Estudi citoquímic de l'ejaculat

Reaccions citoquímiques, els èâkulâtom, permet jutjar sobre la composició química i la seva activitat funcional de les cèl·lules.

Определение активности кислой фосфатазы эякулята

Активность кислой фосфатазы в эякуляте во много раз превышает ее активность в крови. Кислая фосфатаза входит в состав секрета предстательной железы, продукция ее стимулируется мужскими гонадотропными гормонами. С помощью цитохимических реакций она выявляется в сперматозоидах и других клетках эякулята. Активность ее определяется методом Гольдберга — Барка.

Reactius.

1. Формалиновый спирт (одну часть готового 40 % формалина растворяют в девяти частях 96% alcohol etílic).

2. Парарозанилин: 1 г основного фуксина для фук- синосернистой кислоты растворяют при подогревании в 25 ml 2 н соляной кислоты; refredat, фильтруют и хранят в холодильнике. Реактив стойкий.

3. Водный раствор нитрата натрия 4 %. 4. Раствор метилового зеленого на ацетатном буфере 2 % (PH- 5). Полученный раствор промывают хлороформом, для чего смешивают приблизительно равные количества хлороформа и 2 % раствора метилового зеленого. Многократно взбалтывают в течение дня, а затем окрасившийся в фиолетовый цвет хлороформ Удаляют с помощью делительной воронки.

5. Инкубационная среда, состоящая из двух компонентов.

• А-компонент: 20 мг нафтол-А5-фосфата растворяют в 0,5 (0,3) мл диметилформамида, afegir 40 ml 0,1 н раствора ацетата натрия и фильтруют через бумажный фильтр; готовят в день исследования.
• Б-компонент: 8 gotes 4 % solució de nitrat de sodi es va barrejar amb 8 каплями парарозанилина; готовят ex tempore. Для получения инкубационной среды оба компонента соединяют (pH 5,2—5,4). При необходимости pH исправляют либо 50 % уксусной кислотой, либо раствором едкой щелочи.

Mètode. Свежий эякулят центрифугируют, при большом количестве сперматозоидов обходятся без центрифугирования. Из осадка готовят шлифованным стеклом тонкие мазки, que, как и мазки крови, высушивают на воздухе. Далее высушенные мазки фиксируют путем погружения их в стаканчик с формалиновым спиртом на 30 de (no més) и промывают дистиллированной водой. Затем мазки погружают в стаканчик с инкубационной средой и помещают в термостат при температуре 37 ° C 2 no. После этого их ополаскивают в дистиллированной воде, погружают на 10 мин в стаканчик с раствором метилового зеленого (для докрашивания ядер), быстро смывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и исследуют с помощью иммерсионной системы микроскопа.

Активность кислой фосфатазы можно выразить с помощью среднего цитохимического коэффициента (СЦК) per полуколичественному методу Астальди—Верга. Согласно формуле

СЦК=(3*а+2*б+1*в)/100

где цифры в числителе указывают на интенсивность окраски (максимальная — 3, умеренная — 2, следы — 1), а буквы — на процентное содержание сосчитанных клеток определенной интенсивности окраски; цифра 100 в знаменателе — общее количество сосчитанных клеток.

Per Exemple, сосчитано 100 cèl·lula, из них с максимальной интенсивностью окраски 20 cèl·lula, с умеренной — 20 и со следами — 60 cèl·lula. Отсюда:

СЦК=(3*20+2*20+1*60)/100=1,6

В сперматозоидах кислая фосфатаза располагается в виде единичных крупных гранул красно-оранжевого цвета в верхнем отделе головки.

Занятая хроматином часть головки окрашена в зеленый цвет и не содержит кислой фосфатазы.

Более бледная диффузная окраска на кислую фосфатазу выявляется вокруг нижней части головки, а иногда распространяется и на шейку сперматозоида. Средний цитохимический коэффициент кислой фосфатазы сперматозоидов в нормальном эякуляте составляет 2,0—2,4.

