El estudio de la hemostasia-vascular de plaquetas
Violaciónes a este nivel de la hemostasia pueden ocurrir con una tendencia a la hemorragia o trombosis, dependiendo de qué métodos de investigación seleccionados. Además, Todos los métodos de investigación de plaquetas Hemostasia divide en primaria y secundaria, Pruebas o segunda fila, que se aplican sólo en el caso, si utilizando pruebas revelaron ningún violaciónes. El principal (bazïsnım) Las siguientes son las pruebas.
Las muestras para la resistencia (fragilidad) capilares - manguito, Tarro, angiorezistometriya
A partir de estas pruebas, el más accesible y sin embargo suficientemente informativo Muestra Konchalovsky-Sierpe-LEED.
La estimación se realiza en el número y el tamaño de la hemorragia, formado en la parte superior de la superficie palmar del antebrazo (en un círculo con un diámetro 5 cm) Después de 5 minutos de la compresión en un hombro manguito de presión 12-13,3 kPa (90-100 MmHg. Art.). Los resultados se tienen en cuenta a través de 5 min después de la eliminación del manguito. Número petequias más 10 apunta al aumento de la fragilidad de microvasos, que a menudo se asocia con trombocitopenia o plaquetas función violación angiotroficheskoy. También tiene en cuenta la incidencia de la hemorragia, y justo debajo del cuello.
Muestra Banochnaya se lleva a cabo en la misma zona de la piel en la construcción de capas en la presión negativa - de 20 kPa (150 mm Hg. Art.) e inferior. Al evaluar la petequias resultados contado, aparecido en Bancos.
Las muestras sobre la duración y la magnitud de la hemorragia capilar
En la clásica Juicio Duque lóbulo inferior del rodillo después de un calentamiento luz la perforó a una profundidad de 3,5 a 4 mm. El sangrado en este estudio normalmente no exceda 4 m, una gota de sangre en papel de filtro son relativamente bajos y empezar a disminuir rápidamente desde aproximadamente 1 a 1,5 minutos después de la punción. Cuando se expresa trombocitopenia (Menos 20 Estaño 1 l) disfunción plaquetaria y tiempo de hemorragia grave aumentó a 20-40 minutos, manchas de sangre son mucho más grandes, y el largo plazo disminución o disminuyen las olas, luego aumentar de nuevo. Muestra de Duke no son lo suficientemente sensibles, en 2/3 Los pacientes con trombocitopatías da resultados normales.
Las pruebas más sensibles, en el que el tiempo de sangrado se investiga en el fondo de una estasis venosa creado artificialmente, para los que el hombro se superpone sobre el aparato manguito para medir la presión arterial y para el estudio apoya la presión, igual 5,3 kPa (40 mm Hg. Art.). En el contexto de tales estasis en Borchgrevink muestra-Vaaler en la superficie palmar de la tercera parte superior de la lanceta antebrazo aplicado profundidad incisión transversal 1 mm y una longitud de 8-10 mm (la tasa de tiempo de sangrado - hasta 10 m), y degustar Ivey et al. lo mismo se aplica a la lanceta antebrazo para extraer la sangre de una punción del dedo tres profundidad transversal 3 mm (la tasa de tiempo de sangrado - hasta 7 m).
En el contexto de la misma estasis venosa realizado Un estudio sobre. DE. Shitikova, por lo que en falanges terminales aplicaron pinchazo profundidad 3 mm, a continuación, la punta del dedo sumergido en una taza 5 ml de solución isotónica de cloruro sódico y el tiempo de sangrado contado con luz transmitida (Si la solución está intensamente manchada de sangre, el seguimiento de la dedo se mueve a una taza diferente). La cantidad de sangre perdida es determinado por el aumento en el volumen de líquido en las copas (la tasa de tiempo de sangrado - hasta 4 m, el volumen de sangre perdido - a partir de 0,01 a 0,4 ml).
En la prueba en T. N. Shushkevich volumen de sangre perdida es determinado por el color de amoníaco (0,04 %) , que están inmersos papel con manchas de sangre, por colorimetría en el colorímetro médica.
Indicaciones pruebas para la duración del sangrado, Anormal, evidencia de abuso expresó hemostasia plaquetas vascular, Sin embargo, en virtud de los resultados normales de estas muestras no excluye trombocitopatía expresado leve.
