Анемия, связанная с дефицитом фолиевой кислоты

Независимо от причин дефицита фолиевой кислоты анемия характеризуется появлением в костном мозге мегалобластов, внутрикостномозговым разрушением эритрокариоцитов, пацитопенией, макроцитозом и гиперхромией эритроцитов и иногда — психическими расстройствами.

Фолиевая (птероилглутаминовая) кислота (витамин B9) состоит из трех компонентов:

  • птеридинового кольца;
  • парааминобензойной кислоты (вместе составляют птероиевую кислоту);
  • глутаминовой кислоты.

Молекулярная масса фолиевой кислоты — 441. Фолиевая кислота активна в виде производных тетрагидрофолиевой кислоты. Содержание фолиевой кислоты в различных формах в организме человека составляет 5—10 мг. Запасы при нарушении поступления ее в организм могут истощиться за 4 месяца.

Суточная потребность в фолиевой кислоте составляет 100—200 мкг, при беременности, гемолитической анемии она увеличивается во много раз.

Общее количество фолиевой кислоты в пище при полноценном питании составляет 500—600 мкг в сутки. Соли фолиевой кислоты — фолаты в значительном количестве содержатся в печени, дрожжах, шпинате, мясе. Более 50 % фолиевой кислоты, содержащейся в пищевых продуктах, может разрушаться при их кулинарной обработке.

Фолиевая кислота всасывается в верхнем отделе тонкой кишки. Способность кишок всасывать фолиевую кислоту намного превышает ее суточную потребность.

Фолиевая кислота принимает участие в синтезе пиримидиновых и пуриновых оснований, а вместе с метилкобаламином — в синтезе тимидинм нофосфата из уридинмонофосфата. Коферменты фолиевой кислоты участвуют еще в ряде реакций. В частности, тетрагидрофолат принимает участие в синтезе глутаминовой кислоты из гистидина.

Этиология и патогенез анемии при дефиците фолиевой кислоты

Дефицит фолиевой кислоты, так же как и дефицит кобаламинов, приводит к развитию мегалобластной анемии.

Нарушение всасывания фолиевой кислоты наблюдается у лиц, перенесших резекцию части тонкой кишки, особенно тощей кишки, а также у длительно принимавших противосудорожные препараты типа дифенилгидантоина (дифенина) и фенобарбитала (люминала). Всасывание фолиевой кислоты нарушается при спру и целиакии. Дефицит фолиевой кислоты, так же как и дефицит кобаламинов, наблюдается при синдроме слепой петли. Описаны редкие случаи наследственного нарушения транспорта фолиевой кислоты через стенку кишок и в спинномозговую жидкость. Всасывание других веществ при этом не страдает.

Дефицит фолиевой кислоты у новорожденных наблюдается при недоношенности, нарушении кишечного всасывания, вскармливании козьим молоком, содержащим малое количество фолиевой кислоты.

Значительное нарушение всасывания фолиевой кислоты может наблюдаться у лиц, страдающих алкоголизмом.

Повышенное расходование фолиевой кислоты при беременности может приводить к дефициту фолиевой кислоты, однако в высокоразвитых странах в настоящее время это наблюдается редко. Дефицит фолиевой кислоты у беременных встречается при плохом питании, наличии гемолитической анемии, употреблении до беременности большого количества алкогольных напитков.

Клинические проявления дефицита фолиевой кислоты

Дефицит фолиевой кислоты встречается у детей и молодых женщин. При этом больные жалуются на общую слабость, головокружение. В отличие от дефицита кобаламинов боль в языке наблюдается редко. Парастезии и другие признаки фуникулярного миелоза отсутствуют. Склеры чаще всего иктеричны.

В отличие от дефицита кобаламинов при дефиците фолиевой кислоты редко наблюдаются гистаминоупорная ахилия, атрофический гастрит, хотя понижение желудочной секреции бывает часто.

Для дефицита фолиевой кислоты, так же как для дефицита кобаламинов, характерны появление в периферической крови макроцитоза, мегалоцитов и мегалобластов, наличие гиперхромной анемии, снижение количества ретикулоцитов, тромбоцитов и лейкопения с нейтрофильным сдвигом влево и вправо. В костном мозге — мегалобласты.

Изменения в нервной системе отличаются от проявлений при B12-дефицитной анемии.

Доказано, что у лиц страдающих эпилепсией, дефицит фолиевой кислоты приводит к учащению приступов, к их большей тяжести. Это особенно важно в связи с тем, что прием противосудорожных препаратов может вызвать нарушение всасывания фолиевой кислоты. По данным литературы, у лиц с шизофренией дефицит фолиевой кислоты обусловливает обострение заболевания, более тяжелые клинические проявления и меньшую эффективность лечения.

