Estudios citoquímicos de eyaculado

Reacción citoquímica, realizado con eyaculación, nos permiten juzgar la composición química y la actividad funcional de sus células..

Determinación de la actividad de la fosfatasa ácida en el eyaculado.

Actividad de la fosfatasa ácida en la eyaculación es muchas veces mayor que su actividad en la sangre. La fosfatasa ácida forma parte de la secreción prostática., su producción es estimulada por hormonas gonadotrópicas masculinas. Mediante reacciones citoquímicas se detecta en los espermatozoides y otras células del eyaculado.. Su actividad está determinada por el método de Goldberg-Bark.

Reactivos.

1. alcohol de formalina (una parte lista 40 % la formalina se disuelve en nueve partes 96% alcohol etílico).

2. pararosanilina: 1 g fucsina básica para fuch- El ácido sulfuroso se disuelve cuando se calienta en 25 ml 2 norte ácido clorhídrico; enfriado, filtrar y guardar en el frigorífico.. El reactivo es estable.

3. Solución acuosa de nitrato de sodio 4 %. 4. Solución de verde de metilo en tampón acetato. 2 % (ph - 5). La solución resultante se lava con cloroformo., ¿Por qué mezclar cantidades aproximadamente iguales de cloroformo y 2 % solución de verde de metilo. Agitar repetidamente a lo largo del día., y luego se elimina el cloroformo de color púrpura mediante un embudo de decantación..

5. Ambiente de incubación, compuesto por dos componentes.

• componente A: 20 Se disuelven mg de naftol-A5-fosfato en 0,5 (0,3) ml de dimetilformamida, añadir 40 ml 0,1 n solución de acetato de sodio y filtrar a través de un filtro de papel; preparado el día del examen.
• componente B: 8 gotas 4 % solución de nitrato de sodio se mezcló con 8 gotas de pararosanilina; preparado ex tempore. Para obtener el medio de incubación se combinan ambos componentes. (pH 5,2—5,4). Si es necesario, se ajusta el pH 50 % ácido acético, o una solución de álcali cáustico.

Método. La eyaculación fresca se centrifuga., con una gran cantidad de espermatozoides, no se requiere centrifugación. Se preparan frotis finos a partir del sedimento utilizando vidrio esmerilado., que, como manchas de sangre, secar al aire. A continuación, los frotis secos se fijan sumergiéndolos en un vaso con alcohol formaldehído. 30 de (no más) y se lavó con agua destilada. Luego los frotis se sumergen en una taza con medio de incubación y se colocan en un termostato a una temperatura 37 ° C 2 no. Después de esto, se enjuagan con agua destilada., sumergido en 10 min en un vaso con solución de verde de metilo (para terminar los granos), lavar rápidamente con agua, Se secó con papel de filtro y se examinó usando un sistema de microscopio de inmersión..

La actividad de la fosfatasa ácida se puede expresar utilizando el coeficiente citoquímico promedio. (SCK) por método semicuantitativo de Astaldi-Verga. Según la fórmula

SCK=(3*a+2*b+1*c)/100

donde los números en el numerador indican la intensidad del color (máximo - 3, moderado - 2, huellas - 1), y las letras indican el porcentaje de células contadas de una determinada intensidad de color; figura 100 el denominador es el número total de células contadas.

Por Ejemplo, contado 100 célula, de los cuales con máxima intensidad de color 20 célula, con moderado - 20 y con huellas - 60 célula. Desde aquí:

SCK=(3*20+2*20+1*60)/100=1,6

En los espermatozoides, la fosfatasa ácida se encuentra en forma de gránulos grandes y únicos de color rojo anaranjado en la parte superior de la cabeza..

La parte de la cabeza ocupada por la cromatina es de color verde y no contiene fosfatasa ácida..

Se detecta una tinción difusa más pálida de fosfatasa ácida alrededor de la parte inferior de la cabeza., y a veces se extiende hasta el cuello del espermatozoide.. El coeficiente citoquímico promedio de la fosfatasa ácida del esperma en una eyaculación normal es de 2,0 a 2,4..

