बोल पड़ना के cytochemical अध्ययन
Cytochemical प्रतिक्रियाओं, èâkulâtom द्वारा, रासायनिक संरचना और कक्षों की अपनी कार्यात्मक गतिविधि के बारे में न्यायाधीश करने के लिए अनुमति देता है.
बोल पड़ना की एसिड फॉस्फेट गतिविधि का निर्धारण
एसिड फॉस्फेट की गतिविधि в эякуляте во много раз превышает ее активность в крови. Кислая фосфатаза входит в состав секрета предстательной железы, продукция ее стимулируется мужскими гонадотропными гормонами. С помощью цитохимических реакций она выявляется в сперматозоидах и других клетках эякулята. Активность ее определяется методом Гольдберга — Барка.
अभिकर्मकों.
1. Формалиновый спирт (одну часть готового 40 % формалина растворяют в девяти частях 96% एथिल अल्कोहल).
2. Парарозанилин: 1 г основного фуксина для фук- синосернистой кислоты растворяют при подогревании в 25 मिलीलीटर 2 н соляной кислоты; ठंडा, фильтруют и хранят в холодильнике. Реактив стойкий.
3. Водный раствор нитрата натрия 4 %. 4. Раствор метилового зеленого на ацетатном буфере 2 % (पीएच- 5). Полученный раствор промывают хлороформом, для чего смешивают приблизительно равные количества хлороформа и 2 % раствора метилового зеленого. Многократно взбалтывают в течение дня, а затем окрасившийся в фиолетовый цвет хлороформ Удаляют с помощью делительной воронки.
5. Инкубационная среда, состоящая из двух компонентов.
- А-компонент: 20 мг нафтол-А5-фосфата растворяют в 0,5 (0,3) мл диметилформамида, जोड़ना 40 मिलीलीटर 0,1 н раствора ацетата натрия и фильтруют через бумажный фильтр; готовят в день исследования.
- Б-компонент: 8 ड्रॉप 4 % सोडियम नाइट्रेट समाधान के साथ मिलाया गया था 8 каплями парарозанилина; готовят ex tempore. Для получения инкубационной среды оба компонента соединяют (pH 5,2—5,4). При необходимости pH исправляют либо 50 % уксусной кислотой, либо раствором едкой щелочи.
विधि. Свежий эякулят центрифугируют, при большом количестве сперматозоидов обходятся без центрифугирования. Из осадка готовят шлифованным стеклом тонкие мазки, कि, как и мазки крови, высушивают на воздухе. Далее высушенные мазки фиксируют путем погружения их в стаканчик с формалиновым спиртом на 30 से (अब और नहीं) и промывают дистиллированной водой. Затем мазки погружают в стаканчик с инкубационной средой и помещают в термостат при температуре 37 सी 2 नहीं. После этого их ополаскивают в дистиллированной воде, погружают на 10 мин в стаканчик с раствором метилового зеленого (для докрашивания ядер), быстро смывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и исследуют с помощью иммерсионной системы микроскопа.
Активность кислой фосфатазы можно выразить с помощью среднего цитохимического коэффициента (СЦК) द्वारा полуколичественному методу Астальди—Верга. Согласно формуле
СЦК=(3*а+2*б+1*в)/100
где цифры в числителе указывают на интенсивность окраски (अधिकतम- 3, умеренная — 2, следы — 1), а буквы — на процентное содержание сосчитанных клеток определенной интенсивности окраски; आंकड़ा 100 в знаменателе — общее количество сосчитанных клеток.
उदाहरण के लिए, сосчитано 100 सेल, из них с максимальной интенсивностью окраски 20 सेल, с умеренной — 20 и со следами — 60 सेल. Отсюда:
СЦК=(3*20+2*20+1*60)/100=1,6
В сперматозоидах кислая фосфатаза располагается в виде единичных крупных гранул красно-оранжевого цвета в верхнем отделе головки.
Занятая хроматином часть головки окрашена в зеленый цвет и не содержит кислой фосфатазы.
Более бледная диффузная окраска на кислую фосфатазу выявляется вокруг нижней части головки, а иногда распространяется и на шейку сперматозоида. Средний цитохимический коэффициент кислой фосфатазы сперматозоидов в нормальном эякуляте составляет 2,0—2,4.