В цитоплазме клеток сперматогенеза обнаруживаются скопления гранул, ярко окрашивающихся в специфический (красно-оранжевый) color. В поддерживающих клетках извитых семенных канальцев, часто резко положительно окрашенных на кислую фосфатазу, просвечиваются неокрашенные головки (хроматин) esperma. Гистиоциты и макрофаги содержат немногочисленные гранулы, положительно окрашенные на кислую фосфатазу. В единичных лимфоцитах, а иногда и в нейтрофильных гранулоцитах встречаются отдельные гранулы, обладающие активностью кислой фосфатазы.

Определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в эякуляте

Сукцинатдегидрогеназа - Enzims, участвующий в окислительно-восстановительных реакциях, содержится в клетках эякулята в значительном количестве. Однако характер изменения ее активности при различных патологических процессах еще недостаточно хорошо изучен. Активность сукцинатдегидрогеназы в клетках определяется модифицированным методом Нарциссова.

Reactius.

1. Ацетон-трилон (ацетон — 60 ml, дистиллированная вода — 40 ml, трилон Б — 250 mg).

2. Раствор метилового зеленого 2 % (тот же краситель, который используется для кислой фосфатазы).

3. Инкубационная среда, состоящая из следующих компонентов:

i) фосфатного буфера (pH 7,2—7,4) - 10 ml;

a) 5,4 % раствора сукцината натрия – 10 ml;

en) трилона Б (13 мг разводят в 5 ml d'aigua destil·lada);

g) воды дистиллированной — 5 ml;

d) нитротетразолия фиолетового (10 мг разводят в 10 ml d'aigua).

Все компоненты смешивают в одном флаконе и хранят в холодильнике. Готовая среда может использоваться многократно — в течение 10 dies o més.

Mètode. Мазки, приготовленные из эякулята, фиксируют в ацетон-трилоне в течение 30 de, промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Затем мазки погружают в инкубационную среду и помещают в термостат при температуре 37 ° C 1 no, после чего их промывают дистиллированной водой и докрашивают метиловым зеленым в течение 10 m. Далее снова быстро промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и исследуют с помощью иммерсионной системы микроскопа.

Нормальные сперматозоиды обладают высокой активностью сукцинатдегидрогеназы, представленной крупными сине-фиолетовыми гранулами, que, сливаясь между собой, образуют плотную массу, заполняющую шейку сперматозоида, у некоторых сперматозоидов отдельные гранулы встречаются и вокруг головки.

Подсчитать слившиеся друг с другом гранулы не представляется возможным, поэтому для определения активности сукцинатдегидрогеназы окрашенную часть сперматозоидов измеряют в микрометрах. По длине специфически окрашенной на сукцинатдегидрогеназу части сперматозоида судят о степени активности фермента в этом сперматозоиде. С помощью окуляр-микрометра и объект-микрометра измеряется длина специфически окрашенной части в 100 сперматозоидах. Сложив длину окрашенных участков в подсчитанных сперматозоидах и разделив полученную цифру на 100, получают среднюю длину, выражающую сукцинатдегидрогеназную активность для одного сперматозоида. В норме она составляет 4,3±0,7 мкм. Такой подсчет активности СДГ наиболее информативен и поэтому рекомендуется для использования в научных целях.

Для широкого применения в практике этот метод довольно сложен, предпочтительнее выражать количество сукцинатдегидрогеназы по методу Астальди—Верга. Средний цитохимический коэффициент СДГ сперматозоидов в нормальном эякуляте составляет 2,7 ±0,3.

В клетках сперматогенеза активность СДГ выявляется в виде скоплений крупных сине-фиолетовых гранул, часто сливающихся в крупные глыбки, располагающиеся в различных участках цитоплазмы. Средний цитохимический коэффициент в клетках сперматогенеза не достигает 2,0. По мере созревания клеток эякулята активность СДГ нарастает и в зрелых сперматозоидах превышает 2,0. В цитоплазме отдельных лимфоцитов обнаруживаются крупные гранулы СДГ.

Определение активности пероксидазы в эякуляте

В сперматозоидах, клетках сперматогенеза и поддерживающих клетках извитых семенных канальцев пероксидаза отсутствует.