Se encuentran acumulaciones de gránulos en el citoplasma de las células de la espermatogénesis., colores brillantes en un específico (rojo anaranjado) color. En las células de sostén de los túbulos seminíferos contorneados., a menudo fuertemente positivo para la fosfatasa ácida, cabezas sin pintar se ven a través (cromatina) esperma. Los histiocitos y macrófagos contienen pocos gránulos., teñido positivo para fosfatasa ácida. En linfocitos individuales, y a veces se encuentran gránulos individuales en granulocitos neutrófilos, tener actividad fosfatasa ácida.

Determinación de la actividad succinato deshidrogenasa. (ODS) en la eyaculación

Succinato deshidrogenasa - Enzimas, involucrado en reacciones redox, contenido en las células eyaculadas en cantidades significativas. Sin embargo, la naturaleza de los cambios en su actividad en diversos procesos patológicos aún no se ha estudiado bien.. La actividad de la succinato deshidrogenasa en las células se determina mediante el método de Narcissov modificado..

Reactivos.

1. Acetona-trilón (acetona - 60 ml, agua destilada - 40 ml, trilón B - 250 mg).

2. Solución de verde de metilo 2 % (el mismo tinte, que se utiliza para la fosfatasa ácida).

3. Ambiente de incubación, compuesto por los siguientes componentes:

y) tampón de fosfato (pH 7,2—7,4) - 10 ml;

a) 5,4 % solución de succinato de sodio - 10 ml;

en) trilona b (13 mg diluye en 5 ml de agua destilada);

g) agua destilada - 5 ml;

d) violeta de nitrotetrazolio (10 mg diluye en 10 ml de agua).

Todos los componentes se mezclan en una botella y se guardan en el refrigerador.. El medio terminado se puede utilizar repetidamente, dentro de 10 días o más.

Método. frotis, preparado a partir de eyaculación, fijado en acetona-trilona para 30 de, Lavado con agua destilada y secado al aire.. Luego los frotis se sumergen en el medio de incubación y se colocan en un termostato a una temperatura 37 ° C 1 no, después de lo cual se lavan con agua destilada y se tiñen con verde de metilo para 10 m. Luego enjuague rápidamente con agua nuevamente., Se secó con papel de filtro y se examinó usando un sistema de microscopio de inmersión..

esperma normal Tienen alta actividad succinato deshidrogenasa., representado por grandes gránulos azul violeta, que, fusionándose entre sí, образуют плотную массу, заполняющую шейку сперматозоида, у некоторых сперматозоидов отдельные гранулы встречаются и вокруг головки.

Подсчитать слившиеся друг с другом гранулы не представляется возможным, поэтому для определения активности сукцинатдегидрогеназы окрашенную часть сперматозоидов измеряют в микрометрах. По длине специфически окрашенной на сукцинатдегидрогеназу части сперматозоида судят о степени активности фермента в этом сперматозоиде. С помощью окуляр-микрометра и объект-микрометра измеряется длина специфически окрашенной части в 100 сперматозоидах. Сложив длину окрашенных участков в подсчитанных сперматозоидах и разделив полученную цифру на 100, получают среднюю длину, выражающую сукцинатдегидрогеназную активность для одного сперматозоида. В норме она составляет 4,3±0,7 мкм. Такой подсчет активности СДГ наиболее информативен и поэтому рекомендуется для использования в научных целях.

Для широкого применения в практике этот метод довольно сложен, предпочтительнее выражать количество сукцинатдегидрогеназы по методу Астальди—Верга. Средний цитохимический коэффициент СДГ сперматозоидов в нормальном эякуляте составляет 2,7 ±0,3.

В клетках сперматогенеза активность СДГ выявляется в виде скоплений крупных сине-фиолетовых гранул, часто сливающихся в крупные глыбки, располагающиеся в различных участках цитоплазмы. Средний цитохимический коэффициент в клетках сперматогенеза не достигает 2,0. По мере созревания клеток эякулята активность СДГ нарастает и в зрелых сперматозоидах превышает 2,0. В цитоплазме отдельных лимфоцитов обнаруживаются крупные гранулы СДГ.

