Hémoglobinurie paroxystique nocturne – Maladie de Marchiafava Michele

Hémoglobinurie paroxystique nocturne - Plutôt une forme rare acquise d'anémie hémolytique, en rapport avec le changement dans la structure des globules rouges du sang, granulocytes neutrophiles et des plaquettes. Le produit des symptômes d'une hémolyse intravasculaire, dans lequel il y a une hémoglobinurie, gemosiderinuriya, élever le niveau de hémoglobine plasmatique libre. La maladie est souvent compliquée par une thrombose des veines périphériques et les vaisseaux sanguins des organes internes.

Étiologie et la pathogenèse de hémoglobinurie paroxystique nocturne

La première description de la maladie a été donné en 1882 g. Plus précisément, il a été décrit dans 1928 g.

Nom commun de la maladie - hémoglobinurie paroxystique nocturne (PNG), mais il est de petites correspond à l'essence de la maladie, car il n'y a pas de véritables paroxysmes et hémoglobinurie pas toujours observées.

Hémolyse intravasculaire avec gemosiderinuriey sauf APG observé dans de nombreuses formes d'anémie hémolytique auto-immune à la fois thermique, et avec des anticorps froids, en particulier en forme avec hémolysine thermique, aussi bien que dans certaines formes d'anémie hémolytique héréditaire, liée à la perturbation de la structure des membranes érythrocytaires.

Maladie de Marchiafava Michele observé à différents âges. La raison de la destruction accrue des globules rouges est de globules rouges eux-mêmes défectifs.

Les globules rouges de patients atteints de APG, comme indiqué plus haut, Il est facilement détruite par le complément dans la création de conditions optimales pour ses actions, ou par acidification du sérum, soit en augmentant la concentration de l'érythrocyte autour compléter en créant une faible concentration d'ions dans le milieu de saccharose. Les globules rouges de patients atteints de gaz associé ont une sensibilité accrue aux effets de l'anticorps que l'agglutinine, et, notamment, hémolysines.

Lorsque APG affecte non seulement les globules rouges du sang, mais aussi des leucocytes et des thrombocytes. Plaquettes et les leucocytes de patients atteints de APG ont une sensibilité accrue aux effets du complément comme dans le lactosérum d'acidification, et dans un milieu avec une faible force ionique de saccharose. Ils sont beaucoup plus sensibles à la fois l'action de idioagglutinin, que les plaquettes de donateurs et leucocytes. Ainsi, les plaquettes et les globules blancs ont la même membrane de défauts, comme erythrocytes.

Découvrir immunoglobulines sur la surface de globules rouges, leucocytes et des plaquettes, et donc de prouver la propriété de l'APG au groupe ne peuvent pas être des maladies auto-agressif méthodes les plus sensibles.

Il existe des preuves solides de gaz associé à deux populations distinctes de globules rouges. Les cellules les plus résistants à une personne saine - réticulocytes sont les plus fragiles de l'APG. Ceci indique que, population érythrocytaire anormale qui tout simplement ne survit pas à l'échéance, tandis que les cellules âgées de globules rouges matures sont population en bonne santé, ou presque sain.

DANS 1970 l'étude des mulâtres érythrocytaires, stradaûŝej PNG, trouvé, ils contiennent, comme dans mulâtre saine, deux variantes électrophorétiques normales de G-6-PD; Option A, répandue parmi la population de l'Afrique, et l'option B, propre à la population de l'Europe. Après l'hémolyse est apparu, érythrocytes pathologiques ne contiennent qu'un seul mode de réalisation de la G-6-PD, et des globules rouges normaux - deux variantes électrophorétiques de G-6-PD. Par Conséquent, globules rouges hémolysés sont les descendants d'une seule cellule.

Ce fait avec une confiance élevée indique la présence de deux populations de cellules rouges du sang, différant non seulement fonctionnelle, comme, par exemple,, quand microspherocytosis, mais d'origine: en d'autres termes, il confirme la présence du clone cellulaire anormale, t. c'est. mutation somatique. L'identité des lésions de la membrane érythrocytaire, les neutrophiles et les plaquettes suggère, que l'information reçue cellule pathologique probable, suivant la tige, t. c'est. précurseur cellulaire myélopoïèse. Croissance néoplasique est pas typique pour PNG. Nous décrivons seulement quelques cas de leucémie dans le fond de l'APG rapide. Cependant, On peut supposer, SGA - une variante d'une tumeur bénigne du système du sang, longtemps de ne pas donner la prolifération tumorale, caractéristique pour d'autres formes de leucémie.

