая волна характеризует реакцию освобождения, ее не наблюдается при отсутствии в тромбоцитах плотных гранул (болезни пула хранения) или при нарушении реакции освобождения (аспириноподобный синдром и др.).

Гемолизат-агрегационный тест доступен для выполнения в любой лаборатории, не требует никаких специальных реактивов.

Визуальный микрометод определения агрегации тромбоцитов

Esensinya terletak pada kenyataan, что полученная в условиях силиконирования венозная кровь стабилизируется двойным объемом 3,8 % цитрата натрия (соотношение 2,4:0,6 ml), ее центрифугируют 6 menit pada 100 об/ /мин, после чего полученную богатую тромбоцитами плазму наносят по 0,02 мл на предметные стекла и смешивают с таким же объемом агрегирующих агентов — АДФ, тромбином, коллагеном, норадреналином или ристомицином. Конечные концентрации агрегирующих агентов в исследуемой плазме крови должны составлять:

• ADF 0,5*10^-4 mmol/l;
• норадреналина — 0,015%;
• тромбина — 0,125 ед/мл (концентрация коллагена подбирается опытным путем).

Возможно испытание как более низких, так и более высоких концентраций агрегирующих агентов. Подбор их концентрации может варьировать в зависимости от неодинаковой активности препаратов различного производства и при разной активности образцов, sehubungan dengan yang untuk pra-sesuai dengan konsentrasi masing-masing agen pada plasma yang normal.

Campuran kaya trombosit plasma menggabungkan agen dicampur dengan goyang slide, pada latar belakang gelap dengan kaca pembesar mencatat waktu dari penampilan unit sebagai "badai salju". Dalam menilai hasil dihitung jumlah trombosit dalam plasma. Jadi, ADP-time agregasi, meningkatkan 27-37 detik pada 400 T di 1 l trombosit untuk 62-75 detik pada 50 T di 1 l, dan trombin-agregasi - masing-masing, 40-52 untuk 79- 106 dari.

Agregasi pendaftaran grafis

Pendaftaran grafis agregasi bawah pengaruh agen diagregasi sama - metode yang sangat informatif studi platelet fungsional. Dilakukan pada atau agregografah.

Ketika grafis mendaftar menentukan tidak hanya timbulnya agregasi, namun intensitasnya (kurva deviasi terbesar dan daerah agregatogrammy), pertama dan kedua gelombang agregasi - bila menggunakan konsentrasi rendah epinefrin dan ADP (вторая волна характеризует реакцию освобождения), а также патологической дезагрегации.

Визуальное или графическое исследование агрегации тромбоцитов под влиянием ристомицина

Весьма важным является визуальное или графическое исследование агрегации тромбоцитов под влиянием ристомицина. Нарушается этот вид агрегации (конечная концентрация ристомицина 0,8—1,0 мг/мл) при одном из наиболее распространенных геморрагических диатезов — ангиогемофилии (болезни Виллебранда), а также при аномалии тромбоцитов Бернара—Сулье и при некоторых приобретенных видах угнетения синтеза фактора Виллебранда (uremia, иммунная ингибиция его и т. d.).

Количественное определение фактора Виллебранда в плазме крови

Количественное определение фактора Виллебранда в плазме крови проводится по ристомицин-агглютинации взвеси нормальных формалинизированных тромбоцитов в различных разведениях исследуемой бестромбоцитарной плазмы.

Метод важен как для диагностики ангиогемофнлии и вторичного угнетения синтеза этого фактора, так и для оценки тяжести поражения эндотелия (vaskulitis, атеросклероз и др.) и наклонности к тромбозам, при которых содержание фактора Виллебранда в крови часто значительно повышается.

Уровень фактора Виллебранда свидетельствует о способности эндотелия синтезировать его (снижен при аигиогемофилии) и о степени поражения эндотелия при васкулитах, атеросклерозе и других заболеваниях, протекающих с поражением внутренней оболочки сосудов.

Для получения фиксированных нормальных тромбоцитов к богатой тромбоцитами плазме крови здоровых лиц добавляются последовательно 0,2 % раствор ЭДТА (0,5 ml 5 мл плазмы) dan dengan 2 мин — фиксирующий раствор (20 ml 40 % формалина в 1000 мл фосфатного буфера с 0,2 г ЭДТА, pH 6,4).

