Цитохимични изследване на еякулат

Цитохимични реакция, от èâkulâtom, позволява да се съди за химическия състав и неговата функционална активност на клетки.

Определянето на дейността, кисела фосфатаза на еякулат

Дейността на кисела фосфатаза в еякулата е много пъти по-голяма от дейността му в кръвта. Кисела фосфатаза е част от простатната жлеза, продукти, тя се стимулира от мъжки хормони gonadotropnymi. Използване на cytochemical реакции, тя откри в сперматозоиди и други клетки в еякулата. Неговата дейност се определя метод Голдбърг-Барса.

Реактиви.

1. Формалин алкохол (една част от готовия 40 % формалин, разтворен в девет части 96% етилов алкохол).

2. Pararozanilin: 1 g основни fuchsine за Fuk- sinosernistoj киселина се разтваря при затопляне в 25 мл 2 n солна киселина; охлажда, филтрира и съхраняват в хладилник. Устойчиви Reagent.

3. Воден разтвор на натриев нитрит 4 %. 4. Разтвор на метил зелен acetatnom буфер 2 % (рН - 5). Полученият разтвор измити хлороформ, Защо се смесват приблизително равни количества хлороформ and 2 % разтвор на метил зелено. Събуждам много пъти през деня, и след това okrasivšijsâ в лилаво хлороформ отстранени с помощта на декантационната колба.

5. Инкубация сряда, състояща се от два компонента.

• И компонент: 20 mg-A5-нафтол фосфат, разтворен в 0,5 (0,3) ml диметилформамид, добави 40 мл 0,1 n разтвор на натриев ацетат и се филтрира през филтърна хартия; ежедневни проучвания.
• B-компонент: 8 капки 4 % разтвор на натриев нитрат се смесва с 8 pararozanilina капки; приготвя ex tempore. За да получите и двете компоненти сряда инкубация свържете (рН 5,2-5.4). Ако необходимо рН правилен или 50 % оцетна киселина, или с разтвор на сода алкални.

Метод. Пресен еякулат центрофуга, Когато голям брой сперматозоиди без центрофуга. На утайките варени режа стъкло тънък клевети, че, като петна кръв, изсушен въздух. По-нататъшно сухи петна запис чрез потапяне ги в чаша с алкохол, formalinovym на 30 от (няма повече) и измити с дестилирана вода. Тогава тампона потопена в чаша с инкубационен сряда и постави в термостат при температура 37 °С на 2 не. След това ги изплакнете с дестилирана вода, Потопете 10 мини в купата с разтвор на метил зелено (за dokrašivaniâ ядра), бързо промивната вода, сухи филтърна хартия и да проучи чрез потапяне микроскоп система.

Кисела фосфатаза дейност може да се изрази с помощта на средния citohimičeskogo съотношение (SCK) от polukoličestvennomu метод Astal′di-Verga. Според формулата

SCK =(3*и + 2 * b с + 1 *)/100

където номера в числителя показват интензивността на оцветяване (Максималната - 3, умерено- 2, следи- 1), и писма-процентът на клетки преброили определен интензитет на оцветяване; фигура 100 знаменателят е общият брой на клетки.

Например, разглежда 100 клетка, от тях с максимален интензитет на оцветяване 20 клетка, с умерено- 20 и със следи от — 60 клетка. От тук:

SCK =(3*20+2*20+1*60)/100= 1.6

Сперматозоида в кисела фосфатаза се намира под формата на един голям гранули от червено-оранжево в горния отдел главите.

Взети от Хроматинът на главата е зелена и съдържа не кисела фосфатаза.

По-бледо дифузно оцветяване на кисела фосфатаза е открит около долната част на главата, и понякога се простира до гърлото на spermatozoon. Средният коефициент на cytochemical кисела фосфатаза в нормални сперматозоиди еякулата е 2.0-2.4.

