Anæmi, på grund af mangel på aktivitet af glucose-6-phosphat-dehydrogenase

Aktivitet underskud glukozo-6-fosfatdegidrogenaza (G-6-PD) er den mest almindelige arvelige abnormitet af røde blodlegemer, forårsage hæmolytisk pusling_2008, forbundet med købet af en række lægemidler midler. Uden for kriser oplever de fleste patienter en tilstand af fuldstændig kompensation, skønt individer har vedvarende hæmolytisk anæmi.

Den første beskrivelse af manglen på G-6-PD-aktivitet blev lavet i 1956 g. i personer, tager antimalariamidlet primaquin til profylakse. Uafhængigt af disse undersøgelser i 1957 g. En mangel på G-6-PD blev fundet i patientens erytrocytter, der periodisk havde hæmolytiske kriser uden at tage medicin.

Aktuelt beskrevet mere 250 forskellige mutante former for G-6-PD. De adskiller sig fra hinanden i enzymets elektroforetiske mobilitet., dets affinitet for substrater - glucose-6-phosphat og nicotinamid-adenindinukleotidphosphat (НАДф) En konsekvens af den reducerede affinitet er utilstrækkelig enzymaktivitet under betingelser, når koncentrationen af ​​substrater strengt er begrænset af hastigheden for deres dannelse i de tidligere reaktioner. Manglende aktivitet betyder i de fleste tilfælde ikke tabet af enzymet som sådan, skønt sådanne tilfælde også kan observeres. Oftest er fraværet eller faldet i enzymets aktivitet resultatet af dets tilstedeværelse i patienten i en patologisk inaktiv form.

Strukturelt gen og genregulator, forårsager syntesen af ​​G-6-PD, placeret på X-kromosomet, derfor er arvingen af ​​en mangel i aktiviteten af ​​dette enzym i erytrocytter altid knyttet til X-kromosomet.

Der er to hovedmutante former, hvor aminosyresubstitutioner ikke vedrører aktive steder, og derfor er begge disse udbredte mutationer normale. De adskiller sig fra hinanden i elektroforetisk mobilitet., deres affinitet for substratet er imidlertid den samme. I henhold til den moderne nomenklatur, en af ​​disse former, almindelig i Europa, kaldet BB-form, og den anden, observeret i Afrika - form A. Andre mutante former er i øjeblikket beskrevet, som heller ikke adskiller sig fra hinanden med hensyn til kinematiske indikatorer, men har forskellig elektroforetisk mobilitet.

Indviklingen af ​​enzymet med køn giver en betydelig overvægt hos mænd blandt personer med kliniske manifestationer af patologi.. Det forekommer hos homozygote mænd, arvede denne patologi fra moderen med sit X-kromosom, hos homozygote kvinder (har arvet sygdommen fra begge forældre) og hos nogle heterozygote kvinder, arvede sygdommen fra en af ​​forældrene med en udtalt mutant fænotype.

Den mest almindelige mangel på G-6-PD-aktivitet forekommer i europæiske lande, beliggende ved Middelhavskysten, Grækenland, Italien, og også i nogle lande i Latinamerika, Afrika og andre.

Måske, at en ekstremt høj ophobning af et unormalt gen i en række bosættelser letter ved den bevarede skik med familieægteskaber, hvilket fører til ophobning i befolkningen af ​​homozygote kvinder, giver oftere alvorlige kliniske manifestationer af sygdommen, end heterozygote bærere, og øge sandsynligheden for at have homozygote mænd, og også udbredt tidligere i disse steder af tropisk malaria.

Ifølge den eksisterende hypotese, person, mangelfuld i G-6-PD, tolererer tropisk malaria lettere og er mindre tilbøjelige til at dø af denne sygdom. Denne hypotese understøttes af den kendsgerning, at parasitten er ulige fordelt blandt erytrocytterne hos en heterozygot kvinde.. Det blev fundet, at normale celler indeholder meget mere parasit, end i knappe. Der er to hypotetiske forklaringer på denne kendsgerning.. Den første af disse: erytrocyt med G-6-PD-mangel er ude af stand til at modstå parasitens virkninger og opløses straks i systemet med fagocytiske makrofager, hvor Plasmodium dør. Et andet synspunkt antyder behovet for udvikling af parasitreduceret glutathion, hvis mængde falder i erytrocytter med en mangel på G-6-PD.

