Пароксизмальная ночная гемоглобинурия — Болезнь Маркиафавы—Микели

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия — сравнительно редко встречающаяся приобретенная форма гемолитической анемии, связанная с изменением структуры эритроцитов, нейтрофильных гранулоцитов и тромбоцитов. Протекает с признаками внутрисосудистого гемолиза, при котором наблюдаются гемоглобинурия, гемосидеринурия, повышение уровня свободного гемоглобина плазмы. Заболевание нередко осложняется тромбозом периферических вен и сосудов внутренних органов.

Этиология и патогенез пароксизмальной ночной гемоглобинурии

Первое описание заболевания было дано в 1882 г. Более подробно оно было описано в 1928 г.

Общераспространенное название заболевания — пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ), однако оно мало соответствует сути заболевания, так как при нем нет настоящих пароксизмов и не всегда наблюдается гемоглобинурия.

Внутрисосудистый гемолиз с гемосидеринурией кроме ПНГ наблюдается и при многих формах аутоиммунной гемолитической анемии как с тепловыми, так и с холодовыми антителами, особенно при формах с тепловыми гемолизинами, а также при некоторых формах наследственной гемолитической анемии, связанной с нарушением структуры мембраны эритроцита.

Болезнь Маркиафавы—Микели наблюдается в разном возрасте. Причиной повышенного разрушения эритроцитов является дефект самих эритроцитов.

Эритроциты больных ПНГ, как указывалось выше, легко разрушаются комплементом при создании оптимальных условий для его действия, либо при подкислении сыворотки, либо при увеличении концентрации комплемента вокруг эритроцита за счет создания низкой концентрации ионов в сахарозной среде. Эритроциты больных ПНГ имеют повышенную чувствительность к воздействию антител как агглютининов, так и, особенно, гемолизинов.

При ПНГ поражаются не только эритроциты, но и лейкоциты и тромбоциты больного. Тромбоциты и лейкоциты больных ПНГ обладают повышенной чувствительностью к воздействию комплемента как при подкислении сыворотки, так и в среде с сахарозой низкой ионной силы. Они во много раз чувствительнее к действию изоагглютининов, чем донорские тромбоциты и лейкоциты. Таким образом, тромбоциты и лейкоциты имеют тот же Дефект мембраны, что и эритроциты.

Обнаружить иммуноглобулины на поверхности эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов и тем самым доказать принадлежность ПНГ к группе аутоагрессивных заболеваний не удается самыми чувствительными методами.

Имеются убедительные доказательства наличия при ПНГ двух самостоятельных популяций эритроцитов. Наиболее стойкие у здорового человека клетки — ретикулоциты оказываются при ПНГ наиболее хрупкими. Это свидетельствует о том, что патологическая популяция эритроцитов просто не доживает до созревания, а более старые созревшие эритроциты относятся к здоровой или почти здоровой популяции.

В 1970 при исследовании эритроцитов мулатки, страдающей ПНГ, обнаружилось, что они содержат, как и у здоровых мулаток, два нормальных электрофоретических варианта Г-6-ФД; вариант А, распространенный среди населения Африки, и вариант В, свойственный населению Европы. После проведения гемолиза оказалось, что патологические эритроциты содержат лишь один вариант Г-6-ФД, а нормальные эритроциты — оба электрофоретических варианта Г-6-ФД. Следовательно, гемолизированные эритроциты произошли от одной клетки.

Этот факт с большой достоверностью свидетельствует о наличии двух популяций эритроцитов, отличающихся не только функционально, как, например, при микросфероцитозе, но и по происхождению: другими словами, он подтверждает наличие патологического клона клеток, т. е. соматической мутации. Идентичность поражения мембраны эритроцитов, нейтрофилов и тромбоцитов говорит о том, что патологическую информацию скорее всего получает клетка, следующая за стволовой, т. е. клетка-предшественник миелопоэза. Бластомный рост для ПНГ не характерен. Описаны лишь единичные случаи развития быстрого лейкоза на фоне ПНГ. Тем не менее, можно предположить, что ПНГ — это вариант доброкачественной опухоли системы крови, длительное время не дающей опухолевой пролиферации, характерной для других форм лейкоза.