Contar el número de plaquetas en la sangre
Contar el número de plaquetas en la sangre (en una cámara de recuento bajo contraste de fase Goryaeva o tinte, o con la ayuda de contadores de partículas) - La manera más importante para el diagnóstico de trombocitopenia y trombocitopatía, proceder con disminución continua o intermitente en la cantidad de estas células (anomalía Bernard-Soulier, Meia Hegglina y otros.).
Contar el número de plaquetas también sugiere, si es posible llevar a cabo sus investigaciones más funcional y de qué manera se debe hacer (con plaquetas de preconcentración o sin, fotométricamente o microscópicamente, y así sucesivamente. d.).
El estudio del tamaño de las plaquetas en los frotis de sangre – trombotsitometriya
El estudio del tamaño de las plaquetas en los frotis de sangre (trombotsitometriya) Te permite hacer un juicio preliminar sobre las diversas poblaciones de células en la sangre de la prueba y obtener información sobre una serie de anomalías, así como la saturación de los gránulos de plaquetas.
En algunos trombocitopatía (Síndrome de Wiskott-Aldrich) Las plaquetas son dominadas por muy pequeña (a 2 micrones de diámetro), mientras que otros - formas gigantes (anomalía Bernard-Soulier, Meia Hegglina) - A 8 mo más. En un número de estas células son pobres gránulos trombocitopatía (cm. abajo), mientras que otros - violado la centralización de los gránulos de las plaquetas en la difusión en el cristal, que constituye una violación de la reacción y la liberación de gránulos que contienen sustancias, necesarias para la aplicación de la hemostasia. Todas estas propiedades, y la capacidad de las plaquetas a la difusión y los procesos de formación, evaluación de la estructura de estas células puede ser estudiada mediante microscopía convencional y electrónica de barrido, y por la interferencia de la óptica Nomarski.
La retracción de un coágulo de sangre violado regularmente con trombocitopenia grave (T en menos de 30-40 1 l) y en algunas formas de inferioridad cualitativa de las plaquetas, a menudo - con Glanzmann trombotsitoastenii, trombocitopatía urémico etc..
Investigación adhesivamente-agregación de las plaquetas (AAFT)
Investigación adhesivamente-agregación de las plaquetas (AAFT) - El elemento más importante de diagnóstico de laboratorio de la mayoría trombocitopatía. Actualmente, una serie de métodos de investigación fácilmente implementables y accesibles al público, incluyendo visual, microscópica y hardware (agregometría, microfiltros y otros.) registro para aproximar esta función se puede asignar el siguiente procedimiento.
Métodos de conservación de las plaquetas en el cristal (o filtros)
Los recuentos de plaquetas se realizaron en la sangre venosa antes y después de pasarlo a la norma de velocidad a través de la columna con perlas de vidrio o el cable flexible de fibra de vidrio; pérdida de plaquetas de la sangre son juzgados en grado de adhesividad.
Más disponible, aunque algo menos preciso, método para determinar el número de trombocitos en la sangre antes y después del contacto con él dentro de un cierto período con la superficie interior del matraz, que gira a una velocidad determinada. Un método más preciso para determinar los filtros Millipore de retardo de plaquetas (diámetro de poro - 15-20 micras). En estas pruebas, la evaluación puede llevarse a cabo desde el aumento en el gradiente de presión aguas arriba y aguas abajo del filtro (poros obstruidos y agregados de plaquetas conduce a un aumento de este índice).
Métodos para el estudio de la agregación de plaquetas
Prueba Hemolizado-agregación basado en el hemolizado capacidad lavada eritrocitos, investigado en la cría 10-2 y 10-6, mientras se agita para causar la agregación en su propio plasma, ganado un gran número de plaquetas (proporción de volumen de plasma citrato y hemolizado - 1,0:0,2). Teniendo en cuenta el tiempo de ocurrencia de agregación (la velocidad a la alta concentración con hemolizado-11-17, bajo - 40-54 con) y su severidad. La dinámica del proceso y su intensidad se puede estimar como fotométrica (Colorímetro Médico, filtro verde, agitación) y cualquier agregografe diseño.
Cuando el proceso de registro gráfico utilizando una alta dilución hemolizado (10-6) Proporciona una agregatogrammu de dos ondas, en el que la segunda ola asociada con la liberación de los estimulantes de la agregación plaquetaria endógenos - ADP, catecolaminas, tromboxano, etc.. Esta segunda onda se caracteriza por la reacción de liberación, no se observa en ausencia de gránulos densos de las plaquetas (enfermedad agrupación de almacenamiento) o en violación de las reacciones liberar (aspirina como el síndrome y otros.).