Ætiologi og patogenese

Den første fase af lægemiddeleksponering er dens transformation i kroppen, overgang til aktiv form, som kan forårsage ændringer i strukturen af ​​erytrocytmembranen. Den aktive form for lægemidler interagerer med oxyhemoglobin. Dette producerer en vis mængde hydrogenperoxid..

Reduceret glutathion ved hjælp af peroxidasesystemet neutraliserer noget af peroxidet, reduceret glutathion oxideres under reaktionen.

Hos raske mennesker udvikles en akut hæmolytisk krise med introduktionen af ​​en betydelig mængde af lægemidlet (giftig dosis). Derefter kan der opstå en krise, når glutathionreduktionssystemer ikke er i stand til at klare overskuddet af dannede komplekser og oxideret glutathion. Med en mangel på glucose-6-phosphatdehydrogenase-aktivitet og nedsat NADP-reduktion, på trods af normal glutathionreduktaseaktivitet, dens restaurering er forstyrret, da der ikke er nogen normal kilde til brint. Reduceret glutathion kan ikke modstå de oxidative virkninger af konventionelle medicinske doser. Dette fører til oxidation af hæmoglobin, tab af hæm fra hæmoglobinmolekylet, nedbør af globinkæder. Milten frigør erytrocytter fra Heinzs kroppe. Samtidig går en del af erytrocytoverfladen tabt., hvilket fører til deres død.

I patogenesen af ​​hæmolytisk anæmi, relateret til at spise hestebønner, stadig meget uklart. Primachin anæmi (fascisme) udvikler sig kun hos nogle individer med en mangel på G-6-PD-aktivitet. Sandsynligvis, manifestationen af ​​denne anæmi kræver en kombination af to enzymatiske defekter. Måske, at vi taler om utilstrækkelig neutralisering af et giftigt stof hos nogle personer, findes i hestebønner, eller om dannelsen af ​​en eller anden form for metabolit, forårsager forstyrrelser i sulfhydrylgrupper af erytrocytter. Hos raske personer forårsager små mængder hestebønner ikke alvorlig hæmolytisk anæmi., da erythrocytter i nærvær af reduceret glutathion er i stand til at modvirke den toksiske virkning af metabolitten. Arven af ​​denne mangel, tilsyneladende, autosomal dominerende. Med en kombination af en usædvanlig transformation i kroppen af ​​et giftigt stof, findes i hestebønner, med en mangel på G-6-PD-aktivitet, vises kliniske tegn på primaquin-anæmi.

Kliniske manifestationer

WHO-eksperter opdeler G-6-PD-varianter i fire klasser i henhold til kliniske manifestationer hos homozygote patienter og aktivitetsniveauet i erytrocytter..

Første klasse - muligheder, som er ledsaget af kronisk hæmolytisk anæmi.

Anden klasse - varianter med niveauet af G-6-PD-aktivitet i erytrocytter 0— 10 % fra normen, transport, der forårsager fravær af hæmolytisk anæmi uden for krisen, og kriser, relateret til at tage medicin eller spise hestebønner.

Tredje klasse - varianter med et aktivitetsniveau i erytrocytter på 10-60 % fra normen, hvor milde kliniske manifestationer kan observeres, medicin-relateret.

Fjerde klasse - indstillinger med et normalt eller tæt på normalt aktivitetsniveau, ikke ledsaget af klinisk patologi.

Hæmolytisk anæmi observeres ved fødslen, behandler som den første, såvel som til anden klasse af G-6-PD-mangel.

Niveauet af G-6-PD-aktivitet i erytrocytter korrelerer ikke altid med sværhedsgraden af ​​kliniske manifestationer.. I mange muligheder i første klasse, 20-30 % enzymaktivitetsniveau. På den anden side, på nul aktivitetsniveau har nogle patienter ingen kliniske symptomer. Det er relateret, Først, med egenskaberne af lutante enzymer, for det andet, efter al sandsynlighed, med en neutraliseringshastighed af lægemidler ved hjælp af det cytokrome apparat i patientens lever.