Механизм развития комплементчувствительности при ПНГ пока неясен.

Существенные изменения активности ферментов гликолиза и пентозно-фосфатного цикла отсутствуют.

При ПНГ снижается активность ацетилхолинэстеразы эритроцитов, скорее всего вследствие нарушения структуры мембраны эритроцитов, так как фермент располагается на поверхности мембраны и легко нарушается при ее поражении. Известно, что применение ингибиторов ацетилхолинэстеразы не оказывает действия на выживаемость эритроцитов. Однако снижение активности ацетилхолинэстеразы наблюдается и при других формах гемолитической анемии, поэтому не может служить объяснением феномена повышенной комплементчувстви- тельности.

Имеются данные, свидетельствующие об увеличении количества непредельных жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов, мембраны эритроцитов. Не исключена возможность, что изменения в липидах — это лишь отражение каких-либо других изменений в структуре мембраны эритроцитов. При исследовании белка мембраны эритроцитов больных ПНГ методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия установлено, что в ряде фракций содержание белка существенно отличалось от контроля.

Главная роль в патогенезе тромботических осложнений при ПНГ отводится внутрисосудистому распаду эритроцитов и стимуляции свертывания факторами, освобождающимися из эритроцитов во время их распада. При ПНГ разрушаются в основном ретикулоциты, может быть, этим и следует объяснять частоту тромботических осложнений при этом заболевании в отличие от других форм гемолитических анемий, сопровождающихся выраженным внутрисосудистым гемолизом.

Клинические проявления пароксизмальной ночной гемоглобинурии

Заболевание чаще всего начинается исподволь. Больные жалуются на слабость, недомогание, головокружение. Иногда отмечается субиктеричность склер. Нередко первыми являются жалобы на головную боль, боль в животе различной локализации. Склонность к повышенному тромбообразованию заставляет больного обратиться к врачу. Гемоглобинурия довольно редко является первым симптомом заболевания и у некоторых больных ПНГ может вообще отсутствовать. В ряде случаев она появляется впервые через 2—3 года и даже через 10 лет после начала заболевания.

Один из характерных признаков ПНГ — приступы боли в животе. Локализация ее может быть самой различной. Вне периода криза боль в животе, как правило, не наблюдается. Нередко к ней присоединяется рвота. Вероятнее всего, боль в животе у больных ПНГ связана с тромбозом брыжеечных сосудов.

Тромбоз периферических сосудов (чаще всего — вен верхних и нижних конечностей, реже — сосудов почек) также характерный симптом пароксизмальной ночной гемоглобинурии. У 12 % больных ПНГ наблюдается тромбофлебит. Тромботические осложнения являются наиболее частой причиной смерти при данном заболевании.

При объективном исследовании больного чаще всего обращает на себя внимание бледность с небольшим желтушным оттенком. Нередко наблюдается одутловатость лица, иногда излишняя полнота. Возможно небольшое увеличение селезенки и печени, хотя это не характерно для ПНГ.

Для пароксизмальной ночной гемоглобинурии характерны признаки внутрисосудистого гемолиза, наиболее важный из которых — повышение свободного гемоглобина плазмы. Этот признак периодически отмечается почти у всех больных ПНГ. Однако степень повышения свободного гемоглобина плазмы варьирует и зависит от того, в какой период заболевания проводилось исследование. В период криза этот показатель значительно возрастает, отмечается также увеличение количества метальбумина плазмы.

Уровень свободного гемоглобина плазмы зависит от степени гемолиза в данный момент, содержания гаптоглобина, степени фильтрации гемоглобина с мочой и от скорости разрушения комплекса гемоглобин — гаптоглобин. В случае небольшой степени гемолиза уровень свободного гемоглобина плазмы будет недостаточным для фильтрации его через почечный фильтр. Поэтому гемоглобинурия не является обязательным симптомом болезни. При прохождении через канальцы нефронов выделяемый гемоглобин частично разрушается и откладывается в эпителии канальцев. Это является причиной выделения с мочой гемосидерина.