Prueba Hemolizado-agregación está disponible para llevar a cabo en cualquier laboratorio, No requiere de reactivos especiales.
Determinación micrométodo Visual de la agregación plaquetaria
Su esencia radica en el hecho, la obtenida bajo silikonirovaniya sangre venosa doble capacidad estabilizada 3,8 % citrato de sodio (proporción 2,4:0,6 ml), se centrifuga 6 en minutos 100 v / / min, y el plasma rico en plaquetas resultante se aplica por 0,02 ml en portaobjetos de vidrio y se trata con el mismo volumen de agentes de agregación - ADP, La trombina, Colágeno, noradrenalina o ristomycin. Las concentraciones finales de agentes de agregación en el estudio deben ser de plasma:
- ADF 0,5*10-4 mmol / l;
- noradrenalina - 0,015%;
- trombina - 0,125 U / ml (la concentración de colágeno se selecciona empíricamente).
Tal vez la prueba como menor, y concentraciones más altas de agentes de agregación. La selección de la concentración puede variar dependiendo de la actividad de la producción desigual de diversas preparaciones y diversas actividad de las muestras, en relación con el cual comprobar la validez de ajustarse a la concentración de cada agente en plasma normal.
Una mezcla de plasma agente de agregación rico en plaquetas se mezcla oscilando la diapositiva, sobre un fondo oscuro con una lupa registrado el momento de la aparición de unidades como una "tormenta de nieve". Al evaluar los resultados de número de plaquetas en el plasma contados. Así, ADP-tiempo agregación, aumenta 27 a 37 segundos a 400 Estaño 1 l plaquetas a 62-75 segundos a 50 Estaño 1 l, y trombina-agregación - respectivamente, a 40-52 79- 106 de.
La agregación de registro gráfico
Registro gráfico de la agregación bajo la influencia de los mismos agentes de agregación - método altamente informativa de los estudios de plaquetas funcionales. Realizado en o agregografah.
Cuando los gráficos regístrate determinar no sólo la aparición de agregación, pero su intensidad (mayor curva de desviación y el área agregatogrammy), la primera y la segunda ola de la agregación - al utilizar bajas concentraciones de epinefrina y ADP (En él se describe la reacción de la segunda ola de la liberación), y el desglose patológica.
La agregación plaquetaria estudio visual o gráfica bajo la influencia ristomycin
Muy importante es la agregación visual o gráfico estudio de plaquetas bajo la influencia ristomycin. Viola este tipo de agregación (ristomycin concentración final de 0,8-1,0 mg / ml) a la una de la diátesis hemorrágica más común - angiohemophilia (la enfermedad de von Willebrand), así como anormalidades de las plaquetas Bernard-Soulier y adquirido ciertos tipos de inhibición de la síntesis del factor de von Willebrand (uremia, inhibición inmune, y por lo tanto. d.).
La determinación cuantitativa del factor de von Willebrand en el plasma sanguíneo
La determinación cuantitativa del factor de von Willebrand en el plasma sanguíneo se realiza en ristomycin aglutinación suspensión formalinizada de plaquetas normales en varias diluciones de la bestrombotsitarnoy plasma de prueba.
El método es importante tanto para el diagnóstico y la inhibición de la síntesis angiogemofnlii secundario de este factor, y para la evaluación de la gravedad de endotelial (vasculitis, aterosclerosis y otros.) y las tendencias a la trombosis, en la que el contenido de factor de von Willebrand en la sangre aumenta a menudo significativamente.
El nivel de factor de von Willebrand Se indica la capacidad del endotelio de sintetizarla (reducidos cuando aigiogemofilii) y la extensión de la derrota de la vasculitis endotelio, aterosclerosis y otras enfermedades, proceder con la derrota de la capa interna de los vasos sanguíneos.
Para plaquetas normales fijas en plasma rico en plaquetas de los individuos sanos se añaden secuencialmente 0,2 % EDTA (0,5 ml 5 ml de plasma) y por 2 min - solución de fijación (20 ml 40 % formalina 1000 ml de tampón de fosfato 0,2 g EDTA, pH 6,4).