Le mécanisme de komplementchuvstvitelnosti au APG ne sait pas.

Des changements importants dans l'activité des enzymes de la glycolyse et le cycle des pentoses-phosphate sont absents.

Lorsque APG réduit l'activité de l'acétylcholinestérase érythrocytaire, très probablement due à la rupture de la structure de la membrane des globules rouges du sang, puisque l'enzyme est sur la surface de la membrane et est facilement rompu au cours de sa défaite. Connu, que les inhibiteurs de l'acétylcholinestérase eu aucun effet sur la survie des érythrocytes. Toutefois, la réduction de l'activité de l'acétylcholinestérase observée avec d'autres formes d'anémie hémolytique, par conséquent, ne peut pas expliquer le phénomène de l'augmentation de komplementchuvstvi- tions du.

Il existe des preuves, montrant une augmentation de la quantité d'acides gras insaturés, les membres des phospholipides, membrane érythrocytaire. Il est possible, que les changements dans les lipides - il est seulement le reflet de tout autre changement dans la structure de la membrane des érythrocytes. Dans la protéine de APG patients de l'étude de la membrane érythrocytaire par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en dodécylsulfate de sodium-ensemble, qu'un certain nombre de fractions de la teneur en protéines était significativement différent du témoin.

Le rôle principal dans la pathogenèse des complications thrombotiques de désintégration intravasculaire APG affecté de globules rouges et la stimulation des facteurs de coagulation, est libérée à partir des cellules rouges du sang au cours de leur décroissance. Lorsque APG détruit principalement des réticulocytes, Il peut être, et il est nécessaire d'expliquer la fréquence des complications thrombotiques de la maladie, contrairement à d'autres formes d'anémie hémolytique, accompagnée par une grave hémolyse intravasculaire.

Les manifestations cliniques de hémoglobinurie paroxystique nocturne

La maladie commence souvent progressivement. Les patients se plaignent de faiblesse, malaise, vertiges. Sclérotique Parfois, il subikterichnost. Souvent, les premières plaintes sont des maux de tête, douleurs abdominales de divers localisation. La tendance à la thrombose accrue provoque le patient de consulter un médecin. Hémoglobinurie est assez rare est le premier symptôme de la maladie, et certains patients peut être absent de la SGA. Dans certains cas, il semble que les 2-3 premières années, et même après 10 ans après l'apparition.

Une des caractéristiques de l'APG - des épisodes de douleurs abdominales. Localiser peut être très différente. En dehors de la période de crise de la douleur abdominale, généralement, pas observé. Souvent, il rejoint vomissements. Probablement, la douleur abdominale chez les patients avec APG associée à la thrombose vasculaire mésentérique.

Thrombose vasculaire périphérique (plus souvent - veineuse extrémités supérieures et inférieures, vaisseaux rénaux - rarement) comme un symptôme caractéristique de hémoglobinurie paroxystique nocturne. Dans 12 % APG patients observés thrombophlébite. Complications thrombotiques sont la cause la plus fréquente de décès dans cette maladie.

Une étude objective du patient attire souvent l'attention pâleur légèrement jaunisse. Souvent, il ya des poches de visage, plénitude parfois excessif. Une légère augmentation de la rate et du foie, bien qu'il soit pas typique pour PNG.

Pour hémoglobinurie nocturne paroxystique signes caractéristiques de hémolyse intravasculaire, la plus importante - une augmentation de l'hémoglobine exempte de plasma. Cette caractéristique observée périodiquement dans presque tous les patients APG. Cependant, la quantité d'augmentation de l'hémoglobine exempte de plasma est variable et dépend de la, dans une période de la maladie étudiée. Dans la période de crise, ce chiffre augmente de façon significative, Il a également eu une augmentation du nombre de metalbumina plasma.