Гемосидерин выделяется с мочой у подавляющего большинства больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией. Иногда гемосидеринурия появляется не сразу. Это важный, но не специфичный для ПНГ признак заболевания.

Лабораторные показатели при пароксизмальной ночной гемоглобинурии

Содержание гемоглобина у больных ПНГ колеблется от 1,86— 3,1 ммоль/л (30—50 г/л) и даже более низкого до нормального в период ремиссий.

Количество эритроцитов у больных ПНГ уменьшается соответственно уровню снижения гемоглобина. Цветовой показатель длительный период остается близким к единице. В тех случаях, если больной теряет значительное количество железа с мочой в виде гемосидерина и гемоглобина, уровень железа постепенно снижается. Низкий цветовой показатель наблюдается примерно у половины больных. У некоторых из них повышен уровень гемоглобина P, особенно в период обострения.

У значительной части больных содержание ретикулоцитов повышенное, но сравнительно невысокое (2— 4 %). Количество лейкоцитов при ПНГ в большинстве случаев снижено. У многих больных оно составляет 1,5—3 Г в 1 л, но иногда снижается до 0,7—0,8 Г в 1 л. Лейкопения, как правило, наблюдается за счет уменьшения количества нейтрофильных гранулоцитов. Иногда содержание лейкоцитов при ПНГ нормальное или повышенное — до 10—11 Г в 1 л.

При ПНГ снижается фагоцитарная активность нейтрофильных гранулоцитов.

Тромбоцитопения также часто наблюдается при ПНГ, однако функциональное состояние тромбоцитов при этом нормальное. Вероятно, этим объясняется редкость геморрагических осложнений при данном заболевании, хотя количество тромбоцитов иногда снижается в значительной степени — до 10—20 Г в 1 л. Обычно у большинства больных содержание тромбоцитов 50—100 Г в 1 л. Нормальное количество тромбоцитов не исключает диагноза пароксизмальной ночной гемоглобинурии.

При исследовании костного мозга обнаруживаются симптомы, в основном характерные для гемолитической анемии — раздражение красного ростка кроветворения при нормальном количестве миелокариоцитов. У ряда больных имеет место небольшое снижение количества мегакариоцитов.

Уровень железа сыворотки при ПНГ зависит от стадии заболевания, степени внутрисосудистого гемолиза и активности кроветворения. В тех случаях, если у больных отмечается постоянная или частая гемоглобинурия, а также постоянная гемосидеринурия, содержание железа в организме, а следовательно, и в сыворотке крови снижается, порой очень значительно. Иногда ПНГ начинается с признаков гипоплазии. Запасы железа в организме больного ПНГ зависят, с одной стороны, от потери железа с мочой, а с другой от интенсивности эритропоэза. Поэтому нельзя считать дефицит железа диагностическим признаком пароксизмальной ночной гемоглобинурии.

Уровень билирубина сыворотки при ПНГ в большинстве случаев нерезко повышенный или нормальный, главным образом за счет непрямого. В среднем содержание билирубина составляет 22—28 мкмоль/л. Следует учитывать, что при внутрисосудистом распаде гемоглобина образуется гемоглобин-гаптоглобиновый комплекс, который а в конечном итоге также распадается с образованием билирубина.

У части больных ПНГ заболевание начинается с картины апластической анемии.

Диагностика пароксизмальной ночной гемоглобинурии

При пароксизмальной ночной гемоглобинурии нарушается структура оболочки эритроцитов, что проявляется в повышенной чувствительности ее к воздействию комплемента. Такая повышенная чувствительность выявляется с помощью либо пробы Хема, либо более чувствительной сахарозной пробы. Однако в ряде случаев, прежде всего при гемолизиновой форме аутоиммунной гемолитической анемии, сахарозная проба может давать ложноположительный результат. Гемолизины фиксируются на поверхности собственных эритроцитов и в присутствии комплемента в сахарозной среде разрушают их, тогда как для ПНГ характерно разрушение клеток комплементом без воздействия на них антител.