La mezcla se mantuvo a 4 ° C durante al menos 1 no, después de lo cual se sometió a centrifugación, se eliminó el sobrenadante, y sedimento de plaquetas se lavó la solución dos veces la suspensión de (Un volumen 3,8 % citrato de sodio, y cinco volúmenes de solución de cloruro sódico isotónica; pH se ajusta a 7,4). La suspensión preparada de plaquetas normales llena en formalinizado 1 ml y se almacenó a -20 ° C. La curva de calibración se construye utilizando diluciones de plasma normal bestrombotsitarnoy, especímenes que son plaquetas formalinizados mixtos. Además, la mezcla se determina ristomycin aglutinación. Curva de calibración se determina por la cantidad de factor de von Willebrand en el plasma de prueba. Plaquetas fijadas se conservan mejor cuando se añade en una pequeña cantidad de solución conservante de azida de sodio.
Pruebas, reflejando la agregación espontánea de las plaquetas
En un estudio de pacientes con tromboembolismo venoso o aumento de la tendencia a la trombosis e isquemia de las técnicas básicas incluyen pruebas, reflejando la agregación espontánea de las plaquetas, t. es. que ocurren en la sangre entera o plasma sin la adición de agentes de agregación.
Para identificar este fenómeno con el frotis de sangre llama la atención a la relación entre el número de plaquetas se extiende por separado y sus agregados, 3-5 compone de plaquetas y más. Este fenómeno se revela mejor cuando se ve lodos, por una amplia tseitrifu- dopaje plasma rico en plaquetas (20Minutos a -30 6000 / Min), estabilizado por citrato o EDTA solución de citrato. Sin embargo, los resultados más estables proporcionan los siguientes métodos para determinar la agregación espontánea.
Метод Wu-Hoak
Método de Wu-Hoak basado en el, la sangre de una vena escrito en dos tubos de ensayo, en una solución que contiene EDTA, y en la otra - una mezcla de la misma solución con EDTA 4 % solución de formalina. Después de mezclar el contenido de los viales se asienta 30 min a temperatura ambiente.
Durante los agregados de sedimentación asientan, y las plaquetas individuales permanecen en el sobrenadante. Después de los recuentos de pie el número de plaquetas en el sobrenadante en cada uno de los tubos. Normalmente, la diferencia en la cantidad de plaquetas en el contenido de ambos viales no exceda de 10-15 %, en agregación espontánea elevada, aumenta.
Método H. Y. Tarasovoj
De acuerdo con el método de H. Y. Tarasovoj (1984) disminución de las plaquetas de la sangre entera en los agregados con citrato contados después de 3 minutos de agitación en un agitador su AVC-1 a una velocidad de 90-100 veces 1 m.
El tubo que contiene el 0,5 ml de sangre, sido sometida a agitación, introducido 1 ml 1 % solución de formalina en solución de cloruro de sodio isotónica. El segundo tubo no se somete al control agitando, y la sangre contenida en él a través de la misma prueba 3 Ming también introdujo una solución de formalina.
Sangre en ambos tubos aboga 30 m, después de lo cual el sobrenadante se cuenta en el número de plaquetas. Normalmente, la diferencia en las plaquetas no recuentos superior 20 %, a una elevada tendencia a la agregación, aumenta.
En caso de violaciónes en la aplicación de pruebas básicas, caracterización de la hemostasia plaquetas, operar en la medida necesaria para llevar a cabo estudios adicionales. De éstas, la más importante, son los siguientes.
Los estudios adicionales para determinar la hemostasia plaquetas
Estudiar el número de megacariocitos en la médula ósea y mielograma trepanate con el estudio de la morfología de estas células
Un aumento significativo en el número de megacariocitos en secciones de médula ósea, generalmente se combina con una más o menos marcado aumento en el número de plaquetas en la sangre, observado en eritremii, hemorrágica y trombocitosis esencial y otras enfermedades mieloproliferativas. Megakariotsitoz Moderado, combinado con trombocitopenia, característico de la púrpura trombocitopénica (púrpura trombocitopénica idiopática).
Cuando aplasia e hipoplasia de la médula ósea de cualquier origen disminuyeron a medida que el contenido de megacariocitos en secciones de médula ósea, y el recuento de plaquetas en sangre periférica.
Parcial amegakariotsitoz observado deficiencia trombotsitopoetina (una forma rara de trombocitopenia congénita), la aparición de anticuerpos en la sangre antimegakariotsitarnyh, aplasia parcial esencial de megacariocitos (puede preceder el desarrollo de la leucemia).