В цитоплазме клеток сперматогенеза обнаруживаются скопления гранул, ярко окрашивающихся в специфический (красно-оранжевый) रंग. В поддерживающих клетках извитых семенных канальцев, часто резко положительно окрашенных на кислую фосфатазу, просвечиваются неокрашенные головки (хроматин) शुक्राणु. Гистиоциты и макрофаги содержат немногочисленные гранулы, положительно окрашенные на кислую фосфатазу. В единичных лимфоцитах, а иногда и в нейтрофильных гранулоцитах встречаются отдельные гранулы, обладающие активностью кислой фосфатазы.
Определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в эякуляте
Сукцинатдегидрогеназа - एनजाइम, участвующий в окислительно-восстановительных реакциях, содержится в клетках эякулята в значительном количестве. Однако характер изменения ее активности при различных патологических процессах еще недостаточно хорошо изучен. Активность сукцинатдегидрогеназы в клетках определяется модифицированным методом Нарциссова.
अभिकर्मकों.
1. Ацетон-трилон (ацетон — 60 मिलीलीटर, дистиллированная вода — 40 मिलीलीटर, трилон Б — 250 मिलीग्राम).
2. Раствор метилового зеленого 2 % (тот же краситель, который используется для кислой фосфатазы).
3. Инкубационная среда, состоящая из следующих компонентов:
और) фосфатного буфера (pH 7,2—7,4) - 10 मिलीलीटर;
को) 5,4 % раствора сукцината натрия – 10 मिलीलीटर;
में) трилона Б (13 мг разводят в 5 मिलीलीटर आसुत जल);
जी) воды дистиллированной — 5 मिलीलीटर;
घ) нитротетразолия фиолетового (10 мг разводят в 10 पानी की मिलीलीटर).
Все компоненты смешивают в одном флаконе и хранят в холодильнике. Готовая среда может использоваться многократно — в течение 10 दिन या उससे अधिक.
विधि. Мазки, приготовленные из эякулята, фиксируют в ацетон-трилоне в течение 30 से, промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Затем мазки погружают в инкубационную среду и помещают в термостат при температуре 37 सी 1 नहीं, после чего их промывают дистиллированной водой и докрашивают метиловым зеленым в течение 10 एम. Далее снова быстро промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и исследуют с помощью иммерсионной системы микроскопа.
Нормальные сперматозоиды обладают высокой активностью сукцинатдегидрогеназы, представленной крупными сине-фиолетовыми гранулами, कि, сливаясь между собой, образуют плотную массу, заполняющую шейку сперматозоида, у некоторых сперматозоидов отдельные гранулы встречаются и вокруг головки.
Подсчитать слившиеся друг с другом гранулы не представляется возможным, поэтому для определения активности сукцинатдегидрогеназы окрашенную часть сперматозоидов измеряют в микрометрах. По длине специфически окрашенной на сукцинатдегидрогеназу части сперматозоида судят о степени активности фермента в этом сперматозоиде. С помощью окуляр-микрометра и объект-микрометра измеряется длина специфически окрашенной части в 100 сперматозоидах. Сложив длину окрашенных участков в подсчитанных сперматозоидах и разделив полученную цифру на 100, получают среднюю длину, выражающую сукцинатдегидрогеназную активность для одного сперматозоида. В норме она составляет 4,3±0,7 мкм. Такой подсчет активности СДГ наиболее информативен и поэтому рекомендуется для использования в научных целях.
Для широкого применения в практике этот метод довольно сложен, предпочтительнее выражать количество сукцинатдегидрогеназы по методу Астальди—Верга. Средний цитохимический коэффициент СДГ сперматозоидов в нормальном эякуляте составляет 2,7 ±0,3.
В клетках сперматогенеза активность СДГ выявляется в виде скоплений крупных сине-фиолетовых гранул, часто сливающихся в крупные глыбки, располагающиеся в различных участках цитоплазмы. Средний цитохимический коэффициент в клетках сперматогенеза не достигает 2,0. По мере созревания клеток эякулята активность СДГ нарастает и в зрелых сперматозоидах превышает 2,0. В цитоплазме отдельных лимфоцитов обнаруживаются крупные гранулы СДГ.