Для исключения гемолизиновой формы аутоиммунной гемолитической анемии рекомендуется исследование гемолизинов описанным выше методом и с использованием перекрестной сахарозной пробы с сывороткой больного и эритроцитами одногруппного донора, а не наоборот, как это принято. При ПНГ прямая проба положительна, а перекрестная — отрицательна. При гемолизиновой форме АИГА может наблюдаться как положительная, так и отрицательная перекрестная проба. В этих случаях целесообразно применение третьего варианта сахарозной пробы — с использованием как сыворотки, так и эритроцитов больного. Степень гемолиза в этом варианте минимальная при ПНГ и максимальная при гемолизиновой форме АИГА. Объяснить такой результат можно лишь высокой специфичностью антител сыворотки больного гемолизиновой формой аутоиммунной гемолитической анемии к антигену, имеющемуся в большем количестве в эритроцитах больного, чем в эритроцитах донора. Прямая положительная сахарозная проба у этих больных связана, вероятно, с наличием на эритроцитах фиксированных антител.

Выявление гемолизинов методом агрегатгемагглютинации и другими помогает поставить правильный диагноз. Нельзя использовать в качестве донорской сыворотку больных, так как в случае содержания в ней гемолизина результат может оказаться ложноположительным. Отрицательный результат может иметь место, если в качестве источника комплемента используется сыворотка самого больного ПНГ или сыворотка больного циррозом печени, ревматоидным полиартритом, системной красной волчанкой и другими заболеваниями, при которых снижается уровень комплемента. Сахарозная проба и проба Хема становятся менее выраженными, если при взятии крови больного в качестве антикоагулянта используется гепарин, а не цитрат натрия. После гемолитического криза интенсивность пробы Хема и сахарозной пробы снижается, но при этом они не становятся отрицательными.

Определение свободного гемоглобина плазмы крови методом Бинга в модификации Дервиза и Бялко при пароксизмальной ночной гемоглобинурии

Метод основан на способности гемоглобина вступать в реакцию с бензидином в кислой среде в присутствии перекиси водорода с образованием зеленой окраски, переходящей сначала в синюю, а затем в красновато-фиолетовую. Интенсивность окраски пропорциональна количеству гемоглобина.

Реактивы.

  1. Ацетатный буфер 0,1 М, рН 4,6: 27,22 г ацетата натрия растворяют в 1 л воды (0,2 М раствор); в другой мерной колбе готовят 1 л 0,2 М раствора уксуснокислой кислоты; смешивают 480 мл раствора № 1 и 520 мл раствора № 2.
  2. Перекись водорода 0,3 % раствор (готовят перед употреблением путем разведения пергидроля в 100 раз).
  3. Бензидин солянокислый 0,1 % раствор: 50 мг солянокислого бензидина растворяют в 35—40 мл ацетатного буфера, нагревают раствор до 80 °С на водяной бане и после охлаждения доводят ацетатным буфером до 50 мл.

Фильтруют в темную склянку и хранят при комнатной температуре не более 7 дней. Пожелтевший реактив непригоден, при быстром потемнении его необходимо перекристаллизовать бензидин из спирта.

Методика.

Кровь для исследования берут из вены сухой иглой в силиконированную пробирку, содержащую любой антикоагулянт. Кровь с антикоагулянтом центрифугируют не более 10 мин при 1500 об/мин. После отделения плазмы ее вновь центрифугируют в течение 10 мин при 8000 об/мин для осаждения лейкоцитов.

В пробирку наливают 4 мл ацетатного буфера, 2 мл перекиси водорода, 2 мл бензидина и 0,04 мл испытуемой сыворотки крови смешивают и оставляют стоять 3 мин, затем переливают в кювету с длиной оптического пути 1 см и фотометрируют против компенсационного раствора при зеленом светофильтре. Интенсивность голубой окраски нарастает в течение 4—5 мин, поэтому измерение повторяют 3—5 раз подряд и регистрируют максимальные показания. Спустя 5—6 мин окраска сыворотки приобретает лилово-бурый оттенок, и величина оптической плотности начинает снижаться. Из двух выявленных максимальных результатов оптической плотности берется средний.