Смесь выдерживается при температуре +4°С не менее 1 tidak, после чего она подвергается центрифугированию, удаляется надосадочная жидкость, а тромбоцитарный осадок дважды отмывается суспензирующим раствором (один объем 3,8 % раствора цитрата натрия и пять объемов изотонического раствора хлорида натрия; pH доводится до 7,4). Приготовленная взвесь нормальных формалинизированных тромбоцитов фасуется по 1 мл и хранится при температуре —20°С. Калибровочная кривая разведения строится с использованием бестромбоцитарной нормальной плазмы, с образцами которой смешиваются формалинизированные тромбоциты. Далее в смеси определяется ристомицин-агглютинация. По калибровочной кривой определяется количество фактора Виллебранда в исследуемой плазме крови. Фиксированные тромбоциты лучше сохраняются при добавлении в консервирующий раствор небольшого количества азида натрия.

Tes, отражающие спонтанную агрегацию тромбоцитов

При обследовании больных с тромбоэмболиями или с повышенной наклонностью к тромбозу и ишемии в число основных методов включаются тесты, отражающие спонтанную агрегацию тромбоцитов, t. Ini adalah. возникающую в цельной крови или в плазме крови без добавления агрегирующих агентов.

Для выявления этого феномена при микроскопии мазка крови обращается внимание на соотношение числа отдельно лежащих тромбоцитов и их агрегатов, состоящих из 3—5 тромбоцитов и более. Этот феномен лучше выявляется при просмотре осадка, полученного при интенсивном цеитрифу- гировании богатой тромбоцитами плазмы (20—30 мин при 6000 / Min), стабилизированной цитратом или ЭДТА-цитратным раствором. Однако более стабильные результаты дают следующие методы определения спонтанной агрегации.

Метод Wu—Hoak

Метод Wu—Hoak основан на том, что кровь из вены набирается в две пробирки, в одной из которых содержится раствор ЭДТА, а в другой — смесь такого же раствора ЭДТА с 4 % раствором формалина. После перемешивания содержимое пробирок отстаивается 30 menit pada suhu kamar.

Во время отстаивания агрегаты оседают, а отдельные тромбоциты остаются в надосадочном слое. После отстаивания подсчитывается число тромбоцитов в надосадочном слое в каждой из пробирок. В норме разница в количестве тромбоцитов в содержимом обеих пробирок не превышает 10—15 %, при повышенной спонтанной агрегации она возрастает.

Метод Н. DAN. Тарасовой

По методу Н. DAN. Тарасовой (1984) убыль тромбоцитов из цельной цитратной крови в агрегаты учитывается после 3-минутного взбалтывания ее на встряхивателе АВУ-1 со скоростью 90—100 раз в 1 m.

В пробирку с 0,5 ml darah, подвергавшейся встряхиванию, diperkenalkan 1 ml 1 % раствора формалина в изотоническом растворе хлорида натрия. Вторая пробирка с контролем не подвергается встряхиванию, и в содержащуюся в ней кровь того же исследуемого через 3 мин также вводится раствор формалина.

Darah di kedua tabung pendukung 30 m, setelah itu supernatan dihitung dalam jumlah trombosit. Biasanya, perbedaan platelet counts tidak melebihi 20 %, pada kecenderungan tinggi untuk agregasi, meningkatkan.

Dalam kasus pelanggaran dalam penerapan tes dasar, karakteristik hemostasis platelet, mengoperasikan sejauh yang diperlukan untuk melakukan studi tambahan. Dari jumlah tersebut yang paling penting adalah sebagai berikut.

Studi tambahan untuk menentukan hemostasis platelet

Исследование количества мегакариоцитов в миелограмме и трепанате костного мозга с изучением морфологии этих клеток

Значительное увеличение числа мегакариоцитов в срезах костного мозга, обычно сочетающееся с более или менее выраженным увеличением количества тромбоцитов в крови, наблюдается при эритремии, геморрагическом и эссенциальном тромбоцитозе и других миелопролиферативных заболеваниях. Умеренный мегакариоцитоз, сочетающийся с тромбоцитопенией, характерен для тромбоцитопенической пурпуры (болезни Верльгофа).

При аплазии и гипоплазии костного мозга любого генеза снижено как содержание мегакариоцитов в срезах костного мозга, так и количество тромбоцитов в периферической крови.