В цитоплазмата на незрели зародишните клетки са открити от натрупването на гранули, ярко okrašivaûŝihsâ в специфични (червено-оранжево) цвят. В подкрепящите клетки на сложен seminiferous каналчета, често драстично оцветени положително за кисела фосфатаза, prosvečivaûtsâ небоядисани глави (xromatin) сперматозоиди. Хистиоцити и макрофаги съдържат няколко гранули, положително оцветени от кисела фосфатаза. В изолирани лимфоцити, и понякога неутрофилите granoulozitah отговарят на индивидуалните гранули, на ядрената дейност на кисела фосфатаза.

Определяне на активност на сукцинат дехидрогеназа (SDG) в еякулата

Sukcinatdegidrogenaza - Enzyme, участва в redox реакции, съдържащи се в клетките на еякулат в значителен брой. Въпреки това естеството на промените му дейност в различни патологични процеси не е все още добре разбира. Дейността на сукцинат дехидрогеназа в клетките се определя от на модифицирания Narcissova метод.

Реактиви.

1. Ацетон-trilon (ацетон 60 мл, дестилирана вода е 40 мл, Етилендиаминтетраоцетова 250 мг).

2. Разтвор на метил зелено 2 % (една и съща боя, която се използва за кисела фосфатаза).

3. Инкубация сряда, състояща се от следните компоненти::

и) фосфатен буфер (рН 7.2-7.4) - 10 мл;

към) 5,4 % разтвор на натриев сукцинат- 10 мл;

аз н) trilona б (13 mg хвърлят в 5 мл дестилирана вода);

ж) дестилирана вода е 5 мл;

д) nitrotetrazoliâ лилаво (10 mg хвърлят в 10 мл вода).

Всички съставки се смесват в една бутилка и се съхранява в хладилника. Завършен сряда може да се използва няколко пъти в рамките на 10 дни или по-.

Метод. Инсулти, направени от еякулат, фиксирани в ацетон-trilone по време 30 от, промита с дестилирана вода и се изсушава на открито. Тогава тампона потопена в инкубационен сряда и постави в термостат при температура 37 °С на 1 не, след това се промиват с дестилирана вода и dokrašivaût метил зелен по време 10 м. Следваща отново бързо се измиват с вода, сухи филтърна хартия и да проучи чрез потапяне микроскоп система.

Нормални сперматозоиди имат висока активност на сукцинат дехидрогеназа, предоставени от големи синьо лилави гранули, че, сливане между, образуват гъста маса, запълване врата сперматозоиди, някои сперматозоиди индивидуалните гранули са намерени около главата.

Изчисляване на сливане с друг пелети не е възможно, Следователно за определяне на активността на сукцинат дехидрогеназа боядисани част от сперматозоидите се измерва в Микрометри. На дължина специфични рисувани върху sukcinatdegidrogenazu част на главата на сперматозоидите е оценявана по степента на активност на ензима в този spermatozoide. Използвайки окуляр микрометър микрометър и измерената дължина специално боядисани части в 100 сперматозоиди. Сгънати дължина оцветяват парцели брои сперматозоида и се раздели на получената фигура от 100, Вземи средната продължителност, изразяване на sukcinatdegidrogenaznuû дейност за един сперматозоиди. Добре е 4.3 ± 0.7 μm. Това преброяване дейност SDG най-информативен и поради това се препоръчва за използване за научни цели.

За широко приложение в практиката този метод е малко по-сложно, За предпочитане е да изразят броя на сукцинат дехидрогеназа в Astal′Di метод-Verga. Средният коефициент на cytochemical SDG сперматозоидите при нормален еякулат 2,7 ± 0,3.

Клетки на сперматогенезата СУКЦИНАТ ДЕХИДРОГЕНАЗА дейност е открита под формата на клъстери на големи синьо лилави гранули, често обединяването в по-големи бучки, разположени в различни части на цитоплазмата. Средният коефициент на cytochemical в клетките на сперматогенезата не достига 2,0. Съзряване на клетките повишава активността и SDG еякулат в зрели сперматозоиди надвишава 2,0. В цитоплазмата на някои лимфоцити открити големи гранули SDG.