Определение активности пероксидазы в эякуляте
В сперматозоидах, клетках сперматогенеза и поддерживающих клетках извитых семенных канальцев пероксидаза отсутствует.
В нейтрофильных гранулоцитах эякулята активность пероксидазы выражена в значительной степени и может изменяться в зависимости от характера патологического процесса, так же как и в периферической крови. Уровень активности пероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах важен для оценки их функционального состояния и активности воспалительного процесса в мужских половых органах. Окраска мазков эякулята по Грэму—Кноллю и учет активности фермента по Астальди—Вергу проводятся аналогично мазкам крови.
Активность пероксидазы в клетках эякулята определяется по методу Грэма—Кнолля.
अभिकर्मकों.
1. Формалиновый спирт (वही, что и для кислой фосфатазы).
2. Пероксидазный реактив: ʙenzidin (на кончике скальпеля) में भंग 6 मिलीलीटर 96 % एथिल अल्कोहल, जोड़ना 4 आसुत पानी की मिलीलीटर 0,02 मिलीलीटर 3 % हाइड्रोजन पेरोक्साइड. Реактив годен к употреблению в течение 5—6 дней.
3. Краситель Романовского в разведении 1—2 капли на 1 मिलीलीटर आसुत जल.
विधि. Свежие мазки эякулята фиксируют в течение 30 с формалиновым спиртом, промывают проточной водой и высушивают. Затем мазки заливают пероксидазным реактивом на 5—7 мин, тщательно промывают в проточной воде и высушивают. После этого их докрашивают 15— 20 мин красителем Романовского, промывают проточной водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа.
При положительной реакции на пероксидазу в нейтрофильных гранулоцитах обнаруживаются крупные золотисто-коричневые гранулы в значительном количестве. При большом количестве лейкоцитов необходимо подсчитывать средний цитохимический коэффициент (СЦК). В цитоплазме отдельных гистиоцитов пероксидаза содержится в виде небольших скоплений таких же гранул.
Определение гликогена в эякуляте
Изменения содержания гликогена в различных клетках отражаются на их функции или свидетельствуют о развитии патологического процесса. Определение гликогена в клетках проводится методом Мак-Мануса.
अभिकर्मकों.
1. Водный раствор йодной кислоты 1 % (готовится перед употреблением).
2. Сернистая вода: 5 मिलीलीटर 10 % метабисульфита калия или натрия, 5 मिलीलीटर 1 н соляной кислоты, вода до 100 मिलीलीटर (готовится перед употреблением).
3. Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина для фуксиносернистой кислоты, предварительно растертого в фарфоровой ступке, растворяют при постоянном встряхивании в течение 5 мин в 200 мл кипящей дистиллированной воды, пропускают через бумажный фильтр и добавляют при охлаждении до 50 सी 20 मिलीलीटर 1 н соляной кислоты, а при охлаждении до 25 °С — 1 г метабисульфита калия или натрия. Приготовленный реактив выдерживают в холодильнике в течение 24 ч после чего он просветляется и стано вится пригодным для употребления
4.Водный раствор метилового зеленого 2 %, промытый хлороформом
5.Химически чистый метиловый спирт.
विधि.
Тонкие высушенные мазки эякулята фиксируют химически чистым метиловым спиртом в течение 3 एम, ополаскивают дистиллированной водой и опускают в стаканчик с 1 % водным раствором йодной кислоты на 5 एम. Затем мазки промывают дистиллированной водой, высушивают, ополаскивают в сернистой воде и снова высушивают.
Далее опускают мазки в стаканчик с реактивом Шиффа на 15 एम, ополаскивают их в трех порциях сернистой воды (द्वारा 3 мин в каждой), промывают 10 мин в воде и докрашивают ядра клеток 3 мин метиловым зеленым. После этого снова ополаскивают мазки водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с помощью иммерсионной системы микроскопа.
В зрелых сперматозоидах гликоген отсутствует. В цитоплазме молодых сперматозоидов, особенно с «воротничком», выявляются следы гликогена (±), иногда в виде единичных гранул в верхней части головки или в области «воротничка».