Le niveau de l'hémoglobine exempte de plasma dépend du degré d'hémolyse en réalité, le contenu de l'haptoglobine, degré de filtration de l'hémoglobine dans l'urine et la vitesse de la destruction complexe hémoglobine - haptoglobine. Dans le cas d'un faible degré d'hémolyse du niveau de l'hémoglobine exempte de plasma serait insuffisant pour sa filtration à travers le filtre de rein. Ainsi hémoglobinurie est le symptôme pas obligatoire. Lors du passage à travers les tubules de néphrons hémoglobine alloué partiellement détruites et déposés dans l'épithélium tubulaire. Elle est la cause de l'excrétion urinaire d'hémosidérine.

L'hémosidérine excrétée dans l'urine dans la grande majorité des patients atteints d'hémoglobinurie paroxystique nocturne. Parfois, il ne semble pas immédiatement gemosiderinuriya. Ceci est important, mais pas spécifique aux signes de la maladie de la SGA.

Les résultats de laboratoire dans hémoglobinurie paroxystique nocturne

Le contenu de l'hémoglobine chez les patients APG va de 1,86- 3,1 mmol / l (30-50 G / l) et même inférieure à la normale en rémission.

Le nombre de globules rouges chez des patients atteints APG diminue en fonction du niveau de la diminution de l'hémoglobine. Indice de couleur de longue période reste proche de l'unité. Où, si le patient perd une quantité importante de fer dans l'urine sous forme hémoglobine et hémosidérine, le niveau de fer est progressivement réduite. Indice de couleur faible observée dans environ la moitié des patients. Certains d'entre eux ont des niveaux élevés d'hémoglobine P, en particulier dans la période d'exacerbation.

Une proportion significative de patients augmentation de réticulocytes, mais relativement faible (2- 4 %). Le nombre de leucocytes dans l'APG dans la plupart des cas réduit. Chez de nombreux patients, il est de 1,5 à 3 F 1 l, mais parfois réduit à F de 0,7 à 0,8 dans 1 l. Leucopénie, généralement, il en réduisant le nombre de granulocytes neutrophiles. Parfois, le sang numération des globules blancs au APG normale ou élevée - jusqu'à 10-11 T 1 l.

Lorsque APG diminution de l'activité phagocytaire des neutrophiles.

Thrombocytopénie aussi souvent observé au APG, cependant, l'état fonctionnel de plaquettes avec la normale. Probablement, Ce qui explique la rareté des complications hémorragiques dans cette maladie, Bien que le nombre de plaquettes est parfois réduit dans une large mesure - 10-20 G 1 l. Généralement la plupart des plaquettes de patients en T 50-100 1 l. La numération plaquettaire normale ne pas exclure le diagnostic de l'hémoglobinurie paroxystique nocturne.

Examen de la moelle osseuse asymptomatique, généralement caractéristique de l'anémie hémolytique - rouge hématopoïèse de germe ennuyeux myelokaryocytes de quantité normale. Un certain nombre de patients il ya une légère diminution du nombre de mégacaryocytes.

Le niveau de fer sérique à APG Cela dépend du stade de la maladie, hémolyse et le degré d'activité de l'hématopoïèse intravasculaire. Où, Si les patients ont hémoglobinurie persistants ou fréquents, ainsi que la constante gemosiderinuriya, la teneur en fer dans le corps, et donc, et diminue dans le sérum, parfois très nettement. Parfois APG commence avec des signes d'hypoplasie. Les stocks de fer dans le corps du patient dépend de l'APG, un côté, de perte dans le fer dans l'urine, et d'autre part l'intensité de l'érythropoïèse. Par conséquent, la carence en fer ne peut pas être considéré comme diagnostique de hémoglobinurie paroxystique nocturne.

Le niveau de la bilirubine sérique à APG dans la plupart des cas nerezko normale ou élevée, principalement en raison de indirecte. En moyenne, la bilirubine est 22-28 mmol / l. Il doit être pris en compte, que la décroissance de l'hémoglobine intravasculaire formé complexe hémoglobine gaptoglobinovy, et qui se décompose finalement aussi avec la formation de bilirubine.

Chez certains patients, la maladie commence avec l'image PNG anémie aplasique.

Le diagnostic d'hémoglobinurie paroxystique nocturne

Lorsque hémoglobinurie paroxystique nocturne perturbé la structure des membranes érythrocytaires, qui se manifeste par une sensibilité accrue aux effets de son complément. Cette sensibilité accrue est détecté en utilisant une sonde Hema, saccharose ou des tests plus sensibles. Cependant, dans certains cas,, en particulier sous la forme d'anémie hémolytique autoimmune hémolysine, échantillon de saccharose peut donner un faux résultat positif. Hémolysine sont fixés sur la surface de leurs propres globules rouges et en présence de complément dans le milieu saccharose détruire, tandis que la destruction typique du complément APG des cellules sans exposition à l'anticorps.