Oftest giver manglen på G-6-PD-aktivitet ikke kliniske manifestationer uden særlig provokation af en hæmolytisk krise.. I de fleste tilfælde begynder den hæmolytiske krise efter indtagelse af sulfa-lægemidler (norsulfazol, streptocid, sulfadimethoxin, sulfacylnatrium, etazol, biseptola), lægemidler mod malaria (primachina, xinina, acridin), nitrofuranpræparater (furazolidona, furadonina, furagina, 5-NOK, nevigramona), isonicotinsyrepræparater (tubazid, ftivazide), PASK-natrium, såvel som nitroglycerin.

Fra malaria-lægemidler med mangel på G-6-PD-aktivitet kan delagil ordineres, fra sulfa - phthalazol. Et antal stoffer, forårsager hæmolytiske kriser i høje doser, i små doser kan anvendes i tilfælde af mangel på G-6-PD-aktivitet. Disse inkluderer acetylsalicylsyre, amidopirin, phenacitin, levomicetin, Streptomycin, antidiabetiske sulfa-lægemidler.

Al medicin, i stand til at forårsage hæmolytiske kriser, katalysere oxidativ denaturering af hæmoglobin med molekylært ilt.

Kliniske manifestationer af sygdommen kan forekomme på den anden eller tredje dag fra starten af ​​medicinindtagelsen. Oprindeligt vises svag gulhed af scleraen., mørk urin. Når du holder op med at tage stoffet i denne periode, udvikler der sig ikke en alvorlig hæmolytisk krise. Hvis behandlingen fortsætter, den 4. - 5. dag kan en hæmolytisk krise opstå med frigivelse af sort eller undertiden brun urin, som er forbundet med intravaskulær nedbrydning af erythrocytter. Hæmoglobinindholdet kan falde med 2-3 %.

I alvorlige tilfælde stiger kropstemperaturen, en skarp hovedpine vises, smerter i lemmer, opkastning, nogle gange diarré. Åndenød opstår, blodtryk falder. Milten forstørres ofte, nogle gange lever.

I sjældne tilfælde udvikler nyresvigt, forbundet med et kraftigt fald i nyrefiltrering og blokering af nyretubuli ved blodpropper.

Laboratorieresultater

En blodprøve afslører anæmi med en stigning i antallet af reticulocytter. Der er en stigning i antallet af leukocytter med et skift til myelocytter. Hos nogle patienter,, især hos børn, antallet af leukocytter kan undertiden stige til et betydeligt antal (100 T i 1 l og mere). Blodpladeantallet ændres ikke. Når erythrocytter farves med krystalviolet under svære hæmolytiske kriser, findes et stort antal Heinz-kroppe.

En skarp irritation af den røde spire i knoglemarven afsløres. Øge indholdet af frit hæmoglobin Serum, ofte forhøjede niveauer af bilirubin grund indirekte. Med benzidin prøve afslørede tilstedeværelsen af ​​hæmoglobin i urinen uden røde blodlegemer, undertiden findes hæmosiderin.

I nogle former af mangel på glucose-6-phosphat dehydrogenase hæmolyse observeret tilbageholdenhed, t. Det er. hæmolytiske krise pauser, trods, at patienten fortsætter med at tage stoffet, der forårsagede hæmolytisk krise. Evnen til selvbegrænsende hæmolyse skyldes en næsten normal stigning i niveauet af enzymaktivitet i reticulocytter.. I de fleste former er det markant reduceret.

Hos børn er alvorlige hæmolytiske kriser mere almindelige, end hos voksne. Med en udtalt mangel på G-6-PD-aktivitet vises de undertiden umiddelbart efter fødslen. Det er hæmolytisk sygdom hos den nyfødte, ikke relateret til immunologisk konflikt. Det kan være lige så hårdt, som hæmolytisk anæmi, på grund af Rh-uforenelighed mellem mor og foster. Kernegulsot med svære neurologiske symptomer er mulig.

Patogenesen af ​​disse kriser forstås ikke godt.. Ikke klart endnu, om disse kriser opstår spontant på grund af fysiologisk mangel på aktiviteten af ​​enzymet glutathionperoxidase ved fødslen, eller er de forårsaget af brugen af ​​visse antiseptika ved behandling af babyens navlestreng. Måske, at nogle gange kriser er forbundet med moderens indtagelse af visse lægemidler.

I nogle tilfælde hæmolytiske kriser med mangel på G-6-PD-aktivitet forekommer på baggrund af infektiøse sygdomme: Influenza, salmonellose, viral hepatitis. Kriser kan også udløses af acidose ved diabetes mellitus eller nyresvigt.