Дифференциальная диагностика дефицита кобаламинов и фолиевой кислоты

Для дифференциальной диагностики дефицита кобаламинов и фолиевой кислоты применяется радиоиммунологический метод определения содержания фолиевой кислоты в сыворотке крови и особенно в эритроцитах. Содержание кобаламинов определяется микробиологическим методом. В качестве тест-микроорганизм а используются Streptococcus faecalis и Lactobacillis casei. В норме содержание фолиевой кислоты в сыворотке крови колеблется, по данным авторов, использующих различные методы исследования, от 3 до 25 нг/мл, а в эритроцитах — от 100 до 425 нг/мл.

При дефиците фолиевой кислоты уровень ее снижается как в сыворотке крови, так и в эритроцитах. При дефиците колабаминов содержание фолиевой кислоты в сыворотке крови чаще всего повышается, а в эритроцитах иногда может быть сниженным, хотя снижение, как правило, небольшое.

Для диагностики дефицита фолиевой кислоты применяется также метод нагрузки гистидином (15 г), после чего определяется содержание в моче формиминглутаминовой кислоты. В норме основная часть гистидина образует глутаминовую кислоту. С мочой выводится 1—18 мг формиминглутаминовой кислоты. При дефиците фолиевой кислоты в течение 8 ч после введения ее в организм с мочой выделяется от 20 до 1500 мг формиминглутаминовой кислоты. Значительное количество формиминглутаминовой кислоты выводится с мочой после приема гистидина у лиц, получавших метотрексат. При дефиците кобаламинов, циррозе печени выведение с мочой формиминглутаминовой кислоты повышается, одна ко в меньшей степени, чем при дефиците фолиевой кислоты. Нормальный уровень в моче метилмалоновой кислоты при увеличении содержания формиминглутаминовой кислоты после приема гистидина свидетельствует о дефиците фолиевой кислоты, а не кобаламинов.

Помогает дифференцировать этих два состояния и радионуклидное исследование. При дефиците кобаламинов, связанном с нарушением секреции внутреннего фактора, нарушается всасывание меченого цианокобаламина, а при дефиците фолиевой кислоты он всасывается нормально.

При дефиците фолиевой кислоты введение ее в организм приводит к повышению содержания ретикулоцитов, тогда как инъекции цианокобаламина (его производных) оказываются неэффективными. Прием фолиевой кислоты при дефиците метилкобаламина приводит к повышению уровня ретикулоцитов.

Определение индекса сегментации нейтрофилов

Подсчитывают количество нейтрофилов, имеющих 4 сегмента и более (всего 200 клеток). Определяют процентное содержание клеток, имеющих 5 сегментов и более по отношению к количеству клеток, имеющих 4 сегмента. Индекс определяют по формуле:

ИС=(КС (5 и более))/КС(4);

где ИС — индекс сегментации;

КС (5 и более) — количество сегментоядернй нейтрофилов (на 200 клеток), у которых число сегментов равно 5 или более;

КС (4) — количество сегментоядерных нейтрофилов, у которых число сегментов равно 4.

В норме этот индекс колеблется 2,5 до 25 %. В тех случаях, когда он превышает 30 % (колебания 120%), можно говорить о гиперсегментации нейтрофилов. Она наблюдается при дефиците фолиевой кислоты, метилкобаламина, а также при уремии.

Определение содержания метилмалоновой кислоты в моче методом Giordio и Plaud

Реактивы.

1. Ионообменная смола дауэкс-Зx4 (хлоридная форма, 200—400 меш). Смолу промывают пятью объемами дистиллированной воды 3 раза, суспендируют в двух объемах дистиллированной воды и хранят в темной посуде при температуре 4°С.

2. Раствор паранитроанилина 0,075 % готовят путем растворения 37,5 мг реактива в 500 мл 0,2 М раствора соляной кислоты. Хранят в темной посуде, остается стабильным в течение нескольких месяцев при комнатной температуре.

3.Ацетатный буфер (pH 4,3) готовят из 1 М раствора ацетата натрия и 1 М раствора уксусной кислоты.

4.Диазореактив: 4 мл 0,5 % раствора нитрата натрия смешивают с 15 мл раствора паранитроанилина. Смесь помещают в холодильник при температуре 4°С и к охлажденному раствору добавляют 4 мл 0,2 М раствора ацетата натрия. Реактив стабилен при температуре 4 °С в течение суток.

5.Стандартный 0,05 М раствор метилмалоновой кислоты: 295 мг метилмалоновой кислоты растворяют в 50 мл воды.

Методика

Мочу собирают в стеклянную бутылку и до начала исследования замораживают. Для исследования берут порцию мочи (20— 25 мл), оттаивают, центрифугируют, отбирают надосадочный слой и с помощью слабого раствора едкого натра или соляной кислоты доводят pH до 6,5.