Определяне на ПЕРОКСИДАЗНАТА активност в еякулата

В сперматозоиди, клетки на сперматогенезата и подкрепящи клетки на сложен seminiferous каналчета пероксидаза липсва.

В еякулата неутрофилите granoulozitah активността на пероксидазата изразено в силно и може да варира в зависимост от характера на патологичния процес, както и в периферната кръв. Нивото на активността на пероксидазата в неутрофилите granoulozitah е важна за оценка на функционалното състояние и възпалителна активност в мъжките полови органи. Оцветяване на инсулт от Греъм Knollû-еякулат и счетоводна дейност на ензим от Astal′di е подобна на кръвта инсулти проведе Vergu.

Активността на пероксидазата в клетките на еякулат се определя от Метод на Греъм — Knollâ.

Реактиви.

1. Формалин алкохол (същото, Що се отнася до кисела фосфатаза).

2. Peroksidaznyj реактив: ʙenzidin (на върха на скалпела) разтворен в 6 мл 96 % етилов алкохол, добави 4 мл дестилирана вода 0,02 мл 3 % водороден прекис. Реактив е годен за ядене в рамките на 5-6 дни.

3. Боядисване на Romanowski в разплод 1-2 капки на 1 мл дестилирана вода.

Метод. Пресен еякулат инсулти запис по време на 30 с алкохол, formalinovym, се измиват с течаща вода и Химическо. След това Изсипете peroksidaznym реактив инсулти 5-7 мин, измити обилно на течаща вода и сухо нагоре. След тяхната 15-dokrašivaût 20 мин боядисване Romanowski, се измиват с течаща вода, сушени and mikroskopiruût, чрез потапяне микроскоп система.

С положителна реакция на пероксидаза в неутрофилите granoulozitah открити големи златисто кафяв гранули в значителен брой. Когато голям брой на клетките, които искате да преброите средният коефициент на cytochemical (SCK). В цитоплазмата на хистиоцити съдържат пероксидаза, изолират в малки групи от един и същи пелети.

Определяне на гликоген в еякулата

Промени в съдържанието на гликоген в различни клетки засяга тяхната функция или свидетелстват за развитието на патологичния процес. Определяне на гликоген в клетките се извършва Мак Манус метод.

Реактиви.

1. Воден разтвор на йод киселини 1 % (подготовка за използването).

2. Сярната вода: 5 мл 10 % metabisulfita калиев или натриев, 5 мл 1 n солна киселина, вода към 100 мл (подготовка за използването).

3. Реактив на Шиф: 1 g основни fuchsine за fuksinosernistoj киселина, предварително удряха в порцеланово хаванче, разтваря се с постоянно разклащане по време 5 мин. в 200 ml вряща дестилирана вода, преминават през филтърна хартия и се добавят охлаждане 50 ° С 20 мл 1 n солна киселина, и когато охлаждане надолу до 25 ° C е 1 g като metabisulfita калиев или натриев. Реактив на готови стоя в хладилника за 24 h, след което той пояснява и Stano семейства, годни за консумация от човека

4.Воден разтвор на метил зелено 2 %, измити хлороформ

5.Химически чисти метилов алкохол.

Метод.

Тънки сухи петна еякулат прикрепвам химически чиста metilovam алкохол по време на 3 м, изплакване с дестилирана вода и потопени в чаша с 1 % воден разтвор на йод киселини на 5 м. След това петна се измиват с дестилирана вода, сушени, изплакнете в сярната вода и изсушена отново.

По-надолу инсулти в стъкло с реактива на Шиф в 15 м, Ги изплакнете в три порции от сярната вода (от 3 мин. всеки), мият се 10 мин във вода и dokrašivaût ядра 3 м метил зелено. После opolascerve вода инсулти, сухи филтърна хартия и mikroskopiruût чрез потапяне микроскоп система.

В зрели сперматозоиди гликоген липсва. В цитоплазмата на младите сперматозоиди, особено с "яка", открити следи от гликоген (±), Понякога под формата на индивидуалните гранули в горната част на главата или на яката".