En lille andel af patienter med mangel på G-6-PD-aktivitet har vedvarende hæmolytisk anæmi, forbundet med at tage stoffer. I disse tilfælde er der en let stigning i milten., moderat normokrom anæmi med øget antal retikulocytter, erythrokaryocytter i knoglemarv og bilirubinniveauer. Forværring af sygdommen er mulig enten efter indtagelse af ovennævnte medicin, enten på baggrund af infektioner.

Diagnostik

Grundlaget for diagnosen af ​​denne mangel med enzymet erythrocytter er bestemmelsen af ​​G-6-PD-aktiviteten i proband og hans slægtninge.. Fra kvalitative metoder, bruges til dette formål, de to enkleste metoder bør anbefales.

Metode Bernstein gør det muligt ikke kun at diagnosticere manglen på G-6-PD-aktivitet hos alle hemizygote mænd, homozygote kvinder, men estimerer også omtrent graden af ​​mangel på dette enzym hos heterozygote kvinder. Denne metode formår at identificere omkring 50 % heterozygote kvinder. Fordelen ved denne metode er dens egnethed til brug i masseundersøgelser af befolkningen under ekspeditionsforhold..

Metoden er baseret på misfarvning af farvestoffet 2,6-dichlorphenolindophenol og under dets reduktion. I nærværelse af G-6-PD oxideres glucose-6-phosphat, og NADP reduceres til dannelse af NADP-H. Dette stof reducerer phenazinmetasulfat, hvilket igen reducerer 2,6-dichlorphenolindophenol. Phenazin metasulfat virker i denne reaktion som en meget aktiv elektronbærer fra NADPH til farvestoffet.. Reaktionen tager adskillige timer uden phenazinmetasulfat., og i nærværelse af phenazinmetasulfat forekommer misfarvning i 15 - 30 m.

Reagenser.

1. NADP-løsning: 23 mg NADP opløses i 10 ml vand.
2. Glukose-6-fosfatopløsning (G-6-F): 152 mg natriumsalt af glucose-6-phosphat opløses i 10 ml vand. Bariumsalt af glucose-6-fosfat skal først omdannes til natriumsalt. For dette vejer de 265 mg bariumsalt af glucose-6-phosphat, opløst i 5 ml vand, tilføje 0,5 ml 0,01 M saltsyreopløsning og 1 mg tørt natriumsulfat. Bundfaldet centrifugeres. Supernatanten neutraliseres 0,01 M natriumhydroxidopløsning og fortyndet med destilleret vand til 10 ml.
3. Phenazin metasulfatopløsning: 2 mg phenazinmetasulfat opløses i 100 ml Tris-buffer 0,74 M; pH 8,0.
4. Farveopløsning 2,6-dichlorphenolindophenol (natriumsalt): 14,5 mg af farvestoffet opløses i 100 ml tris-saltsyre-bufferopløsning (0,74 M; pH 8,0). Pufferopløsningen fremstilles ud fra 1,48 M opløsning af tris-hydroxymethylaminomethan (42,27 d af 250 ml vand) og 1,43 M opløsning af saltsyre (2 fixanale ampuller, indeholder 0,1 g-ækv, bringe vand til 135 ml). K 230 ml tris-hydroxymethylaminometal opløsning tilsættes 110 ml saltsyre, juster pH til 8,0 og tilsæt vand til 460 ml.

Forbered en blanding af reagenser inden brug.: 1 ingen. opløsning af NADP (1), 1 ingen. opløsning G-6-F (2), 2 ingen. phenazin metasulfat opløsning (3) og 16 ingen. 2,6-dichlorphenolinodophenolopløsning (4).

Metode.

I et reagensglas, indeholder 1 ml destilleret vand, bidrage 0,02 ml blod.

Efter begyndelsen af ​​hæmolyse, tilføj 0,5 ml reagensblanding. Resultaterne tages i betragtning gennem 30 m. Reaktionen betragtes som normal, når farvestoffet er fuldstændig misfarvet.. Hvor, når der ikke er misfarvning af farvestoffet (der forbliver en intens blågrøn I-farve), reaktionen vurderes som skarpt positiv. Hvis farveintensiteten falder, men den blågrønne forbliver, reaktionen betragtes som positiv. Hvor, når tydelig misfarvning opstår, men når man sammenligner med kontrollen, forbliver en grønlig farvetone, reaktionen betragtes som plus eller minus.