В нейтрофильных гранулоцитах эякулята активность пероксидазы выражена в значительной степени и может изменяться в зависимости от характера патологического процесса, так же как и в периферической крови. Уровень активности пероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах важен для оценки их функционального состояния и активности воспалительного процесса в мужских половых органах. Окраска мазков эякулята по Грэму—Кноллю и учет активности фермента по Астальди—Вергу проводятся аналогично мазкам крови.

Активность пероксидазы в клетках эякулята определяется по методу Грэма—Кнолля.

Reactius.

1. Формалиновый спирт (mateix, что и для кислой фосфатазы).

2. Пероксидазный реактив: ʙenzidin (на кончике скальпеля) dissolt en 6 ml 96 % alcohol etílic, afegir 4 ml d'aigua destil·lada 0,02 ml 3 % peròxid d'hidrogen. Реактив годен к употреблению в течение 5—6 дней.

3. Краситель Романовского в разведении 1—2 капли на 1 ml d'aigua destil·lada.

Mètode. Свежие мазки эякулята фиксируют в течение 30 с формалиновым спиртом, промывают проточной водой и высушивают. Затем мазки заливают пероксидазным реактивом на 5—7 мин, тщательно промывают в проточной воде и высушивают. После этого их докрашивают 15— 20 мин красителем Романовского, промывают проточной водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа.

При положительной реакции на пероксидазу в нейтрофильных гранулоцитах обнаруживаются крупные золотисто-коричневые гранулы в значительном количестве. При большом количестве лейкоцитов необходимо подсчитывать средний цитохимический коэффициент (СЦК). В цитоплазме отдельных гистиоцитов пероксидаза содержится в виде небольших скоплений таких же гранул.

Определение гликогена в эякуляте

Изменения содержания гликогена в различных клетках отражаются на их функции или свидетельствуют о развитии патологического процесса. Определение гликогена в клетках проводится методом Мак-Мануса.

Reactius.

1. Водный раствор йодной кислоты 1 % (готовится перед употреблением).

2. Сернистая вода: 5 ml 10 % метабисульфита калия или натрия, 5 ml 1 н соляной кислоты, вода до 100 ml (готовится перед употреблением).

3. Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина для фуксиносернистой кислоты, предварительно растертого в фарфоровой ступке, растворяют при постоянном встряхивании в течение 5 мин в 200 мл кипящей дистиллированной воды, пропускают через бумажный фильтр и добавляют при охлаждении до 50 ° C 20 ml 1 н соляной кислоты, а при охлаждении до 25 °С — 1 г метабисульфита калия или натрия. Приготовленный реактив выдерживают в холодильнике в течение 24 ч после чего он просветляется и стано вится пригодным для употребления

4.Водный раствор метилового зеленого 2 %, промытый хлороформом

5.Химически чистый метиловый спирт.

Mètode.

Тонкие высушенные мазки эякулята фиксируют химически чистым метиловым спиртом в течение 3 m, ополаскивают дистиллированной водой и опускают в стаканчик с 1 % водным раствором йодной кислоты на 5 m. Затем мазки промывают дистиллированной водой, высушивают, ополаскивают в сернистой воде и снова высушивают.

Далее опускают мазки в стаканчик с реактивом Шиффа на 15 m, ополаскивают их в трех порциях сернистой воды (per 3 мин в каждой), промывают 10 мин в воде и докрашивают ядра клеток 3 мин метиловым зеленым. После этого снова ополаскивают мазки водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с помощью иммерсионной системы микроскопа.

В зрелых сперматозоидах гликоген отсутствует. В цитоплазме молодых сперматозоидов, особенно с «воротничком», выявляются следы гликогена (±), de vegades en forma de grànuls individuals en la part superior del cap o en el "collaret".