Определение активности пероксидазы в эякуляте

В сперматозоидах, клетках сперматогенеза и поддерживающих клетках извитых семенных канальцев пероксидаза отсутствует.

В нейтрофильных гранулоцитах эякулята активность пероксидазы выражена в значительной степени и может изменяться в зависимости от характера патологического процесса, так же как и в периферической крови. Уровень активности пероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах важен для оценки их функционального состояния и активности воспалительного процесса в мужских половых органах. Окраска мазков эякулята по Грэму—Кноллю и учет активности фермента по Астальди—Вергу проводятся аналогично мазкам крови.

Активность пероксидазы в клетках эякулята определяется по методу Грэма—Кнолля.

Reactivos.

1. alcohol de formalina (mismo, что и для кислой фосфатазы).

2. Пероксидазный реактив: ʙenzidin (на кончике скальпеля) disuelto en 6 ml 96 % alcohol etílico, añadir 4 ml de agua destilada 0,02 ml 3 % peróxido de hidrógeno. Реактив годен к употреблению в течение 5—6 дней.

3. Краситель Романовского в разведении 1—2 капли на 1 ml de agua destilada.

Método. Свежие мазки эякулята фиксируют в течение 30 с формалиновым спиртом, промывают проточной водой и высушивают. Затем мазки заливают пероксидазным реактивом на 5—7 мин, тщательно промывают в проточной воде и высушивают. После этого их докрашивают 15— 20 мин красителем Романовского, промывают проточной водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа.

При положительной реакции на пероксидазу в нейтрофильных гранулоцитах обнаруживаются крупные золотисто-коричневые гранулы в значительном количестве. При большом количестве лейкоцитов необходимо подсчитывать средний цитохимический коэффициент (SCK). В цитоплазме отдельных гистиоцитов пероксидаза содержится в виде небольших скоплений таких же гранул.

Определение гликогена в эякуляте

Изменения содержания гликогена в различных клетках отражаются на их функции или свидетельствуют о развитии патологического процесса. Определение гликогена в клетках проводится методом Мак-Мануса.

Reactivos.

1. Водный раствор йодной кислоты 1 % (готовится перед употреблением).

2. Сернистая вода: 5 ml 10 % метабисульфита калия или натрия, 5 ml 1 norte ácido clorhídrico, вода до 100 ml (готовится перед употреблением).

3. Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина для фуксиносернистой кислоты, предварительно растертого в фарфоровой ступке, растворяют при постоянном встряхивании в течение 5 мин в 200 мл кипящей дистиллированной воды, пропускают через бумажный фильтр и добавляют при охлаждении до 50 ° C 20 ml 1 norte ácido clorhídrico, а при охлаждении до 25 °С — 1 г метабисульфита калия или натрия. Приготовленный реактив выдерживают в холодильнике в течение 24 ч после чего он просветляется и стано вится пригодным для употребления

4.Водный раствор метилового зеленого 2 %, промытый хлороформом

5.Химически чистый метиловый спирт.

Método.

Тонкие высушенные мазки эякулята фиксируют химически чистым метиловым спиртом в течение 3 m, ополаскивают дистиллированной водой и опускают в стаканчик с 1 % водным раствором йодной кислоты на 5 m. Затем мазки промывают дистиллированной водой, высушивают, ополаскивают в сернистой воде и снова высушивают.

Далее опускают мазки в стаканчик с реактивом Шиффа на 15 m, ополаскивают их в трех порциях сернистой воды (por 3 мин в каждой), промывают 10 мин в воде и докрашивают ядра клеток 3 мин метиловым зеленым. После этого снова ополаскивают мазки водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с помощью иммерсионной системы микроскопа.

В зрелых сперматозоидах гликоген отсутствует. В цитоплазме молодых сперматозоидов, особенно с «воротничком», выявляются следы гликогена (±), иногда в виде единичных гранул в верхней части головки или в области «воротничка».