Клетки на сперматогенезата Гликогенът се намира в големи количества под формата на гранули от череша червено, пренесат всички цитоплазмата. Като съзряването на клетки губят си гликогена до неговото изчезване в зрели сперматозоиди. Spermatotsity съдържа гликоген не само в цитоплазмата, но в ядрото. В клетки на поддържащите сложен seminiferous каналчета гликоген е поставен като череша червени гранули и дифузионно. Зрели неутрофилите гранулоцит в еякулата, както и в периферната кръв петна, съдържат значителни количества от гликоген. Ако хроничен простатит в неутрофилите granoulozitah еякулат е значително повишена гликоген и ПЕРОКСИДАЗНАТА активност. В изолирани лимфоцити обикновено понякога гликоген гранули.

Макрофаги съдържа следи от гликоген фон клевети еякулат завои черешово червено, Това предполага голямо количество еякулат плазма глюкозаминогликани (mukopolisaxaridov).

Определяне на рибонуклеинова киселина (RNA) в еякулата

Повишени нива на РНК в клетките доказателства за висока активност на растежа, секреторните, синтетични и други дейности. Намаляване на РНК в младите клетки, често свързани с намалява способността на тези клетки да регенерират. Съдържанието на РНК в клетките се определя от Kurnika метод.

Реактиви.

1. Kurnika реактив: Пригответе отделно 2 % разтвори на метил зелени и pironina, разтвор на метил зелено, старателно измити с хлороформ; работа боя разтвора, приготвен чрез смесване на 2 % разтвор pironina (12,5 мл) и 2 % разтвор на метил зелено (7,5 мл) с добавянето на 30 мл дестилирана вода. Устойчив на петна, съхраняват в хладилник.

2. Хонорар е химически чиста метилов алкохол.

Метод. Прикрепвам инсулти metilovam алкохол по време на 3 м, боя работен разтвор на pironin-метил зелено 15 м, бързо opolascerve вода и филтърната хартия. Mikroskopiruût чрез потапяне микроскоп система. РНК се превръща пиронин в ярко червен цвят, ядрата-метил зелен в зелен.

Зрели сперматозоиди не съдържат РНК. Клетки на сперматогенезата са богати на РНК, сумата на която намалява в клетките като им узряване. От spermatogony цитоплазмата богати розов цвят, от spermatocitov Тя е Блед, и Направете spermatids бледо розов. Младите имат сперматозоиди "яка" Розово рисува предимно "яка".

Сперма, са в последните етапи на неговото развитие, в подкрепа на сложен seminiferous каналчета клетки губят розов остатък вещество (RNA) и растат в зрели сперматозоиди.

Незрели зародишни клетки съдържат големи количества от гликоген, РНК и много дейност, изразена и KF SDG. Но, обикновено, Тези единични клетки в еякулата, така преброяване SCK дизайн. В такива случаи се ограничава до разказна форма на сключване.

Cytochemical характеристики на левкоцити един важен индикатор за тяхната функционална активност. Броят на веществата в левкоцитите еякулат точно както, както и в други клетки и периферна кръв в еякулата.

В конвенционални клевети оцветени еякулат (azurozinovymi смеси, хематоксилин-еозин и др.), както се и в родния лекарства не винаги са лесно да се направи разграничение между левкоцити, клетки на сперматогенезата, на епитела на простатата, хистиоцити и други елементи.

Cytochemical методи във връзка с морфологичните често съдейства за установяване вида на клетки. Така, изразени като активността на пероксидазата, предоставена от големи гранули от златисто кафяв, попълване на всички цитоплазмата на клетката, характеристика на зрели неутрофилен гранулоцити, този отговор не се среща с други клетки. Изразен реагиране на гликоген е типична за неутрофилен гранулоцити и клетки на сперматогенезата, но последните не са активността на пероксидазата. РНК се съдържа в клетките на сперматогенезата и отсъства в зрял granoulozitah. Клетки на сперматогенезата имат изразен реагиране към кисела фосфатаза, и в неутрофилите granoulozitah то изразява много слабо и така. д.