Pour éliminer la moisissure hémolysine auto-immune étude des hémolysines d'anémie hémolytique recommandé par la méthode ci-dessus et en utilisant croix-de saccharose, avec des échantillons de sérum du patient et les globules rouges du donneur odnogruppnoy, et non vice-versa, Comme il est habituel. Lorsque APG test direct est positif, et la croix - négative. Quand la forme d'hémolysine AIHA peut être vu comme un signe positif, et une croix-échantillon négatif. Dans ces cas, il est opportun d'utiliser un troisième mode de réalisation des tests de saccharose - avec l'aide de fois dans le sérum, et les globules rouges du patient. Le degré d'hémolyse dans ce mode de réalisation, le minimum et le maximum à APG sous la forme d'AIHA hémolysine. Pour expliquer un tel résultat ne peut être que des anticorps sériques très spécifiques sous forme d'hémolysine patient anémie hémolytique autoimmune pour l'antigène, riche en érythrocytes d'un patient, donneurs de globules rouges. Échantillon de saccharose direct est positif chez ces patients est associée, probablement, avec la présence d'anticorps fixés sur les érythrocytes.

Identifier hémolysines par agregatgemagglyutinatsii et d'autres aident à faire le bon diagnostic. Il ne peut pas être utilisé comme un sérum de patient donneur, résultat que dans le cas du contenu y hémolysine peut être faux positif. Un résultat négatif peut se produire, si elle est utilisée en tant que source de complément de sérum du patient ou APG sérum de patients atteints de cirrhose du foie, revmatoidnыm poliartritom, le lupus érythémateux systémique et d'autres maladies, dans lequel le niveau réduit de complément. Échantillon de saccharose et de l'échantillon Hema deviennent moins prononcées, Si la prise de sang du patient est utilisée comme anticoagulant, l'héparine, au lieu de citrate de sodium. Après la crise hémolytique échantillon de l'intensité de l'échantillon Hema et le saccharose réduit, mais ils ne deviennent pas négatifs.

Détermination de l'hémoglobine libre plasmatique par Bing dans la modification et Derviz Byalko quand hémoglobinurie paroxystique nocturne

La méthode est basée sur la capacité de l'hémoglobine à réagir avec de la benzidine dans un milieu acide en présence de peroxyde d'hydrogène pour former une couleur vert, passant d'abord dans le bleu, puis violet rougeâtre. L'intensité de la couleur est proportionnelle à la quantité d'hémoglobine.

Réactifs.

1. Un tampon d'acétate 0,1 M, pH 4,6: 27,22 g d'acétate de sodium dissous dans 1 l d'eau (0,2 M solution de); dans un autre ballon est préparé 1 l 0,2 M solution d'acide acétique; mixte 480 Numéro ml 1 et 520 Numéro ml 2.
2. Le peroxyde d'hydrogène 0,3 % solution (préparé par dilution avant l'utilisation dans perhydrol 100 temps).
3. Benzidine chlorhydrate 0,1 % solution: 50 benzidine chlorhydrique mg dissous dans 35-40 ml de tampon acétate, la solution est chauffée à 80 ° C bain d'eau et, après refroidissement, on ajuste à un tampon d'acétate 50 ml.

Filtrer la bouteille sombre et stockés à température ambiante pas plus de 7 jours. Réactif Pozheltevshiy inadapté, avec assombrissement rapide, il devrait être recristallisé dans l'alcool benzidine.

Méthode.

Des échantillons de sang prélevés dans une veine dans le tube siliconé de aiguille sèche, contenant l'un anticoagulant. Sang anticoagulé a été centrifugé à plus 10 minutes à 1500 / Min. Après séparation du plasma de nouveau centrifugé 10 minutes à 8000 tr / min pour sédimenter les globules blancs.