Stærke og positive reaktioner observeret hos hemizygote mænd og homozygote kvinder. Nogle gange tester heterozygote kvinder positive, men oftere plus eller minus. Udover, en plus-minus reaktion observeres undertiden hos perfekt raske mennesker med et let fald i enzymets aktivitet på baggrund af en sygdom eller tager medicin. Der skal tages højde for plus-minus-reaktioner, og enzymaktiviteten bør kun kontrolleres kvantitativt, hvis en kvinde mistænkes for at have hæmolytisk anæmi, på grund af en mangel på aktiviteten af ​​glucose-6-phosphatdehydrogenase. Tag ikke højde for plus- eller minusreaktionerne i masseundersøgelsen.

Falsk positiv reaktion kan være hos mennesker med svær anæmi pga, hvad 0,02 ml blod, indført i reagensglas, indeholder en lille mængde røde blodlegemer og, Derfor, en lille mængde enzym. I dette tilfælde skal der tilsættes to eller tre pipetter til reagensglasset med destilleret vand. (ved 0,02 ml) blod, således at farven på disse rør inden tilsætningen af ​​farvestoffet ikke adskiller sig fra kontrollen.

Fluorescerende pletmetode Beutler и Mitchell baseret på den specifikke fluorescens af reduceret NADP i ultraviolet lys med lang bølgelængde (440- 470 nm), vurderes visuelt i en fast tidsramme.

Reagenser.

1. Tris-HCl-buffer 0,5 M; pH 8,0: 60,55 tris opløses i 800 ml destilleret vand, tilføje 20 ml koncentreret HCI, juster pH til 8,0 via 2 M HCl-opløsning og tilsæt vand til 1 ml; opløsningen opbevares indtil 36 dage ved en temperatur på 4 ° С.
2. Glukose-6-fosfatopløsning 20 M: 6 mg dinatriumsalt af glucose-6-phosphat opløses i 1 ml destilleret vand; foder til 2 dage ved en temperatur på 4 ° С.
3. NADP-løsning 10 M: 8 mg NADP opløses i 1 ml destilleret vand; foder til 10 dage ved temperatur 4 ° C.
4. Saponin vandig opløsning 1 % foder til 20 dage ved temperatur 4 ° C.
5. Oxideret glutathionopløsning (10 ml): 2,4 mg glutathion opløses i 1 ml destilleret vand; foder til 10 dage ved en temperatur på 4 ° С.

Metode.

Forbered inkubationsblandingen før bestemmelse., blanding 1 ingen. glucose-6-phosphatopløsning, 1 ingen. løsning NAD-F, 2 ingen. saponinopløsning, 5 ingen. buffer og 1 ingen. glutathion-opløsning. Blod (0,01 ml) sættes i reagensglas eller celler på hæmagglutinationskortet og tilsættes 0,2 ml inkubationsblanding. Igennem 15 min med en mikropipette tage en dråbe af inkubationsblandingen (0,02 ml) fra hver prøve og læg dem på kromatografisk papir i form af en plet med en diameter på 10-12 mm. Pletter lufttørres ved stuetemperatur og ses under UV-lys for at vurdere fluorescens. Prøver med kendt normalt blod anvendes som kontroller.. Reagenskvalitetskontrol indeholder ikke blod.

Evaluering af resultaterne.

Mangel på fluorescens svarer til inaktivitet, tilstedeværelse af fluorescens (intens blå glød) - tilstedeværelsen af ​​aktivitet, og en svag glød - en mellemreaktion. Med forbehold for de eksperimentelle betingelser giver metoden ikke falske negative resultater.. Kilden til en falsk positiv diagnose kan være svær anæmi hos individet, men i meget mindre grad, end for Berstein-metoden. Selv med svær anæmi er der en mellemreaktion, ikke mangel på fluorescens.

Anvendelsen af ​​en kvantitativ metode til bestemmelse af aktiviteten af ​​G-6-PD gør det muligt at detektere et fald i aktivitet ikke kun hos hemizygote og homozygote patienter, men også hos heterozygote kvinder. Fordi, at reticulocytantal og farveindeks påvirker niveauet af enzymaktivitet, Det anbefales at justere resultaterne på baggrund af disse indikatorer.