В клетках сперматогенеза гликоген обнаруживается в большом количестве в виде вишнево-красных гранул, заполняющих всю цитоплазму. По мере созревания клетки теряют гликоген вплоть до исчезновения его в зрелых сперматозоидах. Сперматоциты содержат гликоген не только в цитоплазме, но и в ядре. В поддерживающих клетках извитых семенных канальцев гликоген располагается в виде вишнево-красных гранул и диффузно. Зрелые нейтрофильные гранулоциты в эякуляте, как и в мазках периферической крови, содержат значительное количество гликогена. При хроническом простатите в нейтрофильных гранулоцитах эякулята значительно возрастает количество гликогена и повышается активность пероксидазы. В единичных лимфоцитах в норме иногда встречаются гранулы гликогена.

Los macrófagos содержат следы гликогена Фон мазков эякулята окрашивается в вишнево-красный цвет, что свидетельствует о наличии в плазме эякулята большого количества гликозаминогликанов (mukopolisaxaridov).

Определение рибонуклеиновой кислоты (ARN) en la eyaculación

Повышенное содержание РНК в клетках свидетельствует о высокой активности их в отношении роста, секреторной, синтетической и другой деятельности. Снижение содержания РНК в молодых клетках часто сопряжено с пониженной способностью этих клеток к регенерации. Содержание РНК в клетках определяется методом Курника.

Reactivos.

1. Реактив Курника: готовят отдельно 2 % растворы метилового зеленого и пиронина, раствор метилового зеленого тщательно промывают хлороформом; рабочий раствор красителя приготавливают путем смешивания 2 % раствора пиронина (12,5 ml) y 2 % solución de verde de metilo (7,5 ml) с добавлением 30 ml de agua destilada. Краситель стойкий, almacenar en el refrigerador.

2. Фиксатор — химически чистый метиловый спирт.

Método. Мазки фиксируют метиловым спиртом в течение 3 m, окрашивают рабочим раствором пиронин-метилового зеленого 15 m, быстро ополаскивают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа. РНК окрашивается пиронином в ярко-красный цвет, ядра клеток — метиловым зеленым в зеленый.

Зрелые сперматозоиды не содержат РНК. Клетки сперматогенеза богаты РНК, количество которой убывает в клетках по мере их созревания. У сперматогоний цитоплазма насыщенно-розового цвета, у сперматоцитов она бледнее, y у сперматид бледно-розовая. У юных сперматозоидов с «воротничком» в розовый цвет окрашивается преимущественно «воротничок».

Esperma, находящиеся на последней стадии своего развития, в поддерживающих клетках извитых семенных канальцев теряют остатки розовой субстанции (ARN) и превращаются в зрелые сперматозоиды.

В клетках сперматогенеза содержится большое количество гликогена, РНК и значительно выражена активность СДГ и КФ. Pero, normalmente, эти клетки единичные в эякуляте, поэтому подсчет СЦК нецелесообразен. В таких случаях ограничиваются описательной формой заключения.

Цитохимическая характеристика лейкоцитов является важным показателем их функциональной активности. Учет количества вещества в лейкоцитах эякулята проводится так же, как и в других клетках эякулята и в периферической крови.

В окрашенных обычными методами мазках эякулята (азурозиновыми смесями, гематоксилин-эозином и пр.), а также в нативных препаратах не всегда легко различить лейкоциты, células de la espermatogénesis, эпителий предстательной железы, гистиоциты и другие элементы.

Цитохимические методы в сочетании с морфологическими нередко помогают установить вид клеток. Así, выраженная активность пероксидазы, представленной крупными золотисто-коричневыми гранулами, заполняющими всю цитоплазму клетки, характерна для зрелых нейтрофильных гранулоцитов, у других клеток такая реакция не наблюдается. Выраженная реакция на гликоген типична для нейтрофильных гранулоцитов и клеток сперматогенеза, но последние не обладают пероксидазной активностью. РНК содержится в клетках сперматогенеза и отсутствует в зрелых гранулоцитах. Клетки сперматогенеза обладают выраженной реакцией на кислую фосфатазу, а в нейтрофильных гранулоцитах она выражена очень слабо и т. d.