Диагностика иммунологически обусловленного бесплодия

В процессе длительной супружеской жизни без применения противозачаточных средств, а также при наличии микроповреждений в области слизистых оболочек половых органов может происходить постепенная местная иммунизация антигенами сперматозоидов. При обычном обследовании супругов, состоящих в бесплодном браке, не удается установить причину бесплодия в 10—15 % случаев. Именно в этой группе бесплодных супругов при применении специальных методов обследования в секрете канала шейки матки, плазме эякулята и сыворотке крови часто выявляются антиспермальные антитела (АСАТ), Используются качественные и количественные тесты иммунологического исследования.

Посткоитальный тест (ПКТ)

Посткоитальный тест (ПКТ) относится к качественным иммунологическим тестам. Отрицательный результат теста свидетельствует об отсутствии сперматозоидов в секрете канала шейки матки, но не позволяет определить причину их отсутствия.

Методика. По количеству подвижных сперматозоидов в секрете канала шейки матки, полученном после коитуса, устанавливают степень нарушения их проникающей способности при бесплодии или невосприимчивости к ним слизи канала шейки матки.

Для проведения ПКТ необходимо соблюдение следующих условий: исследование должно проводиться в периоде овуляции, который выявляется кольпоцитологическим или другим методом, после предшествовавшего полового воздержания супругов в течение 2—3 дней.

Методика проведения. После обычного коитуса женщина в течение 30 мин должна лежать на спине, согнув ноги в коленях. Спринцевание и подмывание запрещаются, необходима только гигиеническая прокладка, которая удаляется при взятии для исследования слизи канала шейки матки. Через 2—4 ч, допустимо и через 6—10 ч (время, прошедшее до момента исследования, указывается в анализе) после коитуса шейка матки обнажается с помощью зеркала Куско и эндоцервикальная слизь аспирируется либо туберкулиновым шприцем (без иглы), либо пипеткой с резиновой грушей, либо полиэтиленовым катетером.

При мытье инструментов не следует применять дезинфицирующие средства, так как они влияют на подвижность сперматозоидов. Одну каплю полученной слизи канала шейки матки переносят на подогретое предметное стекло, покрывают покровным, края которого смазывают жидким парафином для герметичности. Готовый препарат сразу же микроскопируют (окуляр 7Х, объектив 40Х), определяя количество сперматозоидов и характер их подвижности. В препарате могут обнаруживаться сперматозоиды с активной поступательной подвижностью, качательными движениями (феномен качания) и неподвижные.

Принято выделять пять типов заключений ПКТ.

  • Отличный (соответствующий норме): в пяти полях зрения до 15—20 сперматозоидов с активной поступательной подвижностью и более. Сперматозоиды с феноменом качания составляют менее 25 %.
  • Удовлетворительный: в пяти полях зрения до 10 сперматозоидов с активной поступательной подвижностью и менее 25 % сперматозоидов с феноменом качания.
  • Плохой: менее 5 сперматозоидов в пяти полях зрения.
  • Отрицательный: отсутствие сперматозоидов.
  • Сомнительный: в пяти полях зрения более 5 активно-подвижных сперматозоидов и более 25 % с феноменом качания.

При пятом типе ПКТ часто наблюдается иммунная несовместимость супругов, поэтому необходимо определение АСАТ. Для выявления АСАТ в секрете канала шейки матки, плазме эякулята или в сыворотке крови и индикации их (агглютинирующие или иммобилизующие) требуется назначение количественных иммунологических тестов.

При отрицательном ПКТ исследования начинают с определения пенетрирующей (проникающей) способности сперматозоидов с помощью пенетрационного теста (ПТ) и восприимчивости к сперматозоидам секрета канала шейки матки с помощью теста контакта спермы и цервикальной слизи (ТКСЦС).

Пенетрационный тест (ТП)

В тонкий капилляр длиной 10 см в период овуляции набирается слизь канала шейки матки. Один свободный конец капилляра закрывается пластилином, а второй помещается в пробирку с исследуемым свежим эякулятом (не более 3 ч после эякуляции). С помощью пластилина капилляр в вертикальном положении прикрепляется к пробирке. Проба инкубируется в термостате при температуре 37 °С в течение 1 ч. О качестве эякулята судят по глубине проникновения сперматозоидов в слизь канала шейки матки. Различают три вида ПГ.