В клетках сперматогенеза El glucogen es troba en grans quantitats en la forma d'una grànuls vermell cirera, omple tot el citoplasma. Amb la maduració de les cèl·lules perdre glicogen fins a la seva desaparició en espermatozoides madurs. Spermatocitы glicogen conté no només en el citoplasma, sinó també en el nucli. En les cèl·lules de sosteniment dels túbuls seminífers contornejats, el glucogen és una grànuls i difús vermell cirera. Granulòcits neutròfils madurs a l'ejaculació, així com en frotis de sang perifèrica, contenir una quantitat significativa de glucogen. A la prostatitis crònica en els granulòcits neutròfils ejaculat augmenta significativament la quantitat de glucogen i augmenta l'activitat de la peroxidasa. En els limfòcits aïllats de vegades es troben en grànuls normals de glucogen.

Els macròfags contenir traces de glucogen Antecedents frotis de semen tenyides de color vermell cirera, que indica la presència en el plasma de les grans quantitats d'ejaculat glicosaminoglicans (mukopolisaxaridov).

Определение рибонуклеиновой кислоты (ARN) в эякуляте

Повышенное содержание РНК в клетках свидетельствует о высокой активности их в отношении роста, секреторной, синтетической и другой деятельности. Снижение содержания РНК в молодых клетках часто сопряжено с пониженной способностью этих клеток к регенерации. Содержание РНК в клетках определяется методом Курника.

Reactius.

1. Реактив Курника: готовят отдельно 2 % растворы метилового зеленого и пиронина, раствор метилового зеленого тщательно промывают хлороформом; рабочий раствор красителя приготавливают путем смешивания 2 % раствора пиронина (12,5 ml) i 2 % раствора метилового зеленого (7,5 ml) с добавлением 30 ml d'aigua destil·lada. Краситель стойкий, хранится в холодильнике.

2. Фиксатор — химически чистый метиловый спирт.

Mètode. Мазки фиксируют метиловым спиртом в течение 3 m, окрашивают рабочим раствором пиронин-метилового зеленого 15 m, быстро ополаскивают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа. РНК окрашивается пиронином в ярко-красный цвет, ядра клеток — метиловым зеленым в зеленый.

Зрелые сперматозоиды не содержат РНК. Клетки сперматогенеза богаты РНК, количество которой убывает в клетках по мере их созревания. У сперматогоний цитоплазма насыщенно-розового цвета, у сперматоцитов она бледнее, i у сперматид бледно-розовая. У юных сперматозоидов с «воротничком» в розовый цвет окрашивается преимущественно «воротничок».

Esperma, находящиеся на последней стадии своего развития, в поддерживающих клетках извитых семенных канальцев теряют остатки розовой субстанции (ARN) и превращаются в зрелые сперматозоиды.

В клетках сперматогенеза содержится большое количество гликогена, РНК и значительно выражена активность СДГ и КФ. Però, normalment, эти клетки единичные в эякуляте, поэтому подсчет СЦК нецелесообразен. В таких случаях ограничиваются описательной формой заключения.

Цитохимическая характеристика лейкоцитов является важным показателем их функциональной активности. Учет количества вещества в лейкоцитах эякулята проводится так же, как и в других клетках эякулята и в периферической крови.

В окрашенных обычными методами мазках эякулята (азурозиновыми смесями, гематоксилин-эозином и пр.), а также в нативных препаратах не всегда легко различить лейкоциты, cèl·lules de l'espermatogènesi, эпителий предстательной железы, гистиоциты и другие элементы.

Цитохимические методы в сочетании с морфологическими нередко помогают установить вид клеток. Així, выраженная активность пероксидазы, представленной крупными золотисто-коричневыми гранулами, заполняющими всю цитоплазму клетки, характерна для зрелых нейтрофильных гранулоцитов, у других клеток такая реакция не наблюдается. Reacció greu a glucogen és típic dels neutròfils i les cèl·lules de la espermatogènesi, però aquests no tenen activitat de peroxidasa. ARN continguda en les cèl·lules i l'espermatogènesi no hi ha granulòcits madurs. Les cèl·lules de l'espermatogènesi s'han pronunciat reacció a la fosfatasa àcida, i granulòcits neutròfils, que expressen molt malament, i així successivament. d.