Парциальный амегакариоцитоз наблюдается при дефиците тромбоцитопоэтина (редкая форма врожденной тромбоцитопении), появлении в крови антимегакариоцитарных антител, эссенциальной парциальной аплазии мегакариоцитов (может предшествовать развитию лейкоза).

Морфологические и цитохимические изменения мегакариоцитов отмечаются при многих тромбоцитопатиях.

Электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры тромбоцитов

Электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры тромбоцитов имеет значение для диагностики ряда тромбоцитопатий, при которых отсутствуют или резко уменьшается количество небелковых гранул высокой оптической плотности (содержащих АДФ, Serotonin, katekolamin, кальций и др.), либо белковых α-гранул, что характерно для ряда тромбоцитопатий, объединяемых в группу болезней пула хранения, или болезней отсутствия гранул.

Могут выявляться также дефекты в контрактильном аппарате (системе микротрубочек) и лизосомах тромбоцитов.

При сканирующей электронной микроскопии или исследовании тромбоцитов с помощью интерференционной оптики по Номарскому могут обнаруживаться также дефекты фиксации тромбоцитов на чужеродной поверхности, их распластывания на ней, образование отростков, централизация и секреция гранул, что характерно для многих видов тромбоцитопатий.

Определение антитромбоцитарных антител путем иммунофлюоресцент- ного исследования в суспензии тромбоцитов иммуноглобулина, связанного с этими клетками – метод Диксона

Этот сложный метод позволяет дифференцировать иммунные и неиммунные тромбоцитопении.

Однако при наиболее выраженных формах заболевания с резкой тромбоцитопенией он неприемлем, так как для определения связанного иммуноглобулина требуется достаточно большое (более 40—50 Г в 1 l) jumlah trombosit.

Определение продолжительности жизни меченых аутологичных тромбоцитов

Определение продолжительности жизни меченых аутологичных тромбоцитов позволяет разграничивать тромбоцитопении с нормальной продолжительностью жизни тромбоцитов в циркуляции (tentang 9 Malam) и формы заболевания с укороченной продолжительностью жизни этих клеток.

Первые чаще всего связаны со снижением продукции тромбоцитов в костном мозге, вторые — с их ускоренной гибелью, либо с действием антитромбоцитарных антител (при аутоиммунных тромбоцитопениях продолжительность жизни тромбоцитов сокращается до нескольких часов), либо с интенсивной убылью этих клеток в агрегаты и тромбы при диссеминированном внутрисосудистом свертывании крови или массивных тромбозах (тромбоцитопении потребления).

Количественное определение содержания в плазме крови до и после агрегации тромбоцитарных факторов

Количественное определение содержания в плазме крови до и после агрегации ряда тромбоцитарных факторов — мембранного фосфолипидного фактора 3, содержимого α-гранул (антигепаринового фактора 4, β-тромбоглобулина, митогенного фактора тромбоцитов) и небелковых гранул высокой электронно-оптической плотности (Serotonin, katekolamin, ADF), а также кислых гидролаз.

Эти исследования дают представление о содержании в тромбоцитах соответствующих структур и их компонентов, об освобождении их в плазму в процессе агрегации, а также о внутрисо- судистой активации тромбоцитов, сопровождающейся выходом из тромбоцитов в плазму крови с повышением концентрации в последней компонентов плотных и α-гранул (антигепаринового фактора 4, β-тромбоглобулина и др.).

Методы количественного исследования тромбоцитарных факторов важны для идентификации ряда тромбоцитопатий (нарушений сохранности гранул и их компонентов, пареза реакции освобождения этих компонентов, повышения содержания их в плазме крови вследствие интенсивной внутри- сосудистой адгезии и агрегации тромбоцитов и др.). Ряд тромбоцитопатий характеризуются снижением содержания в мембранах тромбоцитов фактора 3 либо нарушением его доступности для участия в процессе свертывания крови.

Исследование биохимических особенностей тромбоцитов и отдельных их структур

Исследование биохимических особенностей тромбоцитов и отдельных их структур — стромы, butiran, митохондрий и т. d. позволяют документировать связь разных видов патологии и дисфункции тромбоцитов с определенными видами ферментной недостаточности (дефицитом циклооксигеназы, тромбоксансинтетазы и пр.), с нарушением состава мембранных липопротеинов, необходимых для взаимодействия с агрегирующими агентами, dan t. d.

Подобные исследования доступны лишь хорошо оснащенным исследовательским лабораториям и поэтому в широкой практике не применяются.