Компенсационный раствор, состоящий из 6 мл ацетатного буфера, 8 мл перекиси водорода, 3 мл раствора бензидина и 0,06 мл изотонического раствора хлорида натрия, готовят одновременно с пробой.

Калибровочную кривую выводят по раствору гемоглобина. В крови, взятой для приготовления раствора гемоглобина, измеряют его содержание (на медицинском колориметре или медицинском рефрактометре). Готовят раствор гемоглобина с концентрацией 1 г/л, из него приготавливают растворы меньшей концентрации: 0,005,0,025, 0,05, 0,1 и 0,2 г/л. Из каждого полученного раствора добавляют 0,04 мл к смеси 4 мл ацетатного буфера, 2 мл раствора бензидина и 2 мл перекиси водорода.

Основной раствор гемолизата (1 г/л) для калибровочной кривой должен храниться на холоде, а рабочие растворы более низкой концентрации следует готовить сразу перед исследованием.

В норме в 1 л плазмы крови содержится 0,0005 ммоль/л (0,01—0,04 г) гемоглобина.

Определение гемосидерина мочи при пароксизмальной ночной гемоглобинурии

При распаде гемоглобина железо его адсорбируется эпителием почечных канальцев и входит в состав гемосидерина. Слущенные клетки эпителии почечных канальцев в этих случаях содержат зерна гемосидерина.

При внимательном исследовании осадка мочи после центрифугирования зерна гемосидерина видны и без специальной окраски. Однако более четко они выделяются при окраске по методу Перлса.

Методика.

После центрифугирования мочи верхний ее слой отсасывают, к осадку добавляют свежеприготовленный раствор 1 % желтой кровяной соли и 1 % раствор соляной кислоты (смешивают равные объемы 2 % раствора соляной кислоты и желтой кровяной соли). Спустя 10 мин после перемешивания смесь центрифугируют и осадок просматривают. Зерна гемосидерина окрашиваются в синий цвет.

Определение метгемальбумина плазмы спектрофотометрическим методом

Реактивы.

  1. Фосфатный изоосмотический буфер (pH 7,4): смешивают 18 мл 0.15 М раствора дигидрофосфата натрия (24,4 г ЫаН2Р04 на 1 л воды) и 82 мл 0,15 М раствора гидрофосфата натрия (21,3 г NaH2PO4 на 1 л воды).
  2. Гидросульфит натрия.
  3. Раствор едкого натра 1 М.
  4. Раствор сывороточного альбумина человека (40 г/л).
  5. Раствор гемина (5 мг/100 мл); готовится сразу путем растворения гемина в малом количестве едкого натра, а затем: доведением его до необходимого объема раствором сывороточного альбумина.

Методика.

К 2 мл сыворотки или плазмы крови добавляют 1 мл забуферерного изоосмотического раствора, pH 7,4. Смесь центрифугируют 30 мин при 1200—1500 об/мин. Определяют оптическую плотность при 569 нм. Затем разведенную плазму помещают в пробирку и туда добавляют примерно 5 мг сухого гидросульфата натрия. Через 5 мин повторно измеряют оптическую плотность при той же длине волны. Разница между двумя величинами оптической плотности соответствует оптической плотности метгемальбумина. Концентрацию метгемальбумина определяют по калибровочному графику.

Калибровочный график выводят следующим образом. Раствор гемина с альбумином переносят в пробирки в количестве от 0,01 до 0,1 г/л (от 0,2 до 2 мл). В те пробирки, где количество раствора менее 2 мл, добавляют до 2 мл раствор альбумина. Затем добавляют по 1 мл фосфатного изоосмотического буфера. Смесь центрифугируют при 1500 об/мин, а затем измеряют оптическую плотность. Разница между измерениями наносится на график соответственно количеству гемина.

В норме гемальбумин в плазме крови отсутствует. Он появляется в случае внутрисосудистого гемолиза, например, при пароксизмальной ночной гемоглобинурии или гемолизиновой форме аутоиммунной гемолитической анемии, а также в случае отсутствия гаптоглобина, когда гем связывается с альбумином.

Проба Хема при пароксизмальной ночной гемоглобинурии

Проба Хема основана на понижении стойкости эритроцитов больных ПНГ к снижению pH среды в присутствии комплемента свежей сыворотки.