Los cambios morfológicos y citoquímicas observados en muchos megacariocitos trombocitopatía.
Estudio microscópico de electrones de la ultraestructura de las plaquetas
Estudio microscópico de electrones de la ultraestructura de las plaquetas es importante para el diagnóstico de varios trombocitopatía, en el que falta o reducido en gran medida la cantidad de gránulos que no son proteínas de alta densidad óptica (contiene ADP, La serotonina, catecolaminas, calcio y otros.), o proteína α-gránulos, lo cual es típico para un número de trombocitopatía, unidos en un grupo de enfermedades de la agrupación de almacenamiento, la ausencia de enfermedad o gránulos.
También puede detectar defectos en el aparato contráctil (sistema de microtúbulos) lisosomas y plaquetas.
Cuando microscopía electrónica de barrido y el estudio de las plaquetas por la interferencia de la óptica Nomarski se puede detectar defectos en la fijación de las plaquetas en la superficie exterior, su su difusión, brotación, secreción de centralización y gránulo, que es típico para muchos tipos trombocitopatía.
Determinación de anticuerpos antiplaquetarios por immunoflyuorestsent- estudios ción en inmunoglobulina suspensión de plaquetas, asociado con estas células – Método de Dixon
Este método permite diferenciar complejo trombocitopenia inmune y no inmune.
Sin embargo, las formas más pronunciadas de la enfermedad con una trombocitopenia aguda es inaceptable, para la definición de la inmunoglobulina relacionada requiere una suficientemente grande (40-50 T en 1 l) recuento de plaquetas.
Definición de plaquetas autólogas vida marcado
Definición de plaquetas autólogas trombocitopenia vida marcada permite distinguir entre una vida normal de plaquetas en la circulación (acerca de 9 Noches) y las formas de la enfermedad con un corto tiempo de vida de estas células.
El primero es más comúnmente asociado con la producción de plaquetas disminuido en la médula ósea, segundo - con su muerte acelerada, o con el efecto de los anticuerpos antiplaquetarios (trombocitopenia autoinmune plaquetas curso de la vida se reduce a unas pocas horas), o disminución intensiva de las células en los agregados y trombos en la coagulación intravascular diseminada o trombosis masiva (consumo de trombocitopenia).
La determinación cuantitativa del contenido en el plasma en sangre antes y después de los factores de agregación de plaquetas
La determinación cuantitativa del contenido en el plasma sanguíneo antes y después del número de agregación de plaquetas de factores - el factor de fosfolípido de membrana 3, contenido de α-gránulos (factor de antigeparinovogo 4, b-тромбоглобулина, factor plaquetario mitogénica) y gránulos no proteicos densidad óptica alta de electrones (La serotonina, catecolaminas, ADF), y hidrolasas ácidas.
Estos estudios dan una idea del contenido de las plaquetas de estructuras y componentes adecuados, su liberación en el plasma durante la agregación, así como vnutriso- activación de las plaquetas sudistoy, acompañado por la liberación de las plaquetas en el plasma sanguíneo con el aumento de concentraciones de los componentes en los últimos densos y α-gránulos (factor de antigeparinovogo 4, b-тромбоглобулина и др.).
Métodos de investigación cuantitativa de factores plaquetarios son importantes para la identificación de un número de trombocitopatía (Trastornos gránulos de preservación y sus componentes, paresia de la reacción de la liberación de estos componentes, aumento en el contenido de plasma sanguíneo debido a la intensa dentro de- adhesión vascular y la agregación de plaquetas y otros.). Varios trombotsitopaty caracteriza disminución contenido de plaquetas en el factor de membranas 3 cualquier incumplimiento de su disponibilidad para participar en la coagulación de la sangre.
Estudio de las características bioquímicas de las plaquetas y sus estructuras individuales
Estudio de las características bioquímicas de las plaquetas y sus estructuras individuales - el estroma, gránulos, mitocondrias y t. d. permitir a documentar la conexión de diferentes tipos de patología y la disfunción de las plaquetas con ciertos tipos de deficiencia de la enzima (La deficiencia de la COX, tromboxano etc.), en violación de la estructura de las lipoproteínas de membrana, necesarios para comunicarse con los agentes de agregación, Y t. d.
Estudios similares se disponible sólo bien equipados laboratorios de investigación y, por tanto, no se aplican la práctica general.