Le tube de coulée 4 ml de tampon d'acétate, 2 ml de peroxyde d'hydrogène, 2 ml et la benzidine 0,04 ml de sérum de test a été mélangée et laissée au repos 3 m, puis versé dans une cuvette de longueur de trajet 1 cm et photométriques contre la solution de compensation à un filtre vert. L'intensité de la couleur bleue augmente pendant 4-5 min, de sorte que la mesure est répétée 3-5 fois dans une rangée et enregistrer la lecture maximale. Après 5-6 minutes, la coloration de sérum devient teinte brun violacé, et la densité optique commence à diminuer. Sur les deux identifiés les meilleurs résultats prend une densité optique moyenne.

Solution de rémunération, consistant en 6 ml de tampon d'acétate, 8 ml de peroxyde d'hydrogène, 3 ml et benzidine 0,06 ml de solution isotonique de chlorure de sodium, préparé en même temps que l'échantillon.

La sortie de la courbe d'étalonnage de la solution d'hémoglobine. Dans le sang, pris pour préparer une solution d'hémoglobine, mesuré par son contenu (colorimètre dans le réfractomètre médical ou médico). Une solution d'hémoglobine avec une concentration de 1 g / l, Une solution d'une concentration plus faible: 0,005,0,025, 0,05, 0,1 et 0,2 g / l. De chacun de la solution résultante, on ajoute 0,04 ml d'un mélange de 4 ml de tampon d'acétate, 2 ml et benzidine 2 ml de peroxyde d'hydrogène.

La solution de base hémolysat (1 g / l) pour la courbe d'étalonnage doit être stocké au froid, et des solutions de travail de plus faible concentration doivent être préparées immédiatement avant l'essai.

Normalement, dans le 1 l plasma sanguin contient 0,0005 mmol / l (0,01-0,04 G) Hémoglobine.

Détermination de hémosidérine urine avec hémoglobinurie paroxystique nocturne

Dans la désintégration de l'hémoglobine fer, elle absorbe l'épithélium des tubules rénaux et fait partie de l'hémosidérine. Cellules épithéliales exfoliées des tubules rénaux dans ces cas contiennent un grain de hémosidérine.

Une étude attentive de l'urine sédiments après centrifugation du grain hémosidérine vu sans taches spéciales. Cependant, ils se distinguent plus clairement dans la couleur de Méthode Perls.

Méthode.

Après centrifugation de l'urine de sa couche supérieure a été aspiré, Au résidu, on a ajouté une solution fraîchement préparée de 1 % ferrocyanure et 1 % Acide chlorhydrique (mélanger des volumes égaux 2 % l'acide chlorhydrique et le ferrocyanure). Après 10 minute après agitation, le mélange a été centrifugé et le précipité de navigation. Grains hémosidérine colorées en bleu.

Détermination methémalbumine plasma spectrophotométrie

Réactifs.

1. Tampon phosphate iso-osmotique (pH 7,4): mixte 18 ml 0.15 M solution de dihydrogénophosphate de sodium (24,4 d de ЫaN2R04 1 l d'eau) et 82 ml 0,15 M solution d'hydrogénophosphate disodique (21,3 г NaH₂APRÈS₄ sur 1 l d'eau).
2. Hydrosulfite de sodium.
3. L'hydroxyde de sodium 1 M.
4. Une solution de sérum-albumine humaine (40 g / l).
5. La solution d'hémine (5 mg / 100 ml); préparée immédiatement hémine en dissolvant dans une petite quantité d'hydroxyde de sodium, et puis: amener au volume avec une solution d'albumine sérique.

Méthode.

K 2 ml de sérum ou de plasma ajouté 1 ml solution zabuferernogo isoosmotique, pH 7,4. Le mélange a été centrifugé 30 à 1200-1500 m / min. Déterminer la densité optique à 569 nm. Ensuite, le plasma dilué a été placé dans un flacon et on l'ajoute à environ 5 mg de sulfate d'hydrogène sec de sodium. Par 5 min re-mesurer l'absorbance à la même longueur d'onde. La différence entre les deux valeurs de densité optique correspond à la densité optique de méthémalbumine. Méthémalbumine concentration est déterminée à partir de la courbe d'étalonnage.

La courbe d'étalonnage est calculée comme suit. Solution d'hémine avec de l'albumine a été transféré dans un tube à essai en une quantité de 0,01 à 0,1 g / l (de 0,2 à 2 ml). Dans ces tubes, dans lequel la quantité de sel est inférieure 2 ml, ajoutés à 2 ml de solution d'albumine. On ajoute ensuite 1 ml de tampon phosphate de isoosmotique. Le mélange a été centrifugé à 1500 / Min, puis on mesure la densité optique. La différence entre les mesures est tracée en fonction du nombre d'hémine.