Хроматографическую колонку высотой 20 см и диаметром 1 см заполняют смолой дауэкс-Зx4. Слой смолы должен быть в пределах 3 см. Через смолу пропускают 5 мл мочи, промывают ее дистиллированной водой (2 раза по 50 мл со скоростью не более 15 мл в 1 с). Метилмалоновая кислота может быть элюирована из смолы 20 мл 0,1 М раствора соляной кислоты. Далее 2 мл элюата смешивают с 3 мл 1 М ацетатного буфера с pH 4,3 в пробирке с притертой пробкой (15×2см). К смеси добавляют 3 мл холодного диазореактива, при этом рН повышается до 4,0. Смесь подогревают на водяной бане при температуре 94 °С в течение 3 мин и добавляют 2 мл 3 М раствора едкого натра. Затем пробирку удаляют из водяной бани, закрывают пробкой и перемешивают содержимое. Смесь охлаждают при комнатной температуре в течение 10 мин и фотометрируют при 620 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см.

В качестве контроля используется смесь, состоящая из 2 мл 0,1 М раствора соляной кислоты, 3 мл диазореактива и 3 мл ацетатного буфера. Стандартный раствор метилмалоновой кислоты состоит из тех же компонентов и 0,02 мл 0,05 М раствора метилмалоновой кислоты. Оптическая плотность этих растворов измеряется при тех же условиях.

Содержание метилмалоновой кислоты (мг) в единице объема мочи (1 л) определяется по формуле:

 

(Eпробы-Eконтроля)/(Eстандарта-Eконтроля)*A*((1000*T)/M)

 

где Е — оптическая плотность различных проб;

А — количество метилмалоновой кислоты в стандартной пробирке, мл;

1000 — объем мочи, взятой для исследования, мл;

Т — количество соляной кислоты, взятой для элюации, мл;

М — количество элюата, взятого для исследования, мл.

При указанных выше условиях формула может быть упрощена следующим образом:

 

(Eпробы-Eконтроля)/(Eстандарта-Eконтроля)*236

 

В тех случаях, когда количество метилмалоновой кислоты в моче превышает 300 мг/л, следует повторно смешать элюат с ацетатным буфером и диазореактивом, но при этом вместо 2 мл целесообразно взять элюата в 4— 10 раз меньше и довести объем до 2 мл 0,1 М раствором соляной кислоты. При расчете следует учитывать разведение.

В норме за сутки с мочой выводится 0,6—4,7 мг метилмалоновой кислоты. При дефиците кобаламинов суточное выведение метилмалоновой кислоты достигает 294 мг. В норме прием 10 г валина не увеличивает выведения метилмалоновой кислоты, при дефиците кобаламинов выведение метилмалоновой кислоты увеличивается.

Определение метилмалоновой кислоты в моче методом Green

Реактивы.

  1. Эфир.
  2. Этанол.
  3. Раствор соляной кислоты 0,1 М.
  4. Сульфат аммония.
  5. Сильноосновная смола деацидит FF (200 меш, хлоридная форма).
  6. Раствор нитрата натрия 0,5 % (масса/объем).
  7. Раствор паранитроанилина (750 мг растворяют в 1 л 0,2 М раствора соляной кислоты).
  8. Раствор ацетата натрия 0,2 М.
  9. Ацетатный буфер 1 М, рН 4,3: смешивают 1 М раствор ацетата натрия и 1 М раствор уксусной кислоты в соотношении 16,35:33,9.
  10. Водный раствор едкого натра 3 М.

А. Стандартный раствор метилмалоновой кислоты: 100 мг растворяют в 100 мл воды, хранят в холодильнике.

Б. Рабочий стандарт метилмалоновой кислоты: стандартный раствор разводят в 20 раз 0,1 М раствором соляной кислоты (1 мл стандарта и 19 мл соляной кислоты). Это количество метилмалоновой кислоты эквивалентно 100 мг метилмалоновой кислоты в 1 л мочи в условиях опыта.

Для приготовления диазореактива смешивают 4 мл 0,5 % раствора нитрата натрия и 15 мл раствора паранитроанилина. Смесь помещают в ледяную баню и добавляют 4 мл 0,2 М раствора ацетата натрия.

Методика.

Собирают мочу в течение суток, измеряют ее объем и 10 мл подкисляют 1 М раствором серной кислоты до pH 2,0 или несколько ниже. Добавляют сульфат аммония до насыщения. Смесь помещают в делительную воронку и экстрагируют три раза смесью эфира с этанолом в соотношении 3:1. Для предотвращения образования эмульсии экстрагирующая смесь берется в избытке.

Экстракт пропускают через малую хроматографическую колонку (1 — 1,5 см в диаметре), заполненную 5 мл смолы. Колонку промывают 50 мл дистиллированной воды. Метилмалоновую кислоту элюируют 0,1 М раствором соляной кислоты. После элюции отбирают 2 мл элюата, добавляют З мл ацетатного буфера и 3 мл диазореактива.

После смешивания пробирку помещают в водяную баню при температуре 95 °С на 3 мин. Затем добавляют 2 мл 3 М едкого натра и сразу закрывают пробирку пробкой для уменьшения контакта с воздухом. После охлаждения измеряют оптическую плотность при длине волны 620 им. Для холостого опыта вместо элюата используют 2 мл 0,1 М раствора соляной кислоты, а для стандартного раствора — 2 мл рабочего стандарта.