  • Положительный — глубина пенетрации (наибольшее расстояние в сантиметрах, пройденное хотя бы единичными сперматозоидами) свыше 5 см; число сперматозоидов в точке максимальной пенетрации более 5 в поле зрения, а число подвижных сперматозоидов в верхней трети капилляра превышает 50 %.
  • Сомнительный — на глубине пенетрации до 5 см число сперматозоидов менее 5, подвижность их в верхней трети капилляра не достигает 50%.
  • Отрицательный — глубина пенетрации сперматозоидов не достигает 1 см.

Способность сперматозоидов к пенетрации зависит от фазы менструального цикла. Она начинает проявляться с 9-го дня менструального цикла и, постепенно активизируясь, достигает максимальной выраженности в периоде овуляции, удерживается на этом уровне в течение двух дней, а затем постепенно снижается.

Тест контакта спермы и цервикальной слизи (ТКСЦС)

На предметное стекло наносится небольшая капля слизи из канала шейки матки, взятой у женщины во время овуляции, и рядом такая же по размеру капля эякулята. Обе капли накрываются покровным стеклом, которое слегка придавливается для того, чтобы капли соединились. Препарат помещается во влажную камеру (чашку Петри с увлажненным ватным валиком) и инкубируется в термостате при температуре 37 °С в течение 1 ч.

В этих условиях нормальные сперматозоиды пенетрируют в нормальный секрет канала шейки матки, что хорошо видно под микроскопом при увеличении 200X. Для учета реакции возле границы двух сред подсчитывается число проникших в секрет канала шейки матки сперматозоидов в двух расположенных рядом полях зрения.

Тест контакта спермы и цервикальной слизи (ТКСЦС)

При отличном ТКСЦС в двух полях зрения обнаруживается более 25 активно подвижных сперматозоидов при феномене качания менее 25 %. При удовлетворительном ТКСЦС в двух полях зрения выявляется более 15 активно подвижных сперматозоидов, при плохом ТКСЦС — менее 15. При отрицательном ТКСЦС пенетрация отсутствует, при сомнительном — феномен качания превышает 25 %.

При этом тесте, как и в ПКТ, феномен качания, превышающий 25 %, вероятнее всего, свидетельствует о наличии АСАТ и требует назначения количественных иммунологических тестов.

Использование эякулята и секрета канала шейки матки бесплодных и фертильных людей в различных соотношениях позволяет с помощью ТКСЦС выявить бесплодного супруга.

  • Пример 1. Взят секрет канала шейки матки у женщины из бесплодной супружеской пары и контрольный эякулят здорового мужчины. Отличный ТКСЦС свидетельствует о слабой проникающей способности сперматозоидов мужа и нормальной восприимчивости секрета канала шейки матки.
  • Пример 2. Взят полноценный секрет канала шейки матки здоровой женщины и эякулят мужа из бесплодной супружеской пары. Плохой ТКСЦС указывает на слабую пенетрацию сперматозоидов.
  • Пример 3. Взят секрет канала шейки матки женщины из бесплодной супружеской пары и контрольный эякулят здорового мужчины. Плохой ТКСЦС указывает на неполноценность секрета канала шейки матки, в который не проникают заведомо нормальные сперматозоиды.

Количественные иммунологические тесты

Микроагглютинационный тест Фриберга

Микроагглютинационный тест Фриберга (ТФ) достаточно чувствителен и доступен для клинико-диагностических лабораторий. С помощью ТФ можно определить наличие и титр агглютинационных АСАТ в различном материале (плазме эякулята, экстрактах слизи канала шейки матки и в сыворотке крови обоих супругов).

Реактивы:

1. Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) 0,01 М pH 7,2—7,4.

2. Вазелиновое масло.

Оборудование: микроскоп, туберкулиновый шприц, микроагглютинационные пипетки емкостью 1 мл, микропипетка емкостью 0,1 мл.

Методика. Исследуемая сыворотка крови инактивируется путем инкубации в термостате при 56 °С в течение 30 мин. Эякулят, полученный путем мастурбации, сразу же разводят ФСБ таким образом, чтобы концентрация сперматозоидов составляла 40 млн. в 1 мл.