В клетках сперматогенеза гликоген обнаруживается в большом количестве в виде вишнево-красных гранул, заполняющих всю цитоплазму. По мере созревания клетки теряют гликоген вплоть до исчезновения его в зрелых сперматозоидах. Сперматоциты содержат гликоген не только в цитоплазме, но и в ядре. В поддерживающих клетках извитых семенных канальцев гликоген располагается в виде вишнево-красных гранул и диффузно. Зрелые нейтрофильные гранулоциты в эякуляте, как и в мазках периферической крови, содержат значительное количество гликогена. При хроническом простатите в нейтрофильных гранулоцитах эякулята значительно возрастает количество гликогена и повышается активность пероксидазы. В единичных лимфоцитах в норме иногда встречаются гранулы гликогена.
मैक्रोफेज содержат следы гликогена Фон мазков эякулята окрашивается в вишнево-красный цвет, что свидетельствует о наличии в плазме эякулята большого количества гликозаминогликанов (mukopolisaxaridov).
Определение рибонуклеиновой кислоты (शाही सेना) в эякуляте
Повышенное содержание РНК в клетках свидетельствует о высокой активности их в отношении роста, секреторной, синтетической и другой деятельности. Снижение содержания РНК в молодых клетках часто сопряжено с пониженной способностью этих клеток к регенерации. Содержание РНК в клетках определяется методом Курника.
अभिकर्मकों.
1. Реактив Курника: готовят отдельно 2 % растворы метилового зеленого и пиронина, раствор метилового зеленого тщательно промывают хлороформом; рабочий раствор красителя приготавливают путем смешивания 2 % раствора пиронина (12,5 मिलीलीटर) और 2 % раствора метилового зеленого (7,5 मिलीलीटर) с добавлением 30 मिलीलीटर आसुत जल. Краситель стойкий, फ्रिज में जमा.
2. Фиксатор — химически чистый метиловый спирт.
विधि. Мазки фиксируют метиловым спиртом в течение 3 एम, окрашивают рабочим раствором пиронин-метилового зеленого 15 एम, быстро ополаскивают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа. РНК окрашивается пиронином в ярко-красный цвет, ядра клеток — метиловым зеленым в зеленый.
Зрелые сперматозоиды не содержат РНК. Клетки сперматогенеза богаты РНК, количество которой убывает в клетках по мере их созревания. У сперматогоний цитоплазма насыщенно-розового цвета, у сперматоцитов она бледнее, और у сперматид бледно-розовая. У юных сперматозоидов с «воротничком» в розовый цвет окрашивается преимущественно «воротничок».
शुक्राणु, находящиеся на последней стадии своего развития, в поддерживающих клетках извитых семенных канальцев теряют остатки розовой субстанции (शाही सेना) и превращаются в зрелые сперматозоиды.
В клетках сперматогенеза содержится большое количество гликогена, РНК и значительно выражена активность СДГ и КФ. लेकिन, आमतौर पर, эти клетки единичные в эякуляте, поэтому подсчет СЦК нецелесообразен. В таких случаях ограничиваются описательной формой заключения.
Цитохимическая характеристика лейкоцитов является важным показателем их функциональной активности. Учет количества вещества в лейкоцитах эякулята проводится так же, как и в других клетках эякулята и в периферической крови.
В окрашенных обычными методами мазках эякулята (азурозиновыми смесями, гематоксилин-эозином и пр.), а также в нативных препаратах не всегда легко различить лейкоциты, शुक्राणुजनन की कोशिकाओं, эпителий предстательной железы, гистиоциты и другие элементы.
Цитохимические методы в сочетании с морфологическими нередко помогают установить вид клеток. इतना, выраженная активность пероксидазы, представленной крупными золотисто-коричневыми гранулами, заполняющими всю цитоплазму клетки, характерна для зрелых нейтрофильных гранулоцитов, у других клеток такая реакция не наблюдается. Выраженная реакция на гликоген типична для нейтрофильных гранулоцитов и клеток сперматогенеза, но последние не обладают пероксидазной активностью. РНК содержится в клетках сперматогенеза и отсутствует в зрелых гранулоцитах. Клетки сперматогенеза обладают выраженной реакцией на кислую фосфатазу, а в нейтрофильных гранулоцитах она выражена очень слабо и т. घ.