Déconnecté de plasma Normalement gemalbumin. Il apparaît dans le cas d'hémolyse intravasculaire, par exemple,, lorsque le formulaire d'hémoglobinurie paroxystique nocturne d'hémolysine ou anémie hémolytique autoimmune, et en l'absence de l'haptoglobine, lorsque l'hème est lié à l'albumine.

Hema de l'échantillon lorsque hémoglobinurie paroxystique nocturne

Hema échantillon basé sur des erythrocytes de patients atteints de résistance réduit diminution APG pH du milieu en présence de complément de sérum frais.

Réactifs.

1. Une solution d'acide chlorhydrique 0,2 n.
2. Solution d'ammoniaque 0,04 %.

Méthode.

De Vienne prendre 5- 6 ml de sang. Comme le citrate de sodium ou oxalate anticoagulant utilisé. Simultanément, 15-20 ml de sang a été prélevé d'un donneur du même groupe. Séparer le plasma des globules rouges dans le sang du patient et le donneur.

Donneur Sérum versé 0,5 Six ml tubes, deux d'entre eux ont été placés sur 20 minutes dans un bain d'eau à 56 ° C dlya inactivation complément sыvorotki, Quatre tubes ont été laissés au repos à la température ambiante. Les globules rouges du patient a été lavée deux fois avec une solution de chlorure de sodium isotonique, puis mis en suspension dans la même solution à raison de 1:1.

La conception de l'étude est présenté dans le tableau.

Le contenu de chaque tube ont été mélangées, placé sur 1 heures dans un four à 37 ° C, puis centrifugé.

Pour la découpe de la 0,05 m de globules rouges du patient et le donneur est ajouté séparément à la 0,55 ml de solution isotonique de chlorure de sodium.

Après centrifugation, le degré d'hémolyse peut être estimée à l'oeil. Pour quantifier le degré d'hémolyse dans chaque tube pour 4,7 ml 0,04 % solution d'ammoniac sont ajoutés 0,3 ml de la couche de surface, et ébauches de tubes - 0,3 sérum d'origine ml.

Pour identifier 100 % à hémolyse 4,7 On a ajouté ml de solution d'ammoniaque 0,3 ml de suspension de globules rouges du sang (0,05 ml de globules rouges du sang chez le patient 0,55 ml de solution isotonique de chlorure de sodium).

La densité optique de la solution est mesurée à des lectures de colorimètre médicaux et comparée à la densité optique de la solution d'ammoniac sans erythrocytes:

% gemoliza =((EST₁-EST₂)/EST₃)*100;

où E₁ - Densité optique d'un échantillon de test; EST₂- La densité optique de l'ébauche; EST₃- Absorbance 100 % gemolizata.

Normalement, pas plus que l'hémolyse 5 % érythrocyte.

Hema échantillon est considéré comme positif si, Si hémolyse plus 6 % érythrocyte.

Lorsque nocturne forme hémoglobinurie paroxystique d'hémolysine et auto-immunes anémie hémolytique hémolysés parfois jusqu'à 50-80 % érythrocyte. Pour les maladies caractérisées par la présence d'une hémolyse seulement neinaktivirovannoy sérique (nombre de tubes 2). Si l'inactivation du sérum ne l'empêche pas d'hémolyse (nombre de tubes 3), Vous pouvez supposer l'existence d'autres formes d'anémie hémolytique, ou une erreur dans le réglage de la recherche.

Pour la destruction des globules rouges de patients atteints de hémoglobinurie paroxystique nocturne dans le pH du milieu 6,5 Il nécessite la présence obligatoire de complément, contenue dans du sérum frais.

Échantillon saccharose à hémoglobinurie paroxystique nocturne

Saccharose échantillon est basée sur la, que les érythrocytes des patients atteints d'hémoglobinurie paroxystique nocturne et le formulaire d'hémolysine anémie hémolytique autoimmune détruites dans des solutions de faible force ionique en présence de complément.

Réactifs.

1. Saccharose: 9,42 Le saccharose a été dissous dans 0,005 Tampon phosphate M; pH 6,2 (91 ml 0,005 М NaH₂APRÈS₄ et 9 ml 0,005 M Na₂HPO₄).
2. Réactif pour la détermination de la concentration d'hémoglobine: 200 mg de sel de sang rouge dissous dans 1 l d'eau distillée, on y a ajouté 0,5 ml d'acétone cyanhydrine.