Реактивы.

  1. Раствор соляной кислоты 0,2 н.
  2. Раствор аммиака 0,04 %.

Методика.

Из вены берут 5— 6 мл крови. В качестве антикоагулянта применяют оксалат или цитрат натрия. Одновременно берут 15—20 мл крови у донора той же группы. Отделяют эритроциты от плазмы в крови больного и донора.

Сыворотку крови донора разливают по 0,5 мл в шесть пробирок, две из них помещают на 20 мин в водяную баню с температурой 56 °С для инактивации комплемента сыворотки, остальные четыре пробирки оставляют при комнатной температуре. Эритроциты больного дважды промывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем суспензируют в таком же растворе в соотношении 1:1.

Схема исследования представлена в таблице.

Приготовление инкубационной смеси для исследования чувствительности эритроцитов к комплементу в пробе Хема

Ингредиент, мл

Номер пробирки

Опыт

Контроль

1

2

3

4

5

6

Сыворотка крови здорового человека 0,5 0,5 0 0,5 0,5 0
Инактивированная сыворотка крови 0 0 0,5 0 0 0,5
Раствор соляной кислоты 0,2 н. 0 0,05 0,05 0 0,05 0,05
Суспензия эритроцитов больного 50% 0,05 0,05 0 0 0 0
Суспензия эритроцитов донора 50 % 0 0 0 0,05 0,05 0,05

Содержимое каждой пробирки перемешивают, помещают на 1 ч в термостат при температуре 37 °С, а затем центрифугируют.

Для холостой пробы по 0,05 м эритроцитов больного и донора добавляют отдельно к 0,55 мл изотонического раствора хлорида натрия.

После центрифугирования степень гемолиза можно оценить на глаз. Для количественной оценки степени гемолиза в каждую пробирку к 4,7 мл 0,04 % раствора аммиака добавляют 0,3 мл поверхностного слоя, а в пробирку с холостой пробой — 0,3 мл исходной сыворотки крови.

Для выявления 100 % гемолиза к 4,7 мл раствора аммиака добавляют 0,3 мл суспензии эритроцитов (0,05 мл эритроцитов больного в 0,55 мл изотонического раствора хлорида натрия).

Оптическую плотность раствора измеряют на медицинском колориметре и сравнивают показания с оптической плотностью раствора аммиака без эритроцитов:

% гемолиза=((E1-E2)/E3)*100;

где E1 — оптическая плотность исследуемой пробы; E2— оптическая плотность холостой пробы; E3— оптическая плотность 100 % гемолизата.

В норме гемолизируется не более 5 % эритроцитов.

Проба Хема считается положительной в том случае, если гемолизируется более 6 % эритроцитов.

При пароксизмальной ночной гемоглобинурии и гемолизиновой форме аутоиммунной гемолитической анемии гемолизируется иногда до 50—80 % эритроцитов. Для этих заболеваний характерен гемолиз лишь в присутствии неинактивированной сыворотки крови (пробирка № 2). Если инактивация сыворотки не предотвращает гемолиз (пробирка № 3), можно предположить наличие другой формы гемолитической анемии или ошибку в постановке исследования.

Для разрушения эритроцитов больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией при pH среды 6,5 требуется обязательное присутствие комплемента, содержащегося в свежей сыворотке крови.

Сахарозная проба при пароксизмальной ночной гемоглобинурии

Сахарозная проба основана на том, что эритроциты больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией и гемолизиновой формой аутоиммунной гемолитической анемии разрушаются в растворах с низкой ионной силой в присутствии комплемента.

Реактивы.

  1. Раствор сахарозы: 9,42 сахарозы растворяют в 0,005 М фосфатном буфере; pH 6,2 (91 мл 0,005 М NaH2PO4 и 9 мл 0,005 М Na2HPO4).
  2. Реактив для определения концентрации гемоглобина: 200 мг красной кровяной соли растворяют в 1 л дистиллированной воды, туда же добавляют 0,5 мл ацетонциангидрина.

Методика.