Из исследуемого материала (плазмы эякулята, экстракта секрета канала шейки матки или сыворотки крови) готовится ряд разведений от 1:4 до 1:128 с использованием в качестве жидкости для разведения ФСБ. В лунки с вазелиновым маслом микроагглютинационных планшеток туберкулиновым шприцем с иглой вносится (под вазелиновое масло) по маленькой капле каждого разведения исследуемого материала. После каждого образца шприц четырехкратно промывается. В каждое разведение добавляется в 5 раз меньшая капля эякулята, и через 4 ч при комнатной температуре выявляются агглютинаты. Последнее разведение, при котором под микроскопом при увеличении 100Х обнаруживаются 3 агглютината в поле зрения и более, соответствует титру агглютинирующих АСАТ.

Спермоиммобилизующий тест Изоджима (СИТ).

Титр иммобилизующих АСАТ в сыворотке крови, плазме эякулята или экстракте секрета канала шейки матки устанавливается по числу подвижных сперматозоидов в присутствии антигенов (сперматозоидов).

Компоненты.

1. Эякулят, который получают и подготавливают так же, как для ТФ с использованием ФСБ; подвижность сперматозоидов должна превышать 70 %.

2. Комплементсодержащая сыворотка крови морских свинок.

3. Иммунная человеческая сыворотка (ИЧС), дающая в присутствии комплемента через 1 ч инкубации иммобилизацию 90 % сперматозоидов.

4. Нормальная человеческая сыворотка (НЧС), инактивированная путем прогревания при температуре 56 °С в течение 30 мин.

5. Исследуемые инактивированные сыворотка крови, плазма эякулята и экстракт секрета канала шейки матки.

Методика. Для оценки иммобилизующей активности комплемента в 1-ю пробирку вносится 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия, для определения изменения подвижности сперматозоидов без АСАТ во 2-ю пробирку — 0,5 мл НЧС, для контроля иммобилизации в 3-ю пробирку — 0,5 мл ИЧС и для определения иммобилизующих АСАТ в 4-ю пробирку — 0,5 мл исследуемой сыворотки, или плазмы эякулята, или экстракта секрета канала шейки матки.

Затем в каждую пробирку вносится по 0,1 мл комплемента. В последнюю очередь во все пробирки добавляется по 0,05 мл суспензии сперматозоидов в концентрации 40 млн. в 1 мл. Штатив с пробирками помещается в термостат при температуре 37 °С на 1 ч. Затем пробирки извлекаются из термостата и осторожно встряхиваются с целью учета осевших агглютинированных сперматозоидов.

Для оценки результатов под большим увеличением микроскопа (400X) подсчитывается процент подвижных сперматозоидов в капле из опытной пробирки, нанесенной на предметное стекло и накрытой покровным. Таким же образом устанавливается процент подвижных сперматозоидов в каплях из контрольных пробирок с НЧС и ИЧС. Результат реакции учитывают по формуле

СИТ=К/О

где К — число подвижных сперматозоидов в контролях с ИЧС и НЧС;

О — число подвижных сперматозоидов в опытной пробирке (исследуемые сыворотки, или плазма эякулята, или секрет канала шейки матки).

При показателе СИТ<2 тест считается отрицательным (число подвижных сперматозоидов в контрольных и в опытной пробирках приблизительно одинаковое), если показатель СИТ>2 — тест положительный, т. е. в исследуемом материале (сыворотке крови, плазме эякулята или в экстракте секрета канала шейки матки) имеются иммобилизующие АСАТ.

  • Пример 1. Первый контроль с ИЧС — 10 % подвижных сперматозоидов. Второй контроль с НЧС — 80% подвижных сперматозоидов. В двух контролях вместе — 90 % подвижных сперматозоидов. В опытной пробирке — 80 % подвижных сперматозоидов.

СИТ=К/О=90/80=1,1

Тест отрицательный, иммобилизующие АСАТ отсутствуют.

  • Пример 2. В опытной пробирке — 40 % подвижных сперматозоидов, в контрольных то же, что в примере 1.

СИТ=90/40=2,2

Тест положительный. Имеются иммобилизующие антитела (АСАТ), благодаря которым подвижность сперматозоидов значительно снижена.