Méthode.

Le sang est prélevé de la veine du patient dans deux tubes à essai - sèche (8-10 Ml) et avec un anticoagulant (2- 3 ml). L'utilisation sous forme de citrate de sodium anticoagulant. Les globules rouges à partir de tubes anticoagulants ont été lavées deux fois avec une solution de chlorure de sodium isotonique. Après le lavage et l'aspiration du surnageant de 0,4 On ajoute ml de globules rouges du sang 0,25 ml de solution isotonique de chlorure de sodium.

En même temps, le sang est prélevé d'un donneur du même groupe sanguin dans deux tubes - avec un anticoagulant (2-3 Ml), il est traité avec la même, le sang du patient, et sec (8- 10 ml) de sérum. Après séparation du sérum de donneur 0,5 ml est placé dans un bain d'eau à une température 56 ° C 30 min Dlya compléter inactivation. Sérum donneur de sang doit être prise le jour de l'expérience et de stocker dans le froid. La conception de l'étude est présenté dans le tableau.

Les tubes ont été placés dans un incubateur à 30 minutes à 37 ° C, et ensuite centrifugé pendant 10 minutes à 2000 tr / min, et d'évaluer le degré d'hémolyse.

Pour cela, on verse dans des flacons pour 3,4 ml de réactif pour la détermination de la concentration d'hémoglobine et 0,6 ml sur- couche de sédiments de chaque tube. Par 10 min mesuré l'absorbance de la solution dans des tubes à essai avec 540 réfractomètres médicaux nm (spectrophotomètre) ou colorimètre médical (Pholocolorimètres FЭK-M) quand un filtre vert, la comparaison des données obtenues avec la densité optique de la solution pour le dosage de l'hémoglobine. Il prend la moyenne des deux lectures de chaque expérience. Le calcul est effectué par la formule:

% hémolyse in vitro =((EST₁-EST₅)/(EST₈-EST₅))*100

où E₁ - La densité optique de la solution dans le nombre de tubes à essai 1; EST₅ - La densité optique de la solution dans le nombre de tubes à essai 5, nécessaire pour éviter la coloration du sérum; EST₈ - La densité optique de la solution dans le nombre de tubes à essai 8, où il y avait une hémolyse de 100%.

Pour l'échantillon contre-saccharose (nombre de tubes 2) 100%-D'abord étudié en nombre d'hémolyse in vitro 7.

Évaluation des résultats.

Normalement, le nombre d'in vitro 1, contenant les globules rouges de patients étudiés, L'hémolyse ne doit pas excéder 3.2 %.

Lorsque nocturne forme hémoglobinurie paroxystique d'hémolysine et anémie hémolytique autoimmune (AIGA) Cette hémolyse in vitro dépasse 6 % Les tubes à essai - № 4, contenant des globules rouges du patient et le sérum de donneur inactivé, nombre de tubes 5, contenant des globules rouges et du sérum donneur, et le nombre 6, au lieu de sérum contenant une solution isotonique de chlorure de sodium - une hémolyse ne doit pas dépasser 2/1 %.

Échantillon de saccharose Croix (nombre de tubes 2) lorsque le formulaire d'hémolysine AIHA habituellement positifs (en présence d'hémolysine dans le sérum), mais il peut aussi être négatif. Dans nombre vitro 3 (les globules rouges et sérum de patients) hémolyse est observée tant au APG, et sous la forme d'AIHA hémolysine. Lorsque l'hémoglobinurie paroxystique nocturne hémolyse maximale est détectée dans l'échantillon de saccharose classique (nombre de tubes 1), moins prononcée - dans un échantillon de propres globules rouges du patient (nombre de tubes 3); aucune hémolyse dans l'échantillon de saccharose croix (nombre de tubes 2).

Quand la forme d'hémolysine AIHA plus prononcé hémolyse est détectée dans un échantillon avec son propre du sérum sanguin et des globules rouges du patient (nombre de tubes 3), un peu moins prononcée - dans un certain nombre de tubes à essai 1. Dans nombre vitro 2 hémolyse fréquemment observée, mais son absence ne exclut pas la forme d'hémolysine AIHA.