Кровь у больного берут из вены в две пробирки — сухую (8—10 мл) и с антикоагулянтом (2— 3 мл). В качестве антикоагулянта используют цитрат натрия. Эритроциты из пробирки с антикоагулянтом дважды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия. После отмывания и отсасывания надосадочной жидкости к 0,4 мл эритроцитов добавляют 0,25 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Одновременно берут кровь у донора той же группы крови в две пробирки — с антикоагулянтом (2—3 мл), ее обрабатывают так же, как кровь больного, и в сухую (8— 10 мл) для получения сыворотки. После отделения донорской сыворотки 0,5 мл ее помещают в водяную баню при температуре 56 °С на 30 мин для инактивации комплемента. Сыворотку крови донора следует брать в день опыта и сохранять на холоде. Схема исследования приведена в таблице.

Схема постановки сахарной пробы

Ингредиент, мл

Номер пробирки

1

2

3

4

5

6

7

8

Раствор сахарозы 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8
Взвесь эритроцитов больного 0,1   0,1 0,1 0,1 0,1
Взвесь эритроцитов донора 0,1 0,1 0,1 0,1
Сыворотка крови донора 0,1 0,1
Сыворотка крови донора инактивированная 0,1
Сыворотка крови больного 0,1 0,1 0,1
Дистиллированная вода             0,8 0,8
Изотонический раствор хлорида натрия         0,1      

Пробирки помещают в термостат на 30 мин при температуре 37 °С, а затем центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 2000 об/мин и оценивают степень гемолиза.

Для этого в пробирки наливают по 3,4 мл реактива для определения концентрации гемоглобина и 0,6 мл над- осадочного слоя из каждой пробирки. Через 10 мин измеряют оптическую плотность раствора в пробирках при 540 нм на медицинском рефрактометре (спектрофотометре) или медицинском колориметре (фотоколориметре ФЭК-М) при зеленом светофильтре, сравнивая полученные данные с оптической плотностью раствора для определения гемоглобина. Берется среднее из двух показаний каждого опыта. Расчет производится по формуле:

% гемолиза в пробирке=((E1-E5)/(E8-E5))*100

где E1 — оптическая плотность раствора в пробирке № 1; E5 — оптическая плотность раствора в пробирке № 5, необходимая для исключения окраски самой сыворотки; E8 — оптическая плотность раствора в пробирке № 8, где произошел 100%-й гемолиз.

Для перекрестной сахарозной пробы (пробирка № 2) 100%-й гемолиз исследуется в пробирке № 7.

Оценка результатов.

В норме в пробирке № 1, содержащей эритроциты исследуемого больного, гемолиз не превышает 2—3 %.

При пароксизмальной ночной гемоглобинурии и гемолизиновой форме аутоиммунной гемолитической анемии (АИГА) в этой пробирке гемолиз превышает 6 % В контрольных пробирках — № 4, содержащей эритроциты больного и инактивированную сыворотку крови донора, пробирке № 5, содержащей эритроциты и сыворотку крови донора, и № 6, содержащей вместо сыворотки изотонический раствор хлорида натрия — гемолиз не должен превышать 1—2 %.

Перекрестная сахарозная проба (пробирка № 2) при гемолизиновой форме АИГА обычно положительная (при наличии гемолизинов в сыворотке крови), но она может быть и отрицательной. В пробирке № 3 (эритроциты и сыворотка крови больного) гемолиз наблюдается как при ПНГ, так и при гемолизиновой форме АИГА. При пароксизмальной ночной гемоглобинурии максимальный гемолиз обнаруживается в обычной сахарозной пробе (пробирка № 1), менее выраженный — в пробе с собственными эритроцитами больного (пробирка № 3); отсутствует гемолиз в перекрестной сахарозной пробе (пробирка № 2).

При гемолизиновой форме АИГА наиболее выраженный гемолиз выявляется в пробе с собственными сывороткой крови и эритроцитами больного (пробирка № 3), несколько менее выраженный — в пробирке № 1. В пробирке № 2 гемолиз отмечается часто, но отсутствие его не исключает гемолизиновую